加热抗原修复对乳腺癌组织中内源性抗生物素蛋白结合物的影响及其对策

目的:探讨加热抗原修复对甲醛固定石蜡包埋乳腺癌组织中内源性抗生物素蛋白结合物(EABA)的影响,以及消除EABA对免疫组织化学染色干扰的对策。方法:采用微波加热抗原修复法,免疫组织化学SP染色法,蛋清液封闭法,抗生物素蛋白-生物素封闭法及Envision二步法对10例甲醛固定石蜡包埋乳腺癌标本内的EABA进行检测。结果:1经甲醛固定石蜡包埋的乳腺癌组织中的EABA被封闭;2加热抗原修复可造成EABA暴露,且EABA仅存在于细胞质中;3蛋清液封闭法及抗生物素蛋白-生物素封闭法可封闭暴露的EABA。采用非生物素检测系统也可消除EABA对正常免疫组化染色的干扰。结论:微波加热抗原修复可使甲醛固定石蜡包埋乳腺癌组织中的EABA重新暴露。因而对生物素-抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶检测系统的免疫组织化学染色造成干扰;暴露的EABA可通过蛋清液封闭法、抗生物素蛋白—生物素封闭法封闭,或采用非生物素检测系统,达到避免EABA对正常免疫组化染色干扰的目的。     

消除肝组织免疫组化中非特异性显色的探讨

目的:初步研究加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物(EABA)的影响,探讨蛋清液在封闭肝组织EABA、消除非特异性显色中的作用.方法:采用免疫组化SP法及蛋清液封闭法,对甲醛固定石蜡包埋的30例肝细胞癌组织,30例门脉性肝硬化组织,10例肝脏海绵状血管瘤之周围正常肝组织进行EABA检查.结果:①经甲醛固定石蜡包埋后肝组织中的EABA被封闭.②加热抗原修复可造成EABA暴露.③EABA在正常肝组织、肝硬化组织及肝癌组织中都有分布,主要以颗粒状形式存在于胞质中,造成非特异性显色.④20%蛋清液可封闭肝组织中的EABA,消除它对正常染色的干扰.结论:加热修复可使甲醛固定石蜡包埋组织中的EABA重新暴露,暴露的EABA见于人体正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中,因而对正常免疫组化染色可造成干扰;暴露的EABA可被蛋清液封闭,以蛋清液消除肝组织中非特异性显色的方法经济便捷,效果良好.     

内源性生物素对SP免疫组织化学结果的影响

生物素是参与糖原异生和脂肪酸合成的一种联合酶 ,内源性生物素广泛存在于多种组织和器官 ,如肝、肾、脑、胰、乳腺、脂肪、子宫内膜和骨骼肌组织等[1～ 3] 。当利用链亲素卵白素 过氧化物酶 (streptavidin peroxidase ,SP)技术进行免疫组织化学检测时 ,内源性生物素与链亲素卵蛋白 过氧化物酶结合 ,是导致假阳性结果出现的主要原因之一[3～ 7] ,本文研究了内源性生物素对SP免疫组织化学结果的影响 ,并对如何避免假阳性结果进行了讨论。1　材料与方法1 2　标本　收集 1994～ 2 0 0 0年本校湘雅医院和湘雅二医院外科肝细胞癌 (HCC)手术标本 32例 ,所有组     

固相生物素－亲和素ELISA检测HIV抗体方法的建立与应用

采用生物素化ＨＩＶ合成肽抗原与预吸附在ＥＩＡ反应板上的亲和素结合，建立检测ＨＩＶ抗体的固相生物素－亲和素ＥＬＩＳＡ方法。经ＨＩＶ（１＋２）抗体参考血清Ｐａｎｅｌ检定，其灵敏度（１３／１３）１００％，特异性（２８／２８）１００％，批内变异系数＜７％，批间变异系数＜１０％。１０５６８例确认血清标本验证，阳性检出率１００％，阴性总符合率９９．８％，假阳性率０．２％。与常规间接ＥＬＩＳＡ法比较，本法操作简便，试验所需时间短，灵敏度、特异性和稳定性提高明显     

