羊膜接触镜输送人表皮干细胞重建兔角膜上皮

目的 利用眼表生物膜固定装置(BMFD)与羊膜(AM)制成接触镜,输送人表皮干细胞至角膜缘干细胞缺损(LSCD)的兔眼表,并评价其重建角膜上皮的效果.方法 制作去角膜上皮及角膜缘干细胞的雌性LSCD兔模型,分为3组:羊膜加人表皮干细胞移植组(n=20),将男性人表皮干细胞悬液注射到BMFD-AM接触镜(简称羊膜接触镜)与眼表之间;羊膜遮盖组(n=20),戴羊膜接触镜;对照组(n=20),单纯药物治疗.裂隙灯显微镜结合角膜荧光素钠染色观察并评价角膜修复情况.随访至角膜完全上皮化后,取角膜组织行病理学检查和免疫组织化学鉴定,PCR检测人Y-STR基因鉴定细胞来源.结果 羊膜加人表皮干细胞移植组角膜上皮修复快,平均(5.60±0.46)d达到完全上皮化,另外两组角膜上皮修复迟缓.羊膜遮盖组(9.25±0.51)d、对照组(12.45±0.65)d才完成角膜上皮化(P均<0.05).组织病理学示羊膜加人表皮干细胞移植组角膜上皮细胞形态接近正常,K3/K12(+)、Mucin 5AC(-)、K4(-).并可检测到人Y-STR基因.组织病理学示另外两组角膜上皮结膜化,K4(+)、Mucin 5AC(+)、K3/K12(-).结论 羊膜接触镜联合人表皮干细胞悬液注射能够重建LSCD兔角膜上皮.     

角膜缘干细胞及其上皮移植的研究进展

严重的眼表面疾病常遗留高度纤维血管化的角膜和瘢痕化的结膜 ,甚至引起持续性上皮脱落和缺损 ,角膜穿孔等 ,是致盲的重要原因之一。近年来 ,国内外学者对严重的眼表面疾病的角膜上皮愈合及治疗进行了一系列研究 ,证实角膜上皮的干细胞位于角膜缘基底层 ,角膜缘部干细胞缺失或功能障碍为特征的疾病的治疗中 ,采取了更新或移植干细胞的方法 ,本文就角膜缘干细胞及其上皮移植作一概述。     

PCNA在新西兰大耳兔角膜及角膜缘的表达

目的 观察增殖细胞核抗原(PCNA)在新西兰大耳兔角膜上皮的表达,进一步了解角膜缘干细胞(LSCs)的增殖情况.方法 健康成年新西兰大耳兔30只,体重2.0～2.5 kg,雌雄错配,取双侧眼球,角膜上、下、内、外四个部位常规石蜡切片,采用常规组织学HE染色、免疫组织化学SABC法染色及图像分析进行研究,相关数据做统计学处理.结果 HE染色显示角膜缘上皮细胞排列紧密而不规则,层数较角膜中央部多,基底层细胞呈矮柱状或立方形,核大而圆,居中着色较深,基底部可见明显乳头样突起.角膜中央上皮基底层细胞较大,呈柱状.免疫组织化学SABC法显示PCNA阳性细胞,核卵圆而大,多位于角膜上、下方角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层及角膜浅层有少量分布,在角膜中央上皮基底层可见极少PCNA阳性细胞出现.图像分析显示每个高倍镜视野中上、下角膜缘与角膜及内、外角膜缘PCNA阳性细胞数量及灰度具有显著性差异(P＜0.05).结论 PCNA在角膜上皮的标记细胞主要是LSCs和短暂扩充细胞,即标记处于迅速增殖中的细胞.PCNA在角膜中央及角膜缘的表达反映了LSCs增殖,分化的过程;同时提示上、下方的角膜缘干细胞分布较多.     

胰岛素促进体外兔角膜缘干细胞的增殖

目的 从原代培养获得角膜缘干细胞(LSCs),探讨不同浓度胰岛素对角膜缘干细胞增殖作用的影响. 方法 取兔角膜组织体外培养获得角膜缘干细胞,并行免疫组织化学及透射电镜鉴定.5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L及100mg/L胰岛素作用后,以四甲基偶氮唑盐法检测胰岛素对角膜缘干细胞增殖能力的影响. 结果 5mg/L和10mg/L浓度的胰岛素有促进角膜缘干细胞增殖的作用,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05);5mg/L与10mg/L组比较也有显著差异(P＜0.05);20～100mg/L组与对照组比较无显著性差异(P＞0.05). 结论 胰岛素促进培养角膜缘干细胞的增殖,最适宜浓度为5mg/L.     

