体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞表型特征的研究

目的 对体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞的表型特征进行研究探讨。方法 组织块 法培养人牙周膜细胞,放射免疫法检测条件培养基中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣＮ）的分泌活性,免疫 组化法检测非分泌型的ＡＬＰ和ＯＣＮ的表达,原位杂交方法检测二者的ｍＲＮＡ水平的表达。结果 人牙 周膜细胞具有成骨细胞的部分表型,碱性磷酸酶在蛋白水平包括分泌和非分泌型及基因转录水平都有一 定的表达,随培养时间的变化不大;而不具有成熟的成骨细胞的表型特征——骨钙素的表达,其无论是在 基因和蛋白水平都没有表达二这一结果为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建打下基础。     

体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测

目的　探讨牙周膜成纤维细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法　采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞 ,以人胎儿皮肤成纤维细胞为对照检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。结果　体外培养人牙周膜成纤维细胞与人胎儿皮肤成纤维细胞相比表达更高水平的碱性磷酸酶 (P <0 .0 5 ) ,矿化诱导液连续培养 30d均可观察到矿化结节形成。结论　采用酶消化法可快速简便地获取原代人牙周膜成纤维细胞。体外培养牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征 ,与人胎儿皮肤成纤维细胞相比更具分化潜能 ,可作为牙周组织工程种子细胞来源     

体外培养人牙周膜细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDL)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养人牙周膜细胞的成骨潜能。方法:消化离心法收集体外培养人牙周膜细胞,提取总RNA,使用Super-array公司的点样数96点的人骨再生基因表达谱芯片检测人牙周膜细胞成骨相关基因的表达。结果:体外培养人牙周膜细胞有15种成骨相关基因无表达,81种基因有表达,其中表达较高的基因22种。结论:体外培养人牙周膜细胞具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示人牙周膜细胞是具有成骨细胞分化潜能的成纤维细胞。     

人牙周膜成纤维细胞的分离培养及其生物学特性的探讨

用组织块培养法建立了人牙周膜成纤维细胞系，并探讨了该细胞在体外生长的特性，为进一步探讨该细胞的体外功能提供了研究基础．     

人牙周膜成纤维细胞体外培养的研究进展

人牙周膜成纤维细胞是牙周细胞生物学、药理学、毒理学和牙周组织工程学研究的基础,对口腔各个领域意义重大。由于受到牙周组织的解剖结构和取材数量的限制,牙周膜成纤维细胞的体外培养较为困难,因此本文就人牙周膜成纤维细胞的体外培养方法和应用等研究进展作一综述。     

人牙周膜成纤维细胞分离、纯化培养及生物学特性观察

采用胶原酶及胰蛋白酶联合消化法,简便、快速地获得大量成活率高的人牙周膜细胞。在ＤＭＥＭ培养基中进行了原代及传代培养,对其中的成纤维细胞进行分离纯化。相关显微镜下,牙周膜成纤维细胞呈星形或长梭形,免疫组化波丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证实该细胞来源可靠。酶消化法不失为一种简便、快速、可靠的细胞原代分离培养方法。     

不同代数人牙周膜细胞成骨特征稳定性的实验研究

目的：观察培养代数牙周膜细胞的成骨细胞表型特征的影响。方法：利用4、6、8、10代细胞进行以形态学、细胞生长曲线、碱性磷酸酶（ALP）活性测定以及矿化能力和面积的观察。结果：在细胞形态和超微结构、细胞生长曲线、碱性磷酸酶活性和矿化能力方面，第4、6、8、10代无明显差别；10代以后的细胞各方面指标减弱，提示细胞进入衰老期。结论：利用10代以内牙周膜细胞进行实验或移植其结果可靠。     

人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究

目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点。方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况。结果应用组织块法从24块人牙周膜组织中成功分离培养出人牙周膜细胞,成功率96%（24/25）,细胞生长状态良好;应用酶解组织块法成功率80%（16/20）;应用酶消化法成功率75%（12/16）。结论组织块法原代培养人牙周膜细胞方法简单且成功率较高。     

褪黑素对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的 探讨褪黑素对人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化能力的影响.方法 原代培养法成功提取hPDLCs后,加入不同浓度的褪黑素作为实验组,空白对照组不加褪黑素.MTT法检测不同浓度褪黑素对细胞增殖的影响,相关试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)的活性和表达后,采用茜素红S染色、Real-time PCR和Western Bl...     

