干扰素对KBv200细胞多药耐药性逆转的研究

目的：探讨不同浓度的干扰素（IFN-a）对人口腔表皮癌细胞株KB及多药耐药细胞株KBv200的影响。方法：以MTT法测定梯度浓度的干扰素及长春新碱（VCR）对细胞毒性变化。以流式细胞仪测定IFN-a作用后肿瘤细胞对罗丹明蓄积作用的变化及P-膜糖蛋白（Pgp）的变化。用RT-PCR法检测多药耐药基因（mdr-1）mRNA。结论：高浓度IFN-a(10000IU/ml）能明显抑制KB/KBv200细胞的增殖作用。低浓度IFN-a(1000IU/ml）能增强VCR对耐药细胞KBv200的杀伤作用,增加KBv200细胞对罗丹明的蓄积,下调Pgp和mdr-1 mRNA表达,对敏感细胞KB无作用。结论：IFN-a对KBv200细胞的多药耐药性有明显的逆转作用,且在一定浓度范围内有剂量依赖性,其机制是通过下调Pgp和mdr-1 mRNA表达逆转多药耐药性。     

多药耐药基因mdr-1在肝门部胆管癌组织中的表达及其意义

目的：检测肝门部胆管癌新鲜组织中多药耐药基因（ｍｄｒ－１）ｍＲＮＡ表达，探讨其与肝门部胆管癌临床病理间的关系。方法应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对２６例术前未作治疗的肝门部胆管癌，１２例正常胆管组织的ｍｄｒ－１ ｍＲＮＡ表达进行了检测，并与癌组织的分化程度，病理类型、部位、浸润转移作对比研究。结果：２６例肝门部胆管癌组织中ｍｄｒ－１ ｍＲＮＡ的阳性表达率为６５．４％（１７／２６），正常胆管     

食管癌多药耐药基因和多药耐药相关蛋白基因的研究

目的：探讨食管癌组织中多药耐药基因（ｍｄｒ－１）和多药耐药相关蛋白基因（ｍｒｐ）表达的意义。方法：运用逆转录－多聚酶链反应（ＰＴ－ＰＣＲ）技术检测了３２全 管癌患者的癌组织标本及癌旁组织中ｍｄｒ－１、ｍｒｐ表达,分析其与肿瘤分化程度,浸润深度及淋巴结转移的关系。结果：３２例食管癌组织中ｍｄｒ－１、ｍｒｐ表达的阳性率均高于癌旁组织（Ｐ〈０．０１,Ｐ〈０．０２５）,两基因的表达水平也显著高于癌旁组织（     

8-氯腺苷通过磷酸化修饰提高转录因子CREB的活性

背景与目的：8－氯腺苷是国内新近研发的抗肿瘤药物,其分子作用机制尚未完全阐明。本实验研究该药对HL－60细胞转录因子cAMP应答元件结合蛋白（cAMP-response-element-binding protein,CREB)活性的影响及其相关机制。方法：应用MTT法检测8－氯腺苷对人早幼粒细胞白血病细胞株HL－60的半数抑制浓度（IC50）,用蛋白印迹实验（Western blot analysis)检测药物作用不 时间CREB蛋白水平和CREB磷酸化水平,用凝胶阻滞实验（Cel shift assay)检测药物作用不同时间CREB与DNA的结合水平。结果：（1） 8－氯腺苷对HL－60细胞的IC50约为0．42umol/L.(2)8-氯腺苷快速诱导CREB磷酸化,30min达到最高水平,6h恢复至基础水平,CREB蛋白水平在药物作用期间保持恒定。（3）8－氯腺苷不改变CREB与DNA结合能力,结论：8－氯腺苷诱导CREB转录因子活性的提高依赖于CREB磷酸化水平的提高,而与CREB蛋白水平及CREB与DNA的结合水平无关。     