生物素-亲和素系统在MR靶向成像中的应用

目的探讨利用生物素-亲和素系统的靶向定位效应和生物放大作用,提高MR分子成像的敏感性。方法制备生物素化HAb18单克隆抗体并测定其生物素化程度及抗原结合活性。将8只荷人肝细胞癌裸鼠静脉注射生物素化单克隆抗体600 μg,24 h后腹腔注射80 μg 亲和素,30 min后再静脉给予Gd-DTPA-链霉亲和素。对实验动物行MR扫描,测量SE T1WI平扫及增强后10、30 min及2、6、12、24 h图像内肿瘤、肝脏、肌肉的信号强度,绘制信号强度-时间曲线,并计算其强化率及对比度噪声比。结果HAb18单克隆抗体经生物素化后,每个抗体分子平均可结合20个分子生物素,其抗原结合活性约为91%。增强后肿瘤信号强度缓慢升高,在注射对比剂后第6小时,肿瘤的强化率、比度噪声比达到最大值,与其他各时间点有显著性差异。肝脏在注射对比剂后第6小时的信号强度达到最高,而后信号强度下降,增强后12 h的信号强度与平扫相似。肌肉表现为轻度强化,增强后各时间点的信号强度与平扫相比无明显差异。结论利用生物素-亲和素技术对肿瘤进行MR靶向成像,具有特异性强化作用并能延长肿瘤的强化时间,但Gd-DTPA-SA的血池效应也造成了肝脏的持续强化。     

亲和素——生物素技术检测幽门螺旋菌抗原

本文以幽门螺旋菌(Helicobacter Pylori, HP)免疫家免获得抗HP抗体.用酶破坏HP表面包被的抗体成分,以暴露其抗原决定簇,然后加抗HP抗体,再用羊抗免IgG作桥联抗体,连接生物素,用亲和素-生物素系统放大检测组织中的HP抗原.结果在碱性复红,W-S银染色均为阴性的切片中显示少量的HP菌体及HP已破碎溶解的抗原成分,本法明显优于碱性复红,W-S银染色法.     

生物素-亲和素-ELISA及其在传染病诊断中的应用

综述生物素-亲和素-酶联免疫吸附试验技术的原理、方法及其在传染病诊断中的应用研究,根据生物素-亲和素与酶的联结方式,本法主要有三种类型:即生物素-亲和素-酶标生物素法;生物素-酶标亲和素法和亲和素-生物素酶复合物法,三者均有较高的敏感性和特异性,已试用于多种微量抗原和抗体的检测,为流感杆菌、结核杆菌(结核性脑膜炎)、布鲁氏杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、日本乙型脑炎病毒和日本血吸虫等传染病、地方病的免疫学诊断提供了一种比常规酶联免疫吸附试验更灵敏的新方法。晚近,该技术也已在微生物学、病毒学、寄生虫学、免疫学、生物化学、病理学以及临床多学科中进行着应用研究,具有广阔的前景。     

生物素-亲和素系统在MR靶向成像中的应用

目的：探讨利用生物素-亲和素系统的靶向定位效应和生物放大作用，提高MR分子成像的敏感性。方法：制备生物素化HAb18单克隆抗体并测定其生物素化程度及抗原结合活性。将8只荷人肝细胞癌裸鼠静脉注射生物素化单克隆抗体600μg，24h后腹腔注射80μg亲和素，30min后再静脉给予Gd-DTPA-链霉亲和素。对实验动物行MR扫描，测量SET1WI平扫及增强后10、30min及2、6、12、24h图像内肿瘤、肝脏、肌肉的信号强度，绘制信号强度-时间曲线，并计算其强化率及对比度噪声比。结果：HAb18单克隆抗体经生物素化后，每个抗体分子平均可结合20个分子生物素，其抗原结合活性约为91％。增强后肿瘤信号强度缓慢升高．在注射对比剂后第6小时，肿瘤的强化率、比度噪声比达到最大值，与其他各时间点有显著性差异。肝脏在注射对比剂后第6小时的信号强度达到最高，而后信号强度下降．增强后12h的信号强度与平扫相似。肌肉表现为轻度强化，增强后各时间点的信号强度与平扫相比无明显差异。结论：利用生物素．亲和素技术对肿瘤进行MR靶向成像，具有特异性强化作用并能延长肿瘤的强化时间．但Gd—DTPA—SA的血池效应也造成了肝脏的持续强化。     

青霉素特异性IgE检测及其临床意义

利用单克隆抗体及生物素－亲和素放大系统检测青霉素抗原特异性ＩｇＥ，并探讨其临床意义。结果５９例青霉素Ⅰ型变态反应患者中青霉素特异性ＩｇＥ总阳性率为８８．１１％（５２／５９）；１４例门诊皮试假阳性患者特异性ＩｇＥ阴性，使用青霉素无不良反应；９例猩红热样皮疹青霉素过敏患者中１例特异性ＩｇＥ阳性；而３１５例非青霉素过敏者，其ＢＰＯ特异性ＩｇＥ均阴性，且其中部分患者使用青霉素亦无过敏反应。本文方法有特异性强、敏感性较高的特点。     

牛角角蛋白与人角质层抗原检测抗角质层抗体的比较研究(摘要)