人角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的　建立人角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法　用含20%胎牛血清1640培 养液对人角膜缘干细胞进行体外培养,进行形态学观察和免疫细胞化学鉴定。结果　植块3～4d后细胞开始贴壁 生长,10～15d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形,类角膜上皮细胞;免疫细胞化学染色显示,培养第11d,少量 细胞表达AE5,大量细胞表达p63。结论　应用20%胎牛血清1640培养液组织培养的方法获得的原代培养细胞具 有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

NGF对角膜缘干细胞体外扩增的影响

目的观察神经生长因子(NGF)对体外培养角膜缘干细胞(LSCs)增殖的影响。方法体外培养LSCs,分对照组和NGF组传代培养,分别选取各组培养24 h、72 h和5 d的细胞,免疫组化检测p63,免疫荧光检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果 NGF组在24 h、72 h和5 d时间点p63表达平均灰度值明显低于对照组各个时间点(P<0.05)。而NGF组在相应的各时间点PCNA表达平均灰度值高于对照组(P<0.05)。凋亡检测显示NGF组在24 h、72 h和5 d的时间点细胞凋亡率要低于对照组的凋亡率(P<0.05)。结论 NGF可促进和维持LSCs的体外扩增和生长,降低凋亡发生,有维持LSCs干细胞特性的作用。     

角膜缘干细胞移植治疗兔眼表碱烧伤的实验研究

目的 :探讨眼表碱烧伤后行角膜缘干细胞移植术的疗效 ,并与单纯行角膜移植术组作比较。方法 :在 16只兔双眼上制作碱烧伤模型 ,1d后 ,右眼行异体板层角膜缘干细胞移植术 ,左眼行异体板层角膜移植术 ,术后观察 6月 ,根据术眼的角膜新生血管分级、植片的混浊度、水肿度来计算移植排斥反应指数 (RI) ,以RI值判断植片的存活情况。结果 :行异体板层角膜缘干细胞移植术的 16眼中有 14眼RI <9,治愈率达 87.5 % ;行单纯异体板层角膜移植的 16眼中 6眼RI值 <9,有效率 3 7.5 % ;两者相比有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。两组的新生血管数、植片的混浊度、水肿度及RI值均有显著性差异。结论 :含干细胞的异体角膜缘移植治疗眼表碱烧伤的疗效明显优于单纯异体角膜移植 ,是一种较有效的方法。     

HLA匹配角膜缘干细胞联合羊膜移植修复翼状胬肉

背景：HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉是眼科医生治疗的新理念,该方法治疗后并发症少、康复快、复发率低,尤其是能减少移植排斥反应等已被广泛接受。 目的：探讨HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉疗效。 方法：选取2013年3月1日至2014年4月30日行HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗的翼状胬肉患者47例(47眼)作为试验组;回顾性分析2010年3月1日至2012年12月1日采用单纯翼状胬肉切除方法治疗的翼状胬肉患者40例(47眼)作为对照组,对两组患者治愈和复发情况进行比较。 结果与结论：试验组47例,全部顺利完成治疗,无并发症,其中1例切口感染,特殊对症治疗后均已好转出院,全部患者均无移植排斥反应。试验组治愈45眼,复发2眼,复发率为4.3%。对照组47眼中治愈32眼,复发15眼,复发率31.9%。结果表明HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉并发症少、复发率低,是治疗翼状胬肉一种行之有效的方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症

