缺氧缺血新生大鼠神经元自噬基因表达节律及调控机制

目的通过新生大鼠缺氧缺血脑损伤后神经元自噬基因和节律基因的表达,探讨缺氧缺血引起神经损伤的新机制。方法将12只Sprague-Dawley大鼠随机分为缺氧缺血组和假手术组,每组6只。采用结扎并切断大鼠右侧颈总动脉并给予低氧处理的方法建立体内缺氧缺血脑损伤模型。Western blot检测两组大鼠大脑皮层和海马组织节律蛋白Clock表达情况。体外培养大鼠神经元细胞,随机分为氧糖剥夺(OGD)组和对照组,OGD组加入无糖无血清DMEM培养基模拟细胞缺血状态,并给予低氧处理建立体外缺氧缺血脑损伤模型。采用Western blot检测两组不同时间点自噬相关蛋白Beclin1和LC3,以及节律基因Clock蛋白表达情况。应用si RNA技术抑制神经元Clock蛋白表达后,检测Beclin1和LC3的表达变化。结果体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达呈现节律性波动;OGD处理后,体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达随着时间的延长逐渐升高,不再呈现节律性波动;与假手术组相比,缺氧缺血引起大鼠皮层和海马组织Clock表达降低(P0.05);体外培养神经元经OGD处理后,Clock表达也较对照组显著降低(P0.05);与阴性对照组相比,抑制神经元节律基因Clock表达后,自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表达均显著下降(P0.05)。结论缺氧缺血引起神经元Beclin1和LC3Ⅱ表达节律紊乱,其机制可能与Clock参与调控Beclin1和LC3Ⅱ的表达有关。     

长链非编码RNA BC088414在神经细胞缺氧缺血损伤中的作用

目的探讨长链非编码RNA BC088414在神经细胞缺氧缺血损伤中的作用。方法将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分为常氧组、氧糖剥夺处理组(OGD组)、小分子RNA常氧组(siRNA组)及siRNA OGD组, n=3。以无葡萄糖无血清DMEM培养液于37℃、1%O2+99% N2/CO2条件下培养细胞6 h,建立缺氧缺血体外模型。采用实时定量PCR法检测BC088414、肾上腺素受体β2(Adrb2)和半胱氨酸蛋白酶6(Casp6) mRNA的表达;利用小分子干扰RNA(siRNA)抑制PC12细胞中BC088414的表达;采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果 OGD组细胞凋亡指数明显高于常氧组(PPPP结论长链非编码RNABC088414可能通过Adrb2和Casp6促进凋亡,加重缺氧缺血引起的神经细胞损伤。     

肠道病毒71型诱导人恶性胶质瘤细胞U251自噬的研究

目的 初步研究肠道病毒71型(EV71)诱导人恶性胶质瘤细胞U251的自噬现象及其对微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达的影响.方法 RPMI 1640培养U251细胞24h后随机分为实验组和对照组,实验组按感染复数(MOI)值为1加入EV71,EV71感染12h后采用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色标志细胞自噬泡,荧光显微镜观察自噬泡的形成.EV71感染24 h后细胞免疫荧光检测LC3,荧光显微镜观察LC3在U251细胞内的分布.EV71感染2、4、8、12、24、48 h采用Western blot检测LC3-I和LC3-Ⅱ蛋白的表达,并对LC3-Ⅱ蛋白进行半定量分析.结果 自噬泡经过MDC染色后,荧光显微镜观察发现自噬泡呈点状结构.与对照组比较,实验组在EV71感染12 h,U251细胞内自噬泡明显增多;EV71感染24 h,U251细胞皱缩、变小、形态不规则,LC3蛋白表达明显增多,主要分布在细胞质和细胞核周围;EV71感染4h后,LC3-Ⅱ蛋白表达开始增加,明显高于对照组(P＜0.01).结论 EV71能有效诱导U251细胞自噬,发挥其溶瘤作用.     