本文以牛角角蛋白和人角质层为抗原,用生物素——亲和素酶联免疫吸附试验(BA—ELISA)检测了50名银屑病患者和32名正常人血清中抗角质层抗体(ACAS 的滴度,虽然以牛角角蛋白作抗原     

癌胚抗原单链抗体-链亲和素融和蛋白的功能鉴定

目的: 用pET21原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体-链亲和素融合蛋白.方法: 融合表达载体转化大肠杆菌菌株HMS174(DE3),用1mmol/L的IPTG诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析.结果: SDS-PAGE表明,融合蛋白分子质量约57ku,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合CEA与生物素的双特异性.结论: 原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过氧化物酶可直接检测抗原.     

乳腺癌患者血清中p185蛋白BA-ELISA检测方法的建立

目的 建立检测乳腺癌患者血清中p185蛋白的生物素-亲和素酶联免疫法(BA-ELISA法),探讨血清p185蛋白在乳腺癌诊断中的意义.方法 利用自备的生物素化Her-2/neu单克隆抗体,并利用亲和层析法从T6-17细胞培养上清中纯化的p185蛋白作为阳性对照,建立血清p185蛋白BA-ELISA检测方法,对乳腺癌和正常对照血清进行p185蛋白检测,同时对乳腺癌患者组织进行p185蛋白免疫组化染色.结果 BA-ELISA方法检测122例乳腺癌患者血清,血清p185阳性数为39例;检测110例正常人血清,血清p185阳性数为0例.122例乳腺癌患者中免疫组化p185阳性数为43例,其中血清p185升高38例.结论 乳腺癌患者血清p185蛋白对乳腺癌具有诊断意义,血清p185蛋白和组织p185蛋白呈高度相关.     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用

目的 通过BioID-质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统,并采用免疫共沉淀-蛋白质印迹法验证与Yes相关蛋白1(YAP1)相互作用的蛋白质.方法 构建YAP1-BirA*融合表达质粒,将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养基中加入50μmol/L生物素,继续培养24 h后提取细胞总蛋白质.利用YAP1特异抗体,采用蛋白质印迹法检测YAP1-BirA*融合蛋白的表达.利用HRP偶联的亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平.通过亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化,多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质后对亲和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解.取40μg总蛋白行SDS-PAGE,然后采用蛋白质银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果.用非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质.针对鉴定得到的蛋白质,采用蛋白质印迹法对生物素化的SMAD家族成员3(SMAD3)进行验证.通过YAP1的免疫共沉淀-蛋白质印迹法确定SMAD3能否与YAP1相互作用.结果 成功构建YAP1-BirA*融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白.在生物素存在的情况下,YAP1-BirA*融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与YAP1-BirA*融合蛋白邻近的蛋白质.在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白质.质谱鉴定显示,能够获得细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白质.免疫共沉淀-蛋白质印迹法结果证明SMAD3蛋白能与YAP1相互作用.结论 BioID-质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛选的简单、高效技术,与免疫共沉淀-蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系.     

HBV共价闭合环状DNA功能化纳米颗粒制备及鉴定

目的 制备HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)功能化磁性纳米颗粒,为进一步建立富集分离和检测cccDNA方法奠定基础. 方法 通过亲和素修饰纳米颗粒表面,利用亲和素与生物素的亲和作用,将亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的cccDNA特异性探针偶联,制备cccDNA功能化纳米颗粒,最后用cccDNA探针完全互补的荧光标记序列与功能化纳米颗粒反应,鉴定其特性. 结果 亲和素修饰的纳米颗粒能结合生物素最大量为1 205 ng/mg;通过与亲和素作用,生物素标记cccDNA特异性探针固定在磁性纳米微粒表面,其最大结合生物素标记探针量为3.2×10-9 mol/mg;cccDNA功能化纳米颗粒可捕获与其互补的荧光标记寡核苷酸序列,其最大捕获量为2.0×10-9mol/mg,并能通过变性释放出保持生物学活性游离的荧光标记寡核苷酸序列. 结论 成功构建的cccDNA功能化纳米微粒能有效捕获与其互补的序列,其捕获量能达到cccDNA的分离提取要求.     