文题释义： Wnt信号通路：Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路,在干细胞调控中发挥重要作用。当细胞外Wnts与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合导致GSK3β失活,β-catenin在胞质中积累继而向胞核转位,标志着Wnt通路被激活。β-catenin在细胞核中与转录因子Tcf /LEF结合启动下游基因而发挥功能。 角膜缘干细胞：角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分,角膜缘干细胞存在于角膜缘的Vogt栅栏结构中,属于单能干细胞,在角膜损伤修复中发挥重要作用。角膜缘干细胞缺乏是由于眼表各类损伤(化学伤、严重的感染等)或者基质微环境异常(先天性无虹膜、放射线所致角膜病)导致角膜上皮被结膜上皮侵犯和替代。 背景：Wnt信号通路在干细胞的调控中发挥重要作用,但是其对于角膜缘干细胞的调控作用尚不十分明确。 目的：探讨Wnt信号通路对角膜缘干细胞的调控作用及其在角膜缘干细胞缺乏症治疗中的疗效。 方法：大鼠角膜缘组织中依次加入Dispase和Trypsin/EDTA进行消化,将消化后的角膜缘干细胞悬液接种于3D-Matrigel微环境中培养,实验组培养体系中加入Wnt信号通路激活剂氯化锂(500 μmol/L),对照组不加氯化锂,培养第7天qRT-PCR检测角膜缘干细胞中p63α、CK12、CEBPδ和Ki67的表达,免疫荧光染色检测角膜缘干细胞中β-catenin的表达。采用碱烧伤法建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型,治疗组大鼠结膜下注射激活了Wnt信号通路的角膜缘干细胞,对照组大鼠结膜下注射等量PBS,随后每天使用裂隙灯观察,治疗后第4天取角膜缘组织进行免疫荧光染色、苏木精-伊红染色。 结果与结论：①角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养微环境中呈球形聚集生长,对照组角膜缘干细胞中β-catenin呈阴性,实验组角膜缘干细胞中β-catenin在细胞浆和细胞核内聚集;②qRT-PCR结果显示：对照组与实验组之间干性指标p63α、CK12和功能指标CEBPδ差异均无显著性意义(P > 0.05);实验组增殖指标Ki-67较对照组水平明显升高,差异有显著性意义(P < 0.05);③建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型,治疗组大鼠角膜组织混浊评分较对照组明显减低,差异有显著性意义(P < 0.05),角膜组织苏木精-伊红染色可见治疗组大鼠角膜上皮细胞排列整齐,细胞大小较均一,修复情况较良好,免疫荧光结果显示治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核内聚集,而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性,未见在胞浆聚集或者进核;④结果表明,Wnt信号通路的激活增强了角膜缘干细胞的增殖能力,同时能够维持细胞干性,角膜缘干细胞进入干细胞自我更新状态;激活Wnt信号通路后的角膜缘干细胞可促进角膜缘干细胞缺乏模型大鼠角膜上皮的修复,减轻角膜混浊程度;通过调控Wnt信号通路改变角膜缘干细胞的功能特性可能成为治疗角膜缘干细胞缺乏症的新途径。 ORCID: 0000-0003-0698-3653(韩波) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

兔角膜缘上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

研究兔角膜缘上皮细胞(含干细胞)在完整羊膜和去上皮羊膜上种植及生物学特征,探讨组织工程技术体外重建角膜上皮良好的方式和方法.将兔角膜缘上皮细胞分别种植于去上皮羊膜基底膜和完整羊膜上进行体外培养扩增.从倒置显微镜下的生长特性、光镜下的组织结构、超微结构、免疫组织化学检测等方面对培养获得的复合组织进行观察.结果表明兔角膜缘上皮细胞在完整羊膜上不易贴壁、生长缓慢、很难汇合成片.而在去上皮羊膜上细胞能黏附生长并增殖形成由羊膜基底膜和4～5层上皮细胞组成的复合组织,基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接,细胞之间可见桥粒连接,细胞表达角蛋白3.该复合物可作为组织工程化角膜上皮组织.     

自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床观察

目的观察自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床效果。方法用自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉38例46眼．术后观察角膜创面修复速度和愈合情况。结果随访6月至2年，仅一眼胬肉术后复发，占2.5％。结论自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉是一种有推广价值的手术。     

自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C治疗翼状胬肉疗效观察

目的：观察自体角膜缘干细胞移植术联合丝裂霉素C应用治疗翼状胬肉的疗效。方法对102例122只眼行胬肉切除,将同侧眼颞上方带有角膜缘干细胞的结膜瓣移植到胬肉处的巩膜上,术中联合应用0.2mg/ml丝裂霉素C治疗。结果术后反应轻,移植片存活,4只眼复发,复发率为3.3%。结论自体角膜缘干细胞移植术联合丝裂霉素C应用治疗翼状胬肉,方法简单,恢复角膜缘屏障,降低了复发率,是安全、有效的方法。     