8-氯腺苷增强肿瘤细胞对TRAIL杀伤作用敏感性的研究

目的研究8-氯腺苷（8-Cl-Ado）增强肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（TARIL）杀伤作用的敏感性及其分子机制。方法以重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（rsTRAIL）和（或）8-Cl-Ado处理乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞BEL-7402,以MTT比色法测定细胞存活率,分析药物处理对细胞凋亡的影响;构建NF-KBDNA结合序列虫荧光素酶报告质粒,并转染适当的细胞株,测定NF-KB的转录活性;以不同胱天蛋白酶的抑制剂预处理所试细胞株,再加入rsTRAIL处理,测定胱天蛋白酶抑制剂对细胞凋亡的影响。结果8-CI-Ado显著增强了乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞BEL-7402对rsTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性;8-CI-Ado与rsTRAIL联合可使肝癌细胞株BEL-7402内NF-KB活性下降,从而促进细胞凋亡,而住乳腺癌细胞株MCF-7中未观察钊相同的现象;胱天蛋白酶家族抑制剂对BEL-7402细胞的凋亡无影响,但可显著抑制MCF-7细胞的凋亡,但胱天蛋白酶-3、-9和-8的特异性抑制剂对MCF-7细胞株的生长均无影响。结论8-CI-Ado可显著增强乳腺癌和肝癌细胞对rsTRAIL细胞毒作用的敏感性,在此两种细胞中,8-Cl-Ado与rsTRAIL联合作用可分别激活胱天蛋白酶依赖的和非依赖的细胞凋亡信号途径。     

应用RT-PCR方法定量分析大肠癌患者多药耐药基因表达水平及其临床意义

目的：探讨大肠癌患者多药耐药与组织学分级和临床病理学Ｄｕｋｅｓ分期之间的关系。方法：采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测了６０例大肠癌患者肿瘤组织的ｍｄｒ－１表达水平,同时检测了其中２０例大肠癌患者的正常大肠组织作为对照。结果：高、中、低分化大肠癌组织之间ｍｄｒ－１表达水平具有极显著差异,大肠癌组织和正常大肠组织之间ｍｄｒ－１表达水平具有极显著差异,Ｄｕｋｅｓ分期的不同期之间ｍｄｒ－１表达水平无显著差异。结论：临床检测大肠癌患者ｍｄｒ－１基因的表达,可以预测患者对化疗的敏感性,从而进行有针对性的治疗,使化疗个体化。     

mdr-1特异性核酶逆转卵巢癌的多药耐药

目的：探讨卵巢癌多药耐药的机制及应用核酶对阿霉素(ADM)引起的多药耐药(MDR)的逆转。方法应用共聚焦激光显微镜(confocal)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)等检测卵巢癌细胞株A2780及阿霉素耐药株A2780／ADM多药耐药基因(mdr-1)及其编码的p-糖蛋白(p-gp)的表达,并比较导入mdr-1特异性核酶后A2780／ADM细胞MDR表型的改变。结果：A2780／ADM细胞对ADM的耐药性是A2780细胞的8．43倍。A2780／ADM细胞中mdr-1基因和p-gp表达较A2780细胞增高,转染mdr-1核酶基因后,A2780／ADM细胞的mdr-1 mRNA和p-gp表达明显下降。结论:ADM所致的卵巢癌细胞MDR与mdr-1基因过度表达有关,应用mdr-1核酶能在一定程度上逆转A2780／ADM细胞的MDR。     

抗APO—1单抗诱导人膀胱癌多药耐药细胞凋亡的研究

目的：探讨人膀胱癌多药耐药细胞凋亡诱导途径。方法：应用免疫细胞化学、原位ＤＮＡ末端转移酶标记法、相差显微镜及电镜技术,观察ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞表面Ｆａｓ抗原的表达和抗ＡＰＯ－１单抗对该细胞存活的影响及其特征。结果：Ｆａｓ抗原在ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ中有高表达,经抗ＡＰＯ－１单抗作用后,ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞存活率明显降低,光镜及电镜下观察到凋亡细胞的形态学改变,原位ＤＮＡ末端转移酶标记阳性。结     

8－氯腺苷的抗肿瘤作用研究

采用国内合成的８－氯腺苷经体内、外实验研究，结果表明，用１００ｍｇ·ｋｇ￣（－１）·ｄ￣（－１）×７剂量，可使小鼠肝癌实体瘤Ｈ＿２２抑制率达７１．７％±１３．３％腹腔注射（ｉｐ）和６６．１％±４．４６％静脉注射（ｉｖ），使白血病Ｌ１２１０荷瘤小鼠的生命延长率达１２４．Ｏ％±２２．１％（ｉｐ）和１０４．２％±２０．１％（ｉｖ）。体外实验显示，８－氯腺苷对人白血病细胞系ＨＬ－６０和Ｋ＿５６２以及人胃癌细胞系ＭＧＣ８Ｏ－３均有明显抑制生长作用，其ＩＣ＿５０值分别为：１．８μｍｏｌ／Ｌ、４．２μｍｏｌ／Ｌ和１．５６μｍｏｌ／Ｌ。该药采用腹腔一次注射测定小鼠的ＬＤ＿５０为：１０２５．０±５２．４ｍｇ／ｋｇ；大鼠的ＬＤ＿５０为：７９３．４±７０．７ｍｇ／ｋｇ，表明其急性毒性很低。     

