与内皮抑制素相互作用的蛋白及其抑制血管生成作用的分子机制

目的:探讨与内皮抑制素相互作用的蛋白,阐明其抑制血管生成作用的分子机制。方法:实验于2002-01/2004-12在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。应用酵母双杂交系统3,以内皮抑制素为诱饵,筛选人肝cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白。再利用一对一酵母回复性杂交、β-GAL实验和生物信息学分析技术筛除假阳性克隆。结果:成功构建稳定表达内皮抑制素基因的载体;酵母双杂交共获得281个克隆,经验证,6个为阳性克隆,测序发现其中一个克隆为未知序列;FASTCAT试验发现阳性克隆中4个克隆可明显的与内皮抑制素相互作用。结论:6个阳性克隆表达的蛋白可能能与内皮抑制素相互作用,并不同程度的参与了内皮抑制素调节的血管生成过程。     

内皮抑制素相互作用蛋白HT036基因的全长克隆及其促血管上皮细胞凋亡的分子机制

目的：克隆与内皮抑制素（endostatin）相互作用蛋白HT036基因的全长，进一步验证其与内皮抑制素的相互作用，初步阐明其促血管上皮细胞凋亡的分子机制。 方法：实验于2004—10／2006-03在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。①根据已知HT036的EST序列设计引物。应用RACE技术，从人胎肝cDNA文库获取该基因全长。②采用免疫共沉淀和Western Blot验证HT036蛋白与内皮抑制索在真核细胞内存在相互作用。③利用真核瞬时表达载体pCDNA3．1（＋）在EVC304细胞中瞬时表达HT036蛋白，转染了HT036基因的EVC304细胞为试验组（重复两次）；没有转染HT036基因的细胞为对照组，用流式细胞仪检测HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响。 结果：①HT036基因全长克隆及生物信息学分析结果：利用RACE技术成功获得HT036基因的全长，并在GENEBANK进行了注册，注册号AY775560。②免疫共沉淀和Western—blot的验证结果：证实HT036蛋白能与内皮抑制素在真核细胞中相互作用。③HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响：成功构建了表达HT036基因的真核表达载体，两次试验转染ECV304细胞后24h的凋亡率平均为23．63％，而对照组仅为0．10％。 结论：获得了一与内皮抑制紊相互作用的新的蛋白HT036基因的全长，初步表明HT036参与了内皮抑制索调节的血管生成过程，并对血管上皮细胞具有促进凋亡的作用。     

内皮抑制素相互作用蛋白HT036基因的全长克隆及其促血管上皮细胞凋亡的分子机制

目的:克隆与内皮抑制素(endostatin)相互作用蛋白HT036基因的全长,进一步验证其与内皮抑制素的相互作用,初步阐明其促血管上皮细胞凋亡的分子机制。方法:实验于2004-10/2006-03在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。①根据已知HT036的EST序列设计引物,应用RACE技术,从人胎肝cDNA文库获取该基因全长。②采用免疫共沉淀和WesternBlot验证HT036蛋白与内皮抑制素在真核细胞内存在相互作用。③利用真核瞬时表达载体pCDNA3.1( )在EVC304细胞中瞬时表达HT036蛋白,转染了HT036基因的EVC304细胞为试验组(重复两次);没有转染HT036基因的细胞为对照组,用流式细胞仪检测HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:①HT036基因全长克隆及生物信息学分析结果:利用RACE技术成功获得HT036基因的全长,并在GENEBANK进行了注册,注册号AY775560。②免疫共沉淀和Western-blot的验证结果:证实HT036蛋白能与内皮抑制素在真核细胞中相互作用。③HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响:成功构建了表达HT036基因的真核表达载体,两次试验转染ECV304细胞后24h的凋亡率平均为23.63%,而对照组仅为0.10%。结论:获得了一与内皮抑制素相互作用的新的蛋白HT036基因的全长,初步表明HT036参与了内皮抑制素调节的血管生成过程,并对血管上皮细胞具有促进凋亡的作用。     

血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的：构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法：实验于2004—02／12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成，表达质粒由中山大学医药分子实验室保存，肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因，连接PGEN-T载体，在16℃下以进行16h连接反应，转化大肠杆菌DH5α，对所获克隆扩大培养，提取质粒经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切鉴定。将带有插人片段的重组质粒命名为PGEN-Tendo。对其阳性克隆扩大培养，大量提取质粒，以T7，SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEN-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切后定向连接，转化人大肠杆菌DH5α，聚合酶链反应鉴定阳性克隆，命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养，经42℃热诱导4h后收菌，对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎，将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果：反转录-聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp。用EeoRⅠ，BamHⅠ双酶切，10g／L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEN-T载体片段，说明内皮抑素已成功构建在PGEN-T载体上。经全自动正、反向测序，Genbank分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因，该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A，但编码的氨基酸都是精氨酸，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，出现特异性蛋白质条带，大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达，表达量为14．5％。结论：克隆的552bp的内皮抑素基因，经与GenBank中人胶原ⅩⅧcDNA中内皮抑素基因比较，基因序列基本一致，说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达，为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