体外培养人角膜缘上皮细胞抑制激活态角膜基质细胞的生长

背景：角膜受到损伤后,角膜基质细胞激活转变为成纤维细胞,引起角膜基质瘢痕化,导致视力下降甚至丧失。 目的：观察角膜不同部位上皮细胞与角膜基质细胞的相互作用,探索角膜缘上皮细胞群能否抑制激活态角膜基质细胞的生长。 方法：采用酶消化及机械外力相结合的方法获取人角膜中央、角膜旁中央及角膜缘处角膜上皮细胞与浅层角膜基质细胞,进行体外培养。相差显微镜下观察细胞形态及生长变化。待培养角膜上皮细胞与基质细胞发生接触抑制时,记作“0 周”,采用免疫荧光染色技术检测培养细胞中PCNA及p63蛋白的表达。 结果与结论：培养的角膜上皮细胞与成纤维细胞发生接触抑制时,两种细胞间有明显分界线。角膜缘组上皮细胞中PCNA及p63蛋白均有较高的表达;角膜旁中央组PCNA有较高的表达,p63蛋白阴性表达;角膜中央组PCNA表达较低,p63蛋白阴性表达;从鉴定结果中可以得出只有角膜缘组中存在一定比例的角膜缘上皮干细胞。角膜缘组上皮细胞逐渐包围并化解成纤维细胞,在相互作用4周后,成纤维细胞聚集成死细胞团,缺乏角膜缘干细胞的中央组及旁中央组中成纤维细胞生长面积增加,上皮细胞生长受到抑制甚至死亡。说明体外培养的角膜缘上皮细胞群可以抑制激活态角膜基质细胞的生长。     

活体及体外条件下对角膜上皮干细胞的定位

背景：眼表存在两种形式的上皮干细胞即角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞,角膜上皮干细胞在角膜上皮细胞更新和角膜透明的维持方面起着重要作用。 目的：采用活体激光扫描角膜共焦显微镜和免疫荧光染色技术相结合的方法,从活体和体外层面上对角膜上皮干细胞进行定位研究。 方法：收集2009年9月至2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干细胞缺乏患者,使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼,健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘,记录扫描图像并分析。眼球材料来自于河南省眼库,切取角膜中央和角膜缘组织,组织包埋剂包被、冰冻切片,切片厚度5-7 μm;免疫荧光染色技术检测p63、ABCG2、K3和Connexin 43在角膜中央及角膜缘上皮层的表达。 结果与结论：共有24例患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏,活体激光扫描角膜共焦显微镜下患侧眼角膜病变区可见结膜细胞及杯状细胞;角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失,色素细胞消失,取而代之的是大量纤维瘢痕化组织。免疫荧光染色示表达ABCG2和p63的细胞主要在角膜缘上皮基底层,尤其在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部表达相对较高,而中央角膜上皮层细胞不表达;K3及Connexin43在角膜缘上皮基底细胞层不表达,中央角膜上皮全层表达。通过活体激光扫描角膜共焦显微镜观察及干细胞标记物检测显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘外2/3区域的Vogt栅栏基底部及钉突结构中。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

诱导骨髓间质干细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

目的: 观察人骨髓间质干细胞（MSCs）移植到兔角膜基质后的分化发育情况，探讨MSCs分化为角膜上皮细胞的可行性。方法: 24只新西兰兔随机分为2组。实验组：将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4 d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔角膜基质；对照组：采用保存羊膜移植到兔角膜基质。分别于移植后1、2、3、4、6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，检查移植到兔角膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到角膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白K3/12（CK3/CK12）和角蛋白K13（CK13）的表达。结果: MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4 d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。羊膜负载MSCs移植到兔角膜基质表面, 术后免疫组织化学检测角膜上皮层CK3/CK12表达阳性， CK13表达阴性，在重建的角膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞并同时表达角膜上皮细胞特异性表面标志蛋白K3/K12，未发生免疫排斥反应，未见异常增殖细胞。结论: 羊膜负载MSCs移植到兔眼表角膜基质后，MSCs能存活、增殖并向角膜上皮样细胞分化。     