8-氯腺苷对HL-60细胞中蛋白酶体活性的抑制作用

背景与目的:蛋白酶体是真核细胞中具有多相催化活性的蛋白酶复合体,国外报道,蛋白酶体可作为新靶点来筛选抗肿瘤药物。8-氯腺苷(8-chloroadenosine,8-CA)由本室合成,研究已证实8-CA对肉瘤细胞株S180、肝癌细胞株H22及人胃癌异种移植瘤生长有抑制作用。但8-CA抑制肿瘤生长与蛋白酶体的关系还不清楚。本研究拟探讨8-CA对人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60中20S蛋白酶体的三种酶活性(包括糜蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性、多肽-谷氨酰-多肽水解酶活性)的影响。方法:不同浓度的8-CA作用于HL-60细胞24、48、72h后,提取细胞总蛋白,分别检测总蛋白提取液中20S蛋白酶体的三种酶活性,并采用免疫沉淀法测定纯化蛋白酶体的糜蛋白酶样活性,酶活性均以特异底物被蛋白酶体水解后产生的荧光吸光度表示。结果:0.1μmol/L8-CA作用于HL-60细胞48h,对总蛋白提取液中20S蛋白酶体的三种酶活性均有显著抑制作用,并且随着8-CA浓度的增加,其抑制作用逐渐增强。5μmol/L8-CA作用48h,对糜蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性、多肽-谷氨酰-多肽水解酶活性抑制率分别为44.96%、54.52%和48.36%;作用72h,对三种酶活性的抑制率分别为67.53%、70.48%和64.08%。1μmol/L和5μmol/L8-CA作用48h,对HL-60中蛋白酶体的糜蛋白酶样活性抑制率分别为68.14     

凋亡素诱导人成骨肉瘤细胞多药耐药株凋亡的研究

目的研究凋亡素对人成骨肉瘤细胞0S-732多药耐药株R-OS-732的作用.方法凋亡素基因VP3经酶切后克隆入质粒pIRES1,获得重组质粒pIRVP3,通过脂质体法pIRVP3转染R-0S-732细胞,RT-PCR检测凋亡素在细胞中的表达;光镜及电镜下观察瘤细胞;提取瘤细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳;流式细胞仪检测凋亡率.结果凋亡素基因已在转录水平表达;光镜及电镜下两组细胞形态变化明显;电泳见转染组DNA呈梯状条带,对照组为单一条带;转染组凋亡率明显高于空白对照组(P＜0.01).结论凋亡素可有效诱导R-OS-732细胞凋亡.     

多药耐药基因、谷胱甘肽S-转移酶特异性siRNA逆转K562／A02细胞多药耐药.

 目的　研究多药耐药基因（mdr1）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTπ）特异性siRNA逆转K562／A02细胞多药耐药性。方法　以mdr1 mRNA第79～99和GSTπmRNA第308～327核苷酸为作用靶点，合成针对靶区域序列的siRNA，克隆入pSilence2.1-U6 neo，克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ，脂质体介导下转染K562／A02细胞。用实时荧光定量PCR检测K562／A02细胞 mdr1和GSTπ mRNA的表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；MTT法检测多柔比星的半数抑制浓度（IC50）。结果　经酶切、测序分析表明，成功构建siRNA真核表达载体。经pSilence-mdr1转染后的K562／A02细胞株mdr1 mRNA表达量下降了71.5 %，从（2.8±1.65）×108拷贝／μg RNA下降至（3.9±2.37）×107拷贝／μg RNA（P＜0.01）；同时pSilence-GSTπ 作用后，K562／A02细胞 GSTπmRNA表达量较显示空载体pSilence2.1-U6 转染组下降了39.8 %，从（2.3±1.14）×105拷贝／μg RNA下降至（5.4±2.45）×104拷贝／μg RNA（P＜0.01）；流式细胞仪显示空载体pSilence2.1-U6 转染组细胞凋亡率为（11.65±4.06）%，pSilence-mdr1和 pSilence-GSTπ共转染组细胞凋亡率为（44.98±11.27）%（P＜0.01）；空载体转染组耐药指数为23，pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ共转染组耐药指数降低为7，IC50值从转染前的（1.16±0.38）mmol／ml下降为（0.33±0.04）mmol／ml（P＜0.01）。结论　siRNA 真核表达载体pSilence-mdr1、pSilence-GSTπ对K562／A02细胞株多药耐药性具有明显的下调作用。     