Pim1在体外培养大脑皮层神经元氧糖剥夺/复氧损伤中的表达及作用

目的 探讨原代培养大脑皮层神经元缺氧缺血损伤后Pim1的表达及其对细胞凋亡的作用。方法 取新生1日龄C57BL/6小鼠的大脑皮层神经元进行原代培养，培养第8天更换无糖无血清DMEM培养基，于1% O₂条件下培养3 h后，换为正常条件下培养，即氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理，以模拟体内神经元缺氧缺血状态。分别于OGD/R后0、6、12、24 h收集细胞，同时设立神经元正常培养组。原代培养神经元中分别转染Pim1过表达质粒或空质粒，然后分别进行正常培养或OGD/R处理，分别命名为Pim1组、对照组、OGD/R组和OGD/R+Pim1组；采用Real-time PCR检测Pim1 mRNA的表达，采用Western blot检测Pim1蛋白和凋亡相关蛋白活化的半胱氨酸蛋白酶（CC3）的表达。采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果 Real-time PCR和Western blot结果显示，与正常组相比，OGD/R后神经元中Pim1 mRNA及其蛋白表达均显著降低，且均从OGD/R后0 h开始下降，12 h最低，24 h回升但仍维持在较低水平（P < 0.05）。Pim1过表达转染使神经元中Pim1蛋白水平增加。Pim1+OGD/R组CC3表达水平明显低于OGD/R组，Pim1+OGD/R组细胞凋亡率也较OGD/R组显著减少（P < 0.01）。结论 缺氧缺血损伤引起体外培养神经元中Pim1表达下降。过表达的Pim1可以抑制OGD/R诱导的神经元凋亡。     

PINK1基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及自噬的影响

目的 研究PINK1 基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及细胞自噬的影响。方法 将野生型和PINK1 基因敲除型新生小鼠各72 只分为野生型假手术组(SWT)、野生型模型组(MWT)、基因敲除假手术组(SKO)及基因敲除模型组(MKO)。模型组小鼠行右侧颈总动脉结扎后置于低氧舱中(含8%氧气和92% 氮气)2.5 h,假手术组不予结扎和低氧处理。缺氧缺血处理后24 h,采用TTC 染色法检测各组新生小鼠脑梗死程度;采用免疫组化法检测各组脑组织中活化型半胱天冬酶-3(CC3)的表达;采用TUNEL 法检测细胞凋亡;采用免疫荧光法及Western blot 法检测细胞自噬相关蛋白LC3 的表达。结果 MKO 组小鼠脑组织梗死程度较MWT 组小鼠明显减轻(P<0.05);脑组织凋亡阳性细胞数明显减少,凋亡指数降低(P<0.05);凋亡蛋白CC3 表达显著减少(P<0.05)。MKO 组小鼠自噬相关蛋白LC3 表达较MWT 组减少,进一步检测证实自噬指标LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值较MWT 组降低(P<0.05)。结论 敲除PINK1 基因对新生鼠缺血缺氧脑损伤具有神经保护作用。     

缺氧缺血海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达变化以及雷帕霉素对其表达的影响

目的 观察缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠在不同时间点海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1 及LC3 的表达变化,并探讨雷帕霉素对上述蛋白表达的影响。方法 将生后7 d 的108 只Sprague-Dawley 大鼠随机分为假手术组、HIBD 组和雷帕霉素组,每组36 只。采用改良Rice 法建立HIBD 模型;假手术组分离左侧颈总动脉但不予结扎,不行低氧处理;雷帕霉素组在模型制作前1 h 予腹腔注射雷帕霉素(0.5 mg/kg)。各组大鼠分别于模型制作结束后0、6、12、24、48、72 h 时间点麻醉后断头取脑,采用Western blot 法检测大鼠海马组织Beclin-1 及LC3 蛋白表达的变化。结果 HIBD 组Beclin-1 蛋白及雷帕霉素组Beclin-1、LC3- Ⅱ蛋白表达水平均从0 h 起开始升高,24 h 时达到峰值后回落;HIBD 组LC3- Ⅱ蛋白表达水平从0 h 起开始升高,12 h时达到峰值后回落。与假手术组相比,HIBD 组及雷帕霉素组Beclin-1、LC3- Ⅱ蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P<0.05);与HIBD 组相比,除12 h 时LC3- Ⅱ蛋白水平外,雷帕霉素组各时间点Beclin-1、LC3- Ⅱ蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。结论 海马组织细胞经缺氧缺血后出现自噬激活,而雷帕霉素能增强自噬这一表达过程。     