带角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床疗效分析

目的探讨带角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床疗效;方法手术显微镜下对235例280只眼翼状胬内行切除联合带角膜缘干细胞移植术;结果回访280只眼中263只眼移植片生长良好,3月至3年未见复发;结论带角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉复发率低,只有6％。     

自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉

翼状胬肉是眼科常见病,轻者影响眼部外观,重者侵入瞳孔区造成视力障碍,严重的复发性翼状胬肉可导致睑球粘连、眼球运动受限等并发症。常规治疗以单纯手术切除为主,虽然手术简便易行,但术后复发率高。近年来随着对角膜缘干细胞理论的进一步研究,使我们认识自体角膜缘干细胞移植可用于翼状胬肉的治疗。我院自2000年采用胬肉切除加自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉55例,疗效满意,现报道如下。1资料与方法1.1临床资料患者55例(62眼)均为门诊病人,男38例(42眼)、女17例(20眼),年龄32~75岁,平均45岁,其中复发性胬肉18眼。手术指征为胬肉侵入角膜…     

血管抑素抑制兔眼表碱烧伤角膜缘移植术后的角膜血管新生

目的:检测眼表碱烧伤角膜缘移植术后血管抑素抑制角膜新生血管的作用。方法:16只新西兰大白兔双眼制作碱烧伤模型1d后,双眼行角膜缘移植术,术后左眼局部应用血管抑素治疗2周,右眼作对照;观测4周,根据新生血管侵入角膜缘内的范围、角膜混浊与水肿程度进行分级并作统计学处理;同时测量术后7、14、21及28d的眼压。结果:术后4周时,应用血管抑素的左眼的新生血管的评分为1.19±0.10,而对照组为1.63±0.72,统计学处理显示左眼的新生血管较右眼的明显减少(P<0.05),角膜混浊与水肿程度亦明显下降。各时间点各术眼的眼压均在正常范围,无统计学差异。结论:局部应用血管抑素能有效抑制眼表碱烧伤角膜缘移植术后的新生血管增生。     

角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C治疗复发性翼状胬肉

目的 观察自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C治疗复发件翼状胬肉的疗效.方法 将58例(62眼)复发性翼状胬肉患者随机分为2组,治疗组(32例,35跟)采用角膜缘于细胞移植联合应用丝裂霉素C;对照组(26例,27眼)单纯采用角膜缘干细胞移植术治疗.术后随访6～30个月并比较疗效.结果 治疗组1眼冉复发,再复发率2.86%;对照组5眼再复发,再复发率18.52%,两组差异具有统计学意义(P<0.05).治疗组角膜创面上皮平均愈合时间为(8.34 ±2.38)d,对照组为(7.21±2.55)d,差异无统计学意义(P>0.05).两组均未发现严重并发症.结论 角膜缘干细胞移植联合应用丝裂霉素C治疗复发性翼状胬肉再复发率低,并发症少,为复发性翼状胬肉安全和有效的治疗方法 .     

自体角膜缘干细胞移植对翼状胬肉患者视觉质量及泪膜功能的影响

目的 探讨翼状胬肉切除术联合自体角膜缘干细胞移植对翼状胬肉患者视觉质量、角膜屈光及泪膜功能的影响。 方法 选取2016年2月~2017年1月在我院治疗的翼状胬肉患者110例,随机分为对照组和观察组,每组55例。对照组给予翼状胬肉切除术治疗,观察组在对照组的基础上给予角膜缘干细胞移植,之后对两组患者视力、角膜屈光度、泪膜功能及术后巩膜并发症进行评估。 结果 与治疗前相比,治疗后两组患者视力、角膜水平曲度及角膜垂直曲度均显著增加,角膜散光度较治疗之前显著下降,且观察组治疗后视力、角膜水平曲度及角膜垂直曲度显著大于对照组,角膜散光度显著低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;与治疗前相比,治疗后两组患者基础泪液分泌试验（SIT）及泪膜破裂时间（BUT）水平均显著上升,且观察组治疗后显著高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;术后6个月,观察组眼部刺激症状、巩膜溶解软化及巩膜坏死发生率均显著低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 角膜缘干细胞移植联合翼状胬肉切除能有效提高患者视力,增加角膜屈光度,降低患者散光程度,并能有效改善泪膜功能,降低巩膜并发症的发生率。