人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能

目的 :分离人体脂肪基质细胞并诱导培养其成骨表型。方法 :将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行机械分割 ,通过Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪基质细胞 ,在BGJb 培养基中原代培养 10d ,消化传代后用含体积分数 10 ?S及 10 - 8mol/L地塞米松 ,50mg/L左旋抗坏血酸 ,10nmol/L维生素D3 ,10mmol/Lβ 磷酸甘油钠的DMEM /F12培养基中诱导培养 14d ,观察细胞形态 ,绘制细胞生长曲线并对其成骨表型进行鉴定。结果 :脂肪基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长 ,其中的成体干细胞经诱导培养后体积明显增大 ,胞核大面圆 ,胞浆丰富 ,群体倍增时间为 66h。Gomori萘酚磷酸酯法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒 ,vonKossa染色表明聚集的细胞团能形成矿化结节。结论 :脂肪基质细胞中的成体干细胞经过矿化诱导培养后可向成骨细胞分化 ,并具有明显的成骨表型     

体外培养碱性成纤维细胞因子对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响

目的：探讨体外培养过程中,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）生物学特性的影响。方法：体外分离培养人牙周膜成纤维细胞并鉴定,加入不同浓度bFGF（1ng／ml、10ng／ml、50ng／ml、100ng／ml）培养,MTT方法检测细胞增殖情况;并对细胞进行矿化诱导,检测细胞的碱性磷酸酶活性。结果：hPDLFs呈星形或长梭形,免疫组化波丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证实该细胞来源可靠。bFGF在一定浓度范围内,与细胞增殖成正比,而在本实验培养条件下（10％FBS）bFGF最大效应浓度为10ng／ml。矿化诱导条件下,碱性磷酸酶活性明显增加,在联合应用bFGF的情况下,100ng／ml组碱性磷酸酶活性明显高于其他组。结论：不同浓度bFGF对人牙周膜成纤维细胞生物学行为的影响不同,在一定浓度条件下,低浓度bFGF促进人牙周膜成纤维细胞的增殖,而高浓度bFGF作用于人牙周膜成纤维细胞可能更易于分化。     

两种体外培养人牙周韧带成纤维细胞方法比较

目的探索一种在体外短时间内简便、可靠获取大量人牙周韧带成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,HPLF)、建立稳定的体外培养体系的方法。方法采用酶消化法和组织贴块法进行HPLF体外原代培养及传代培养的对比研究。通过细胞形态学、超微结构观察及波形蛋白和角蛋白免疫组化染色等对细胞进行定性研究;测定细胞生长曲线了解细胞生长基本规律及其增殖能力。结果采用酶消化法和组织贴块法均可成功的进行HPLF连续传代培养。最高传代数为30代。培养的细胞具有成纤维细胞的典型形态,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,生长稳定期倍增时间为48~72h。组织块培养法需培养时间长,原代培养获取的细胞量较少,较难传代。酶消化法可短时间内获取大量细胞,细胞产量高,但操作手续复杂易污染,细胞易受损伤。结论成功建立了一个稳定的HPLF体外培养体系。除常用的组织块法外,胰蛋白酶及胶原酶联合消化法不失为一种简便、快速、可靠的组织原代分离培养方法。     

不同培养条件下牙周韧带细胞矿化能力的比较研究

目的：探讨牙周韧带细胞体外常规状态及矿化诱导下钙化特性的差异。方法：用组织块培养法进行人牙周韧带细胞的原代培养，取第4代细胞用于实验，在体外长期培养，条件培养组加入矿化诱导液，常规培养组不加任何矿化诱导因素，倒置显微镜下观察矿化情况，茜素红与Von-Kossa染色显示钙盐沉积。结果：牙周韧带细胞在体外长期培养过程中，两组均表现为融合期、复层期、结节期、矿化期，形成肉眼可见的白色结节，茜素红与Von-Kossa染色均显示结节内有钙盐沉积。但常规培养组矿化所需的时间要比条件培养组长1周左右。结论：牙周韧带细胞在体外长期培养过程中，无论有无矿化诱导因素存在，均具有向矿化组织形成细胞分化的趋势，但矿化诱导因素的存在可以促进矿化结节的早期形成。     

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目的探讨丝素胶原支架用作牙周组织工程支架材料的可行性。方法本研究于2008年9月在辽宁医学院实验中心进行。通过冻干法制备丝素胶原支架,用扫描电镜(SEM)观察、噻唑蓝(MTT)法及碱性磷酸酶(ALP)活性检测,了解人牙周膜成纤维细胞(PDLF)附着于丝素胶原支架的生长情况,评价其生物相容性。结果制备的复合膜孔隙率为80.7%;PDLF在材料浸提液中的生长、增殖状况与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性与对照组相比差异亦无统计学意义(P>0.05)。SEM观察可见复合材料具有良好的多孔网状结构,细胞在各复合膜上生长旺盛,伸展充分,形成良好。结论通过冻干法自制的丝素胶原复合物的孔隙率符合牙周组织工程的要求。其良好的三维空间结构和细胞相容性促进了PDLF的生长、黏附及增殖,且无细胞毒性,有望成为牙周组织工程的支架材料。     