川芎嗪通过PINK1/Parkin通路调控自噬对新生大鼠缺氧缺血性脑病的影响

目的 研究川芎嗪注射液对缺氧缺血性脑病新生大鼠自噬的影响及其分子机制。 方法 将7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组（n=8）、模型组（n=12）、川芎嗪组（n=12）。模型组和川芎嗪组行左侧颈总动脉结扎后再缺氧处理,制备新生大鼠缺氧缺血性脑病模型。假手术组只暴露血管不做其他处理。川芎嗪组在缺氧缺血后每日腹腔注射川芎嗪注射液20 mg/kg,假手术组与模型组每日腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。在治疗7 d后取材,采用苏木精-伊红染色及尼氏染色观察脑组织神经元病理变化情况。采用免疫组织化学染色观察各组新生大鼠大脑海马及皮质区域PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1,PINK1）、Parkin表达。采用TUNEL染色检测神经元凋亡情况。通过免疫印迹法检测PINK1、Parkin、自噬特异性基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）和泛素结合蛋白（Protein 62,P62）的表达。 结果 与假手术组相比,模型组新生大鼠神经元数量减少,细胞间隙增大,排列疏松,胞质空泡化,尼氏小体减少;PINK1、Parkin阳性表达增加,神经元凋亡率升高（均P<0.05）;PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达增加,P62蛋白表达减少（均P<0.05）。与模型组相比,川芎嗪组新生大鼠神经元数量增多,细胞排列整齐,尼氏小体增加;PINK1、Parkin阳性表达减少,神经元凋亡率降低（均P<0.05）;PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达减少,P62蛋白表达增加（均P<0.05）。 结论 川芎嗪在一定程度上缓解了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤,抑制神经元凋亡,其机制可能与抑制PINK1/Parkin介导的自噬相关。     

整合素β8在星形胶质细胞氧糖剥夺后对TGF-β1的活化影响

目的 探讨在氧糖剥夺（OGD）后,星形胶质细胞中整合素β8（β8）的表达对转化生长因子-β1（TGF-β1）活化的影响。方法 体外培养星形胶质细胞,OGD模拟缺氧缺血。免疫细胞化学法检测β8蛋白在星形胶质细胞中的表达及分布,Western blot定量检测OGD处理后复氧12 h、1 d及2 d 时β8蛋白表达的变化。建立星形胶质细胞与荧光素酶报道细胞（TMLC）共培养体系,利用RNA干扰技术抑制星形胶质细胞β8表达,观察β8对TGF-β1活化的影响。结果 β8主要分布于星形胶质细胞的胞浆和树突;星形胶质细胞中β8蛋白表达在复氧后12 h即有增加,1 d时达高峰;星形胶质细胞与TMLC共培养体系在复氧后各时间点TGF-β1活性增高趋势与星形胶质细胞β8表达趋势相似,抑制β8表达后,TGF-β1活性在各时间点均显著降低。结论 新生鼠在缺血缺氧时,星形胶质细胞高表达的β8对中枢神经系统中TGF-β1的活化起重要调控作用。     

小胶质细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用

目的 初步探讨小胶质细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用。方法 建立体外培养大鼠小胶质细胞系氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型,用Western blot法检测OGD/R后0、1、3、6、12及24 h焦亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-l（caspase-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Gasdermin D蛋白N端（GSDMD-N）的表达情况。用慢病毒构建的沉默Gasdermin D（GSDMD）序列转染小胶质细胞,使用免疫荧光和Western blot法检测GSDMD转染效率。将小胶质细胞系分为正常对照组、阴性对照组、LV-sh_GSDMD组（慢病毒沉默GSDMD）,使用CCK-8和LDH试剂盒检测沉默GSDMD对OGD/R后24 h小胶质细胞活性和毒性的影响;通过Western blot法检测沉默GSDMD对OGD/R后24 h小胶质细胞中caspase-1、GSDMD-N、IL-1β含量变化的影响。结果 在OGD/R后0 h起小胶质细胞内焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的表达水平即较OGD/R前发生了上调,并且在24 h达到高峰（P < 0.05）。成功地构建慢病毒沉默GSDMD转染小胶质细胞模型。OGD/R后24 h,与正常对照组相比,沉默GSDMD可提高细胞活性和降低细胞毒性（P < 0.05）,降低小胶质细胞内caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白水平（P < 0.05）。结论 慢病毒沉默细胞焦亡关键底物蛋白GSDMD可减轻缺氧缺血性脑损伤,提示小胶质细胞焦亡加重缺氧缺血性脑损伤。     