贲门癌组织中多药耐药基因和多药而药相关蛋白基因表达的临床

目的 了解多药耐药基因（ＭＤＲＩ）和多药耐药相关蛋白基因（ＭＲＰ）在贲门癌组织中的表达及其临床意义。方法 采用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,检测了５６例贲门癌及癌旁组织中ＭＤＲＩ和ＭＲＰ的表达。结果 癌组织 ＭＤＲＩ和ＭＲＰ表达的阳性率分别６３％和５０％,均高于癌旁组织（Ｐ〈０．０５）有化疗的ＭＤＲ１ ｍＲＮＡ和ＭＤＲ１和ＭＲＰ表达的水平高于未化疗者（Ｐ〈０．０５）;中低分化肿瘤的的ＭＤ     

非小细胞肺癌多药耐药基因表达及环孢菌素A对其逆转作用

研究非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者多药耐药基因（ＭＤＲ１）表达与化疗疗 间的关系,观察环孢霉素逆转ＭＤＲ１的疗效及毒性。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测４６例ＮＳＣＬＣ患者肿瘤细胞和外周血淋细胞ＭＤＲ１表达,根据检测结果将患者分成ＭＤＲ１阳性逆转组、ＭＤＲ１阳性对照组和ＭＤＲ１阴性组。所有患者接受至少２个周期的化疗,阳性逆转组患者在化疗同时给予ＣｓＡ,剂量为４ｍｇ／ｋｇ。结果肿瘤细胞同阳性率为６５．２     

通过小干扰RNA沉默mdr-1基因逆转卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL多药耐药的研究

 目的　构建靶向于卵巢癌耐药细胞株中高表达的多药耐药-1（mdr-1）基因的短发夹状RNA重组质粒,探讨RNAi沉默技术逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞多药耐药的可行性。方法　运用基因克隆技术构建靶向于mdr-1基因的重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1并转染至卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL,反转录聚合酶链反应检测到mdr-1基因表达。CCK-8检测对SKOV3／TAXOL细胞增殖的抑制作用。结果　构建的重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1能明显抑制mdr-1基因的表达。蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1的SKOV3／TAXOL靶细胞的抑制率显著提高。RT-PCR检测mdr-1基因mRNA转录水平下降;pPGPU6／GFP／Neo-mdr-1明显抑制SKOV3／TAXOL细胞的增殖。结论　重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1可有效地抑制SKOV3／TAXOL细胞内源mdr-1基因的表达和mRNA的转录,并抑制细胞的增殖和促进凋亡的发生,应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药。为化疗耐受的肿瘤细胞提供了新的基因治疗手段。     

苦参碱对KB及其多药耐药细胞KBv200增殖与凋亡影响的对比研究

目的: 研究中药苦参提取物苦参碱对体外培养的口腔上皮癌KB细胞和具有多药耐药特征的KBv200细胞增殖和凋亡的影响. 方法: 以MTT法对比观察苦参碱对细胞存活率的影响;以吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)双荧光染色检测细胞凋亡率;流式细胞术分析苦参碱对细胞周期的影响;扫描电镜观察苦参碱作用后的细胞形态学变化. 结果: 苦参碱浓度在0.50、1.00、1.50、2.00mg/ml时,均有抑制KB及KBv200增殖的作用,其半数抑制浓度(IC50)分别为1.35mg/ml和1.43mg/ml;双荧光染色及流式细胞术提示苦参碱可诱导KB及KBv200细胞凋亡,使细胞生长停滞在S期;扫描电镜观察发现不同浓度的苦参碱作用24h后,细胞出现体积缩小、细胞质空泡化、细胞核碎裂等凋亡现象.苦参碱对两种细胞增殖和凋亡的影响均未见明显差异(P>0.05). 结论: 苦参碱对KB及多药耐药的KBv200细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用.提示苦参碱可克服肿瘤的多药耐药现象,故有可能成为一种理想的中药抗肿瘤制剂.     