重组内皮抑制素抑制大鼠角膜移植术后的新生血管

目的:内皮抑制素是一种内源性血管内皮细胞的强效抑制剂,实验拟验证局部应用重组内皮抑制素滴眼液对大鼠角膜移植术后新生血管的抑制作用.方法:实验于2005-09/2006-03在重庆医科大学附属第一医院实验动物中心完成.①选用清洁级成年雌性SD大鼠(受体)60只,Wistar大鼠(供体)30只,建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,供体提供双眼角膜,受体均选择右眼手术.移植术后按随机数字表法分成内皮抑制素组和对照组,分别用50mg/L的内皮抑制素眼液及赋形剂滴眼.②于术后1周、2周、3周、1个月及2个月5个时间点,麻醉后每组随机处死6只大鼠.观察角膜新生血管生长状况;比较各组角膜植片透明度、水肿、新生血管程度及移植排斥反应指数;检测角膜植片上内皮抑制素及血管内皮生长因子的表达情况.结果:60只受体大鼠全部进入结果分析.①内皮抑制素组大鼠角膜新生血管面积显著低于对照组(P＜0.05～0.01).②内皮抑制素组大鼠的排斥反应指数在术后1周、2周、3周、1个月及2个月均低于对照组(P＜0.05～0.01).③与对照组相比,内皮抑制素组角膜植片组织中内皮抑制素的表达明显增强(P＜0.05～0.01),血管内皮生长因子的表达明显降低(P＜0.05～0.01).结论:内皮抑制素滴眼液可以有效抑制大鼠角膜移植术后角膜新生血管的形成,下调角膜植片中血管内皮生长因子的表达,从而降低角膜移植术后免疫排斥反应的发生,为临床防治角膜移植术后新生血管提供了新的思路.     

利用酵母双杂交研究与Ca~(2 )CRAC通道Orail相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orail发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制。方法:以Orail-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用。结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析,发现了其中一个感兴趣的蛋白。结论:Orail可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关。     

一个phiC31相互作用的蛋白:人锌指蛋白403功能分析

背景:phiC31是重要的基因治疗工具酶,其与细胞内蛋白的相互作用可能影响细胞内各种通路,从而关系到基因治疗的安全性.目的:构建锌指蛋白403基因原核表达载体,观察其在真核细胞的表达情况.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-10/2008-12在复旦大学遗传工程国家重点实验室完成.材料:大肠杆菌DH5a菌株及大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均为实验室保存.方法:用pLexA-phiC31作为"诱饵",对人胎脑cDNA文库通过酵母双杂交进行筛查,分离阳性克隆.对锌指蛋白403基因构建原核表达载体并纯化鉴定.脂质体介导真核细胞进行转染并细胞定位观察.主要观察指标:锌指蛋白403的原核表达载体的构建、纯化及在真核细胞细胞质中定位的结果.结果:酵母双杂交进行筛查后分离61个阳性克隆中,有1个包含17号染色体17q12上的基因序列,其具有一个锌指结构,故名锌指蛋白403.成功构建了锌指蛋白403的原核表达载体,并纯化组氨酸标记的锌指蛋白403.在真核细胞中,构建了绿荧光融合载体,证明了此蛋白在细胞质中的定位.结论:实验结果发现了一个新的phiC31整合酶相互作用蛋白,成功构建了znf403基因的原核表达载体,znf403蛋白主要在细胞质中聚集和分布.     

体外重组内皮抑素及其抑制肿瘤血管生成机制探讨

目的克隆及表达中国昆明种小鼠的内皮抑素（endostatin）基因。方法RT-PCR方法扩增鼠内皮抑素基因，构建温敏型表达载体pBV220-endostatin，在大肠杆菌DH5“中诱导表达出鼠内皮抑素蛋白。结果筛选出pBV220-endostatin阳性克隆菌株，诱导表达外源蛋白内皮抑素，纯化复性后具有一定生物学活性。结论克隆小鼠内皮抑素基因，重组内皮抑素在大肠杆菌中高效表达，复性后具有抑制血管生长活性。     

利用酵母双杂交研究与Ca2+CRAC通道Orai1相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orai1发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制.方法 :以Orai1-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质, 运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用.结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析, 发现了其中一个感兴趣的蛋白.结论:Orai1可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关.     

血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的:构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法:实验于2004-02/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成,表达质粒由中山大学医药分子实验室保存,肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,在16℃下以进行16h连接反应,转化大肠杆菌DH5α,对所获克隆扩大培养,提取质粒经EcoRI,BamHI酶切鉴定。将带有插入片段的重组质粒命名为PGEM-Tendo。对其阳性克隆扩大培养,大量提取质粒,以T7,SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEM-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRI,BamHI酶切后定向连接,转化入大肠杆菌DH5α,聚合酶链反应鉴定阳性克隆,命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养,经42℃热诱导4h后收菌,对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎,将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果:反转录—聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp,用EcoRI,BamHI双酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEM-T载体片段,说明内皮抑素已成功构建在PGEM-T载体上。经全自动正、反向测序,Genbank分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因,该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A,但编码的氨基酸都是精氨酸,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,出现特异性蛋白质条带,大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达,表达量为14.5%。结论:克隆的552bp的内皮抑素基因,经与GenBank中人胶原XVIIIcDNA中内皮抑素基因比较,基因序列基本一致,说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感,不同性别孤独感发生率无差异性,不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）;随年级增加,孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970,P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题,老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童,以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。