牛樟芝菌丝体全长cDNA文库构建及EST序列分析

目的为了更好地挖掘牛樟芝Antrodiacinnamomea菌丝体三萜合成和代谢相关基因、筛选互作蛋白和牛樟芝指纹图谱分析,构建了牛樟芝菌丝体cDNA文库并分析其表达序列标签(EST)序列。方法以牛樟芝菌丝体为材料,采用Gateway法构建其cDNA文库,对部分EST序列进行生物信息学分析、功能注释和EST-SSR分析。结果成功构建了牛樟芝菌丝体cDNA文库,经鉴定文库重组率高达95%,文库滴度为6.1×106 cfu/mL,总克隆数为1.2×107 cfu,插入片段大小为300~2000 bp,平均长度达1000 bp。随机挑选单克隆进行测序获得65个有效EST序列,其中1个重叠群,64个单一序列,比对结果显示有45条序列有明确功能注释,18条为未知功能基因,GO功能注释结果表明序列涉及细胞组成、转运、催化活性、调控等功能。所有EST序列共含有271个SSR,牛樟芝核苷酸重复类型丰富,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元占总重复基元的94.23%。结论初步明确牛樟芝菌丝体cDNA文库及其EST序列相关生物信息,为牛樟芝菌丝体基因组学研究奠定理论基础。     

茉莉酸甲酯诱导的白木香cDNA文库的构建及初步鉴定

目的 通过构建茉莉酸甲酯（MeJA）处理的白木香cDNA文库,为揭示伤害诱导沉香倍半萜合成的分子机制奠定基础。方法 以MeJA处理的白木香愈伤组织为材料,以改造的pGADT为载体,利用SMART技术构建白木香全长cDNA文库。结果 构建的文库原始滴度为8.99×10⁶ pfu/mL,阳性克隆子的比例为97%,插入片段的大小在500～3 000 bp,平均大于1 000 bp。结论 构建的文库无论从库容量、克隆效率,还是全长率方面评价,均达到了高质量文库的要求。     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

草珊瑚叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

目的构建草珊瑚Sarcandra glabra叶片全长c DNA文库,进一步发掘与草珊瑚代谢及抗逆相关的基因,为草珊瑚功能基因的发现提供实验基础。方法以草珊瑚的嫩叶为实验材料,利用SMART法(即Clontech公司SMARTer试剂盒)构建草珊瑚全长c DNA文库。利用ABI3730 DNA序列分析测序获得大量的EST序列,利用生物信息分析方法对EST序列进行功能注释。结果构建了草珊瑚叶片的全长c DNA文库,经过鉴定草珊瑚c DNA文库的文库滴度为1.14×107 cfu/m L,平均插入片段为1 000 bp。利用该文库测序了221个单克隆,共获得EST序列177条,拼接出151个单一序列;利用NCBI数据库进行同源比对分析,共有119条(79%)与已知基因有显著的同源性,进行GO功能注释,显示其表达术语涉及了细胞生长,信号转导,蛋白质合成、转录,抗逆反应以及能量代谢等。结论构建了符合要求的草珊瑚叶片全长c DNA文库,并对相关EST序列进行了生物信息学分析,为草珊瑚基因组学研究提供一定的参考。     

霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因克隆与原核表达分析＊

目的 克隆霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因并进行生物信息学分析，为进一步培育高黄酮含量的霍山石斛药材提供理论依据。方法 根据前期霍山石斛转录组数据筛选出的基因DhUF3GT，克隆该基因，并对cDNA的核酸序列进行生物信息学分析，同时构建DhUF3GT-pET28（a）重组质粒进行原核表达分析。结果 测序结果显示，霍山石斛DhUF3GT基因cDNA序列有1289 bp，包含一个长度为1239 bp的开放阅读框，编码412个氨基酸，GenBank中的登录号为OM460827。生物信息学分析表明：DhUF3GT蛋白属于亲水性稳定蛋白，理论相对分子质量为45.668 KD，等电点（PI）为5.98，具有多个磷酸化位点和两个糖基化位点，不含信号肽，亚细胞定位于叶绿体。系统进化树表明，该序列与同科植物铁皮石斛同源性最高，具有UGT家族的“PSPG Box”保守区域。SDS-PAGE电泳显示，成功表达出原核重组蛋白DhUF3GT-pET28（a）。结论 成功克隆出霍山石斛DhUF3GT基因序列，并获得其序列特征及原核表达蛋白，这有助于霍山石斛DhUF3GT功能的进一步研究及类黄酮化合物的生物合成机制的阐明。     