乳腺癌耐药细胞中mdr-1与mrp基因的表达及As2O3对其表达的影响

目的: 探讨人乳腺癌阿霉素（ADM）耐药细胞系MCF7/ADM的mdr1基因和mrp基因表达，观察三氧化二砷（As2O3）对上述基因表达的影响。方法:采用MTT法检测As2O3的细胞毒性及非细胞毒性剂量，应用RTPCR检测mdr1基因和mrp基因的转录表达。结果: As2O3的非细胞毒性剂量为0.2 μmol/L,低毒计量为0.8 μmol/L。mdr1基因和mrp基因在MCF7/ADM细胞中均呈过表达，而且mdr1的基因表达强于mrp基因，在MCF7/S细胞中未见表达。As2O3可下调上述基因的表达，而且As2O3低毒剂量的下调作用强于无毒剂量。结论:人乳腺癌MCF7/ADM细胞获得阿霉素抗药性，与mdr1基因和mrp基因过表达有关，As2O3可通过多种机制部分逆转MCF7/ADM细胞的耐药性。     

星形细胞上调基因1（AEG －1）介导肿瘤耐药的研究进展

星形细胞上调基因（Astrosyte elevated gene 1,AEG－1）具有促进癌症发生和发展的作用。AEG－1的过表达与血管生成、转移、及不同组织起源的癌细胞与各种化疗药物耐药有关。研究表明, AEG－1通过Ha－ras、myc、NF－κB及PI3K／Akt信号通路参与经典致癌途径。 AEG－1通过激活AMP激酶来促进自噬作用。另有研究指出, AEG －1调节耐药性是通过多药耐药基因（ Multidrug resistance , MDR1） mRNA表达增加多聚核糖体的负载量,从而促进MDR1蛋白翻译。近来证明AEG－1作为一种RNA结合蛋白潜在影响药物的敏感性和耐药基因的表达。 AEG－1耐药性的多重功能显示,它作为抗肿瘤药物的靶点,为肿瘤靶向治疗提供新的途径是可行的。本文主要就AEG－1在化疗药物耐药方面的作用做一综述。     

蛋白激酶C-α与KBV200细胞多药耐药相关性的初步研究

目的　探讨蛋白激酶C -α(PKC)与KBV 2 0 0肿瘤细胞多药耐药 (MDR )的关系及其机制。方法　应用3 2 P掺入法检测 2株细胞的PKC活性 ;用Westernblot法检测PKC -α在耐药株KBV 2 0 0及敏感株KB的表达及亚细胞分布 ;流式细胞仪检测PKC -α的荧光强度。结果　KBV 2 0 0细胞的PKC活性较KB细胞明显升高 ,且膜组分PKC活性所占总活性的百分率升高 ;PKC-α亚型的表达选择性升高 ;流式细胞仪检测发现KBV 2 0 0细胞的PKC -α的荧光强度 ( 5 .3 4± 0 .5 6)显著高于KB细胞PKC -α的荧光强度 ( 2 .0 7± 0 .2 1) ,P <0 .0 1。结论　PKC -α与KBV 2 0 0细胞株的MDR表型关系密切 ,PKC -α可能在KBV 2 0 0细胞的MDR表型中起重要作用。     

RNAi对白血病细胞mdr-1基因和多药耐药表型的影响

目的:探讨RNA干扰技术(RNAi)对慢性粒细胞白血病急变细胞系K562/AO2细胞mdr1基因的抑制和耐药表型的逆转作用。方法:选择合成封闭mdr-1基因的小干扰序列(si-MDR1),以1个碱基突变的si-MDR1-mut为对照序列,在脂质体介导下转染至K562/AO2细胞系。RT-PCR和Western blot检测mdr1 mRNA及P-gp蛋白水平,流式细胞术分析细胞内柔红霉素(daunorubicin,DNR)积累量,并以四甲基唑蓝快速比色法(MTT)反映K562/AO2对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙药物敏感性的变化。结果:实验证实该序列能高效封闭K562/AO2细胞内mdr-1基因表达,增加细胞内化疗药物DNR积累量,增强K562/AO2细胞对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙的敏感性。结论:RNAi可以通过抑制mdr1基因表达,逆转K562/AO2细胞耐药表型。