生物素标记增强化学发光法测定血清中庆大霉素含量

作者采用生物素－亲和素体系及化学发光增强法测定血清中庆大霉素含量。以微晶纤维素－羊抗兔抗体结合兔抗庆大霉素，再由待测庆大霉素与生物素化庆大霉素竞争，分离后沉淀中加入ＨＲＰ－亲和素，洗涤后测化学发光强度。结果测得血清中庆大霉素双对数标准曲线的检出限范围为６３ｎｇ～７８ｎｇ／ｔｕｂｅ，｜ｒ｜＝０．９９１±０．００６，平均回收率为１０３％。     

磁性纳米粒子与链霉亲和素的连接及初步应用

目的在磁性纳米粒子表面偶联上链霉亲和素,用于VEGF质粒的提纯.方法用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁性纳米粒子上, NBT/BCIP显色法和放射性核素标记法测定链霉亲和素的连接;利用生物素和链霉亲和素的高亲和力将生物素连接的探针连接在磁性纳米粒子上,制备成三链螺旋磁性纳米粒子;修饰好的粒子从含有VEGF质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.结果显色反应证实链霉亲和素连接在磁性纳米粒子表面,核素标记法显示其结合率在室温时为2.5 μg/100 μg,65 ℃时为22.28 μg/100 μg;三链螺旋磁性纳米粒子可以提纯出质粒,且纯度较高.结论通过一定修饰的磁性纳米粒子可以从含有质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.     

磁性纳米粒子与链霉亲和素的连接及初步应用

目的在磁性纳米粒子表面偶联上链霉亲和素,用于VEGF质粒的提纯.方法用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁性纳米粒子上, NBT/BCIP显色法和放射性核素标记法测定链霉亲和素的连接;利用生物素和链霉亲和素的高亲和力将生物素连接的探针连接在磁性纳米粒子上,制备成三链螺旋磁性纳米粒子;修饰好的粒子从含有VEGF质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.结果显色反应证实链霉亲和素连接在磁性纳米粒子表面,核素标记法显示其结合率在室温时为2.5 μg/100 μg,65 ℃时为22.28 μg/100 μg;三链螺旋磁性纳米粒子可以提纯出质粒,且纯度较高.结论通过一定修饰的磁性纳米粒子可以从含有质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.     

链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌诊断中的临床应用

目的分析链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌检测当中的临床价值。方法选取2009年3月至2013年1月在孝感市中心医院就诊具有高度鼻咽癌危险的患者326例,分别进行链霉亲和素-生物素放大免疫酶法和常规免疫酶法检验,对链霉亲和素-生物素放大免疫酶法与常规免疫酶法在鼻咽癌患者117例与鼻咽癌高危人群但是无鼻咽癌患者209例的IgA/VCA和IgA/EA的检出率进行观察。结果在鼻咽癌患者中,链霉亲和素-生物素放大免疫酶法的IgA/VCA检出阳性率为99.16%,高于常规免疫酶法的92.31%,IgA/EA检出阳性率为78.63%,高于常规免疫酶法的56.41%(P<0.05)。鼻咽癌高危人群但是无鼻咽癌患者,链霉亲和素-生物素放大免疫酶法的IgA/VCA检出阳性率为24.88%,与常规免疫酶法检出阳性率(23.92%)差别无统计学意义(P>0.05),IgA/EA检出阳性率为3.83%,而常规免疫酶法为0。结论链霉亲和素-生物素放大免疫酶法能够较常规免疫酶法更为灵敏地诊断鼻咽癌。     

斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的表达及鉴定

目的获得表达斯氏狸殖吸虫半胱蛋白酶基因片段编码多肽,对其免疫反应性作初步研究,在吸虫所致疾病的血清学诊断的应用奠定基础.方法用PCR法扩增目的基因片段,1%琼脂糖凝胶回收纯化后与PinPoint T载体相连,并导入到大肠杆菌JM109菌株中去,诱导表达其编码的多肽片段.用裂解液制备抗原标本,经SDS-PAGE电泳后,经考马斯亮蓝和生物素链亲合素碱性磷酸酶染色检测其表达情况,Westernblotting鉴定其免疫反应性.结果转化实验共获得8株阳性重组子,经测序鉴定证实仅1株正向连接.经过诱导表达,制备重组抗原标本,经SDS-PAGE、转膜后生物素-链亲和素-碱性磷酸酶系统染色显示在32×103处有一融合蛋白条带,反向连接菌株与之相似,也出现一条表达带,但分子量远小于预期值,仅仅14×103左右.Western-blotting显示仅正向连接菌株在32×103的位置有一阳性染色条带.结论成功的构建了斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶的原核表达载体,经过诱导后表达的重组抗原,具有良好的免疫反应性.     

免疫组织化学中肝组织EABA的封闭

目的:初步探讨蛋清液在封闭肝组织EABA中的作用;方法:采用免疫组化SP法及蛋清液封闭法,对40例肝细胞肝癌组织进行EABA检查;结果:20 %蛋清液可封闭肝组织中的EABA;结论:以蛋清液封闭肝组织中的EABA的方法经济便捷,效果良好.