甘草鲨烯合酶基因及cDNA的克隆与序列分析

目的:对甘草鲨烯合酶(SQS)基因的cDNA及DNA进行克隆及序列分析.方法:根据已报道的光果甘草SQS1基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR的方法,提取甘草根的RNA然后反转录成cDNA,以cDNA为模板,扩增出SQS基因的cDNA序列,以甘草总DNA为模板,扩增SQS的DNA序列.结果:序列分析表明,克隆获得的甘草SQS1的cDNA编码区为1242 bp,编码413个氨基酸残基,命名为GuSQS1,登录号为GQ266154,与卢虹玉等报道的甘草的2个SQS(SQS1和SQS2)的氨基酸序列一致性为98.55%,88.62%,对应DNA序列全长为4484 bp,含有13个外显子,12个内含子,登录号为GQ180932.结论:甘草SQS的cDNA及DNA序列的获得为进一步研究甘草酸生物合成机制提供了基础.     

甘草β-AS基因时空表达模式研究

目的:揭示甘草β-AS基因表达的时间特异性及空间特异性。方法:通过PCR扩增获得不同时间、不同部位甘草β-AS基因的cDNA序列,琼脂糖凝胶电泳后用Gel-Pro分析软件对电泳条带进行光密度分析,计算其相对表达量。结果:空间特异性实验显示β-AS基因在甘草的地上部分没有表达,地下组织中,新陈代谢最旺盛的根尖部分表达量高于根茎。时间特异性实验显示甘草β-AS基因在全年中的表达水平可分为4个阶段。12月至2月,β-AS基因表达低于检测水平;3月至5月,β-AS基因开始表达,表达量逐渐上升;5、6及8、9月,β-AS基因表达量保持较高水平;10、11月表达量开始下降。结论:在研究甘草β-AS基因时,应该选取转录水平较高的5、6及8、9月份;选取转录水平较高的根尖作为提取总RNA的部位。     

菌根真菌诱导的铁皮石斛根差减cDNA文库构建

 目的 构建菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cDNA文库,从中筛选出差异表达基因。方法 采用SMARTer PCR cDNA合成方法直接以总RNA为模板合成并富集稀少cDNA,再利用抑制消减杂交（SSH）方法构建受菌根真菌共生诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库。结果 成功构建了受菌根真菌诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库,共获得1 975个阳性克隆。经检测,90%以上克隆能扩增出有效产物,其插入片段大小在150~1 000 bp之间。随机挑取了20个克隆菌液测序并进行了比对分析,大部分为植物应对环境胁迫防御性基因。结论 该技术体系所构建的差减cDNA文库质量较好,操作方便,尤其适用于珍稀濒危的植物材料。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

pCMV-tag2B-CD258质粒的构建和初步表达鉴定

目的构建肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员CD258的真核表达质粒,诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的CD258全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B中,构建CD258的重组表达载体pCMV-tag2B-CD258,经DNA测序证明CD258的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染人前列腺癌IA8细胞系,诱导其表达,G418筛选阳性克隆,用Western Blot进行鉴定。结果pCMV-tag2B-CD258经双酶切表明有相应大小的DNA片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的CD258基因,用脂质体转染法可将pCMV-tag2B-CD258导入IA8细胞并成功表达,目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论重组质粒pCMV-tag2B-CD258能表达具有生物学活性的CD258蛋白,为研究CD258在前列腺癌中的功能打下了基础。     

癌胚抗原肿瘤基因疫苗胶囊的研制

 目的研制癌胚抗原(CEA)阳性肿瘤基因疫苗结肠溶胶囊。方法通过分子克隆技术将加强型绿色荧光EGFP cDNA连接于CEA cDNA的上游,构建示踪子EGFP-CEA融合基因疫苗pVGC2。使用特制的微小结肠溶空心胶囊制备鼠用基因疫苗口服胶囊。收集小鼠口服用药后的腹腔游离细胞,采用荧光显微镜观察绿色荧光以便评估EGFP-CEA融合蛋白质的表达情况。结果所构建的重组质粒的目的基因片段测序结果证实所接入的EGFP-CEA cDNA序列与母本cDNA序列100%一致。所制备的口服胶囊的平均溶出度为(91.1±3.65)%。检测结果显示,口服胶囊后小鼠腹腔游离细胞中可见到绿色荧光。结论成功地制备了口服基因疫苗胶囊。小鼠腹腔游离细胞中绿色荧光融合蛋白的表达预示,口服基因疫苗胶囊是一种潜在可行的抗肿瘤免疫途径。     

狼疮性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人狼疮性肾炎(LupusNephritis LN)肾阴虚证cDNA消减文库。方法:选择汉族人LN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNA Template)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建LN肾阴虚证消减文库。结果:用SSH方法筛选出了LN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了450个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了LN肾阴虚证的cDNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建LN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆LN肾阴虚证相关基因奠定了基础。