小胶质细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用

目的 初步探讨小胶质细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用。方法 建立体外培养大鼠小胶质细胞系氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型,用Western blot法检测OGD/R后0、1、3、6、12及24 h焦亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-l（caspase-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Gasdermin D蛋白N端（GSDMD-N）的表达情况。用慢病毒构建的沉默Gasdermin D（GSDMD）序列转染小胶质细胞,使用免疫荧光和Western blot法检测GSDMD转染效率。将小胶质细胞系分为正常对照组、阴性对照组、LV-sh_GSDMD组（慢病毒沉默GSDMD）,使用CCK-8和LDH试剂盒检测沉默GSDMD对OGD/R后24 h小胶质细胞活性和毒性的影响;通过Western blot法检测沉默GSDMD对OGD/R后24 h小胶质细胞中caspase-1、GSDMD-N、IL-1β含量变化的影响。结果 在OGD/R后0 h起小胶质细胞内焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的表达水平即较OGD/R前发生了上调,并且在24 h达到高峰（P < 0.05）。成功地构建慢病毒沉默GSDMD转染小胶质细胞模型。OGD/R后24 h,与正常对照组相比,沉默GSDMD可提高细胞活性和降低细胞毒性（P < 0.05）,降低小胶质细胞内caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白水平（P < 0.05）。结论 慢病毒沉默细胞焦亡关键底物蛋白GSDMD可减轻缺氧缺血性脑损伤,提示小胶质细胞焦亡加重缺氧缺血性脑损伤。     

Pubertal growth and development and prenatal and lactational exposure to polychlorinated biphenyls and dichlorodiphenyl dichloroethene

OBJECTIVES: Polychlorinated biphenyls (PCBs) and dichlorodiphenyl dichloroethene (DDE) are ubiquitous toxic environmental contaminants. Prenatal and early life exposures affect pubertal events in experimental animals. We studied whether prenatal or lactational exposures to background levels of PCBs or DDE were associated with altered pubertal growth and development in humans.Study design: Follow-up of 594 children from an existing North Carolina cohort whose prenatal and lactational exposures had previously been measured. Height, weight, and stage of pubertal development were assessed through annual mail questionnaires. RESULTS: Height of boys at puberty increased with transplacental exposure to DDE, as did weight adjusted for height; adjusted means for those with the highest exposures (maternal concentration 4+ ppm fat) were 6.3 cm taller and 6.9 kg larger than those with the lowest (0 to 1 ppm). There was no effect on the ages at which pubertal stages were attained. Lactational exposures to DDE had no apparent effects; neither did transplacental or lactational exposure to PCBs. Girls with the highest transplacental PCB exposures were heavier for their heights than other girls by 5.4 kg, but differences were significant only if the analysis was restricted to white girls. CONCLUSIONS: Prenatal exposures at background levels may affect body size at puberty.     

Hypokalemia and Hyperkalemia in Infants and Children: Pathophysiology and Treatment

Potassium is the second most abundant cation in the body. About 98% of potassium is intracellular and that is particularly in the skeletal muscle. Electrical disturbances associated with disorders of potassium homeostasis are a function of both the extracellular and intracellular potassium concentrations. Clinical disorders of potassium homeostasis occur with some regularity, especially in hospitalized patients receiving many medications. This article will review the pathophysiology of potassium homeostasis, symptoms, causes, and treatment of hypo- and hyperkalemia.     

Prevention and treatment of overweight and obesity in children and adolescents

Increasing numbers of obese children and adolescents all over the world demand an investment in the primary and secondary prevention of obesity and overweight in this age group. The goal of preventive measures in children is to avoid the negative short- and long-term health problems associated with obesity. Primary prevention aims at establishing a healthy, active lifestyle and keeping children and adolescents within a range of body weight which is considered to be healthy. Constant availability and affordability of palatable and energy-dense food in the affluent society of the western world demands preventive strategies. Universal or public health prevention seems to be the most suitable form because several other cofactors of morbidity and mortality of affluent societies can also be prevented. However, in most European countries there is a lack of awareness of the necessity of prevention programmes, not only among the general population but also among the medical society. More awareness and consciousness to the problem of obesity must be generated in order to lead to effective therapeutic programmes. For those children and adolescents who are already obese, secondary prevention is mandatory. Therapeutic intervention programmes for the obese aim at long-term weight maintenance and normalisation of body weight and body fat. They have to modify eating and exercise behaviour of the obese child and establish new, healthier behaviour and lifestyle. Treatments programmes must include behavioural components in order to permanently change nutrition and physical exercise of the obese children and adolescents. However, long-term results of treatment programmes in European countries are scarce and the reported results, even of multidisciplinary regimens, are not impressive. Conclusion In most European countries there is an urgent need not only for a growing awareness of the problem of obesity in children and adolescents but also for development of new comprehensive approaches in treating this group.