牙周韧带细胞与成骨样细胞的体外共培养

目的：探讨牙周韧带细胞(periodontal ligament cell，PDLC)和成骨样细胞的相互作用。方法：牙周韧带来源的PDLC和骨髓基质来源的成骨样细胞(osteoblast like cell，BC)进行体外套皿共培养，通过细胞增殖、蛋白质合成和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPase)活性来分析细胞间相互作用。结果：PDLC较成骨样细胞增殖快，共培养条件对细胞增殖无显著影响；共培养对PDLC蛋白质合成没有影响，但对成骨样细胞蛋白质合成有影响；在共培养条件下，PDLC上调ALPase活性，成骨样细胞下调ALPase活性。结论：在共培养体系中，PDLC和成骨样细胞存在相互作用，两者的分化趋势受到相互诱导。     

雌激素对牙周膜细胞生物学性质的影响

目的：明确雌激素对体外牙周膜成纤维细胞迁移、增殖和碱性磷酸酶的影响，以探讨雌激素对牙周组织改建的影响。方法：SD大鼠来源的牙周膜成纤维细胞经传代培养至第四代，建立体外创伤模型，分别在普通培养基和含雌激素的培养基中培养，观察测量细胞迁移情况，运用MTT、酶联检测仪测定细胞的增殖速度，对细胞的ALP进行提取和测定。结果：MTT结果硅示加入雌激素对该细胞的增殖无明显影响；在含雌激素的培养基中成纤维细胞的迁移速度加快；同时牙周膜成纤维细胞的ALP表达娃著提高。结论：雌激素能明显促进牙周膜成纤维细胞的迁移，促进其分化。     

苯妥英钠对人牙周膜成纤维细胞生物学活性影响的实验研究

目的研究苯妥英钠（PHT）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）生物学功能的影响,并探讨其用于促进牙周组织再生的可能性。方法将不同质量浓度的PHT（1、5、20、100、500、2 500 mg/L）加入体外培养的第4代hPDLF,检测其对细胞增殖活性、蛋白合成、碱性磷酸酶（ALP）活性的影响;Von Kossa染色法检测PHT（20、100、500 mg/L）对第4代hPDLF矿化结节形成能力的影响;应用ELISA法测定PHT（20、100 mg/L）对第3代hPDLF中骨形态发生蛋白- 2（BMP- 2）表达的影响。结果在20、100 mg/L的质量浓度时,PHT可显著促进hPDLF的增殖及分化（P<0.01）;在质量浓度100 mg/L时,PHT可增强hPDLF的蛋白合成（P<0.05）;同时,PHT在质量浓度100 mg/L可显著促进hPDLF的矿化能力及BMP- 2的表达（P<0.01）。但高质量浓度（2 500 mg/L）的PHT则严重抑制细胞的生物学活性。结论适当质量浓度的PHT对hPDLF的增殖和分化有促进作用,但过高质量浓度的PHT具有细胞毒性,不利于牙周组织的修复和再生。     

3种髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞毒性的体外研究

目的对三氧化矿物凝聚体（MTA）、Z350纳米复合树脂、银汞合金3种常用髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）毒性进行体外比较研究。方法采用甲基噻唑基四唑（MTT）法研究3种材料对HPDLF增殖的影响,并采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法研究材料对细胞碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OC）mRNA表达的影响。结果MTA的毒性最小,并能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达;Z350的毒性级为1级,能够促进细胞ALP mRNA的表达,对细胞OC mRNA的表达基本无抑制;银汞合金对细胞增殖的抑制作用最大,毒性级为3级,具有中度细胞毒性,对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制最强。结论MTA对HPDLF的毒性最小,并且能促进HPDLF的成骨功能和分化,Z350纳米复合树脂次之,银汞合金的毒性最大,并抑制牙周膜成纤维细胞的分化。     

Expression of fibrillins and tropoelastin by human gingival and periodontal ligament fibroblasts in vitro

The elastic system fibers consist of three different types, oxytalan, elaunin and elastic fibers, which differ in the relative content of microfibrils and elastin. In periodontal tissues, oxytalan fibers are known to be distributed in the periodontal ligament and gingiva, while elaunin and elastic fibers are present only in the gingiva. We examined the in vitro synthesis of microfibrils and elastin by human gingival fibroblasts (HGF) and periodontal ligament fibroblasts (HPLF). The two kinds of HGF and HPLF were cultured in MEM containing 10% newborn calf serum for 30 days. Since fibrillin-1 and fibrillin-2 are the major components of microfibrils involved in elastogenesis, we investigated the synthesis of fibrillins and tropoelastin in the conditioned medium of HGF and HPLF. Western blot analysis revealed fibrillin-1 and fibrillin-2 to occur in the HGF and HPLF culture medium, HGF exhibiting a higher level of synthesis than HPLF. Tropoelastin, on the other hand, was detected only in the medium of HGF after day 24. In addition, analysis of RNA extracted from HGF and HPLF on day 30 showed that only HGF expressed mRNA encoding tropoelastin. Immunohistochemically, accumulation of tropoelastin in the perinuclear area was found only in HGF. These results show that HGF expressed microfibrils and elastin, while HPLF expressed only microfibrils for the experimental period, and suggest a biochemical basis for the different distribution of elastic system fibers of the gingiva and periodontal ligament in vivo.