组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的 用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性.方法 应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周.未复合细胞的单纯材料作为空白对照.将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程.结果 体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限.单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞.结论 小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料.     

BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞体外复合培养

目的用生物活性玻璃BG/聚羟基烷酸酯PHBV复合多孔支架材料与骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外复合培养了解其生物相容性,为骨组织工程支架材料选择提供依据。方法:将体外培养的兔骨髓基质细胞诱导分化的成骨细胞,与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增长能力的测定,评价细胞与材料的相容性。结果:骨髓基质细胞有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力成骨细胞与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养8d,分布于支架材料的成骨细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质并形成钙结节。结论:骨髓基质细胞是骨组织种子细胞的良好来源BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞具有良好的生物相容性,是构建组织工程骨的一种理想支架材料。     

骨髓来源成骨细胞复合纳米晶羟基磷灰石胶原构建组织工程骨的实验研究

目的 :探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法 :分离培养兔骨髓间充质干细胞 ,诱导为成骨细胞后作为种子细胞 ,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养 ,复合物植入兔桡骨节段性缺损处 ,通过大体观察、HE染色及X线摄片了解成骨情况。结果 :兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增 ,能定向诱导为成骨细胞 ;复合物植入 16周后 ,X线摄片中可见桡骨缺损处连接良好。结论 :纳米晶羟基磷灰石胶原材料是组织工程骨的较好的支架材料。     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

高分子支架复合骨髓源成骨细胞体外培养的研究

目的 观察高分子支架对成骨细胞的增殖和成骨活性的影响.方法 将新西兰幼兔骨髓基质细胞经分离、体外培养及诱导获得的成骨细胞接种在盘状LDIG高分子支架上复合培养,同时以多孔聚乙醇酸材料作为对照,通过细胞计数、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶活性和扫描电子显微镜等手段检测成骨细胞增殖数量及成骨活性.结果 骨髓源成骨细胞在高分子支架上生长良好,其增殖数量及成骨活性均优于对照组.结论 用高分子材料制备的组织工程支架具有理想的多孔网状结构和良好的骨细胞相容性,可以用于构建组织工程骨.     

成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A—WMGC支架材料联合培养的实验研究

目的 研究多孔磁性硅灰石/磷灰石玻璃陶瓷载体A-WMGC支架(apatite-wollastonite magnetic glass ceramic,A-WMGC)作为组织工程骨支架的可行性.方法 体外培养兔骨髓间充质干细胞,在成骨诱导剂地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后A-WMGC支架复合,通过倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况.结果 地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原.A-WMGC支架具有合适的微孔结构,材料大孔孔径为300～400μm,且孔道相互贯通,体外复合培养10小时,成骨细胞即开始贴附于支架上,复合培养7天,成骨细胞在支架上分化增殖,分泌细胞外基质.结论 适当浓度成骨诱导剂可成功的将兔BMSCS成骨细胞诱导,修饰后A-WMGC支架是骨组织工程的良好载体.     

骨髓间充质干细胞成骨性能的实验研究

目的研究骨髓间充质干细咆的生物学特性以及作为组织工程骨种子细胞的特点。方法分离培养兔骨髓间充质干细胞，与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养，建立兔桡骨节段性缺损模型，分为空白组（n=8，不植入材料）、对照组（n=8，植入材料）、实验组（n=8，植入复合细咆的材料）。通过大体观察、组织学分析及X线摄片了解成骨情况。结果兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖，复合细咆的材料植入16周后，X线摄片可见桡骨缺损处连接良好。结论骨髓间充质干细胞具有很强的成骨作用，是一种较好的组织工程种子细胞。     

富血小板血浆诱导骨髓基质干细胞联合软骨支架治疗兔激素性股骨头坏死

目的 观察自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)诱导骨髓基质干细胞联合同种骨软骨支架治疗早期兔激素性股骨头坏死的疗效,探索早期股骨头坏死治疗的新方法.方法 采用含有抗凝剂的真空采血管从实验兔的耳中央动脉采取动脉血5 mL,再通过离心方法获取PRP,用16号骨髓穿刺针从实验兔自体股骨髓腔抽取骨髓5 mL,把抽取的骨髓进行密度梯度离心,获取兔骨髓基质干细胞,并进行细胞原代培养和成骨诱导.对已获取PRP和骨髓基质干细胞的实验兔进行激素性股骨头坏死造模,取同种股骨髁部骨软骨制作软骨支架,最后以制备的软骨支架为载体,将经过成骨诱导的骨髓基质干细胞移植到软骨支架上,形成细胞-支架复合物,用16号骨髓穿刺针对坏死的股骨头进行髓芯减压术,术中将细胞-支架复合物植入坏死的股骨头下.实验动物共分为4组,每组20只,A组为空白对照;B组仅进行髓芯减压;C组髓芯减压后植入经过成骨诱导培养的细胞;D组髓芯减压后植入细胞-支架复合物.实验后在第2、4、8周各组分别处死6、6、8只,每只实验兔的股骨头行大体标本及组织学检查.结果 D组治疗效果最显著,通过空骨陷窝计数发现D组与其他各组的差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓基质干细胞通过PRP的诱导向成骨细胞分化;软骨支架材料为骨髓基质干细胞向成骨细胞分化提供良好的空间结构,有利于其向成骨细胞分化;PRP和软骨支架材料联合应用可促进早期兔激素性股骨头坏死的修复.     

复合BMSCs的异种骨移植材料异位成骨研究

目的:制备兔脱钙骨基质(DBM),研究复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)的DBM的异位成骨能力。方法:制备DBM材料,将体外培养的ICR小鼠BMSCs与DBM复合培养后构建的组织工程骨植入ICR小鼠股部肌袋中,以单纯DBM植入组为对照,术后7d及28d行X线检测,并于术后7,14,28d取植入材料作组织学检测、钙含量测定。结果:DBM与BMSCs复合体植入后7d即有成骨细胞出现,随着时间增加成骨细胞增多,术后28d即有较成熟骨质形成,移植物钙含量随时间推移逐渐增高。单纯植入DBM术后14d出现少量成骨细胞,术后28d出现少量类骨质,钙含量持续处于较低水平。结论:DBM与BMSCs复合后具有很好的异位成骨能力,DBM是组织工程骨研究较理想的支架材料。     

双相接种技术构建组织工程骨的异位成骨观察

目的评价双相接种技术体外构建的组织工程骨在体内的成骨潜力和这种体外构建策略的可行性.方法8只山羊抽取自体骨髓体外扩增、定向成骨诱导,再分别采用静置接种法和双相接种法将羊骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)与脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)复合,复合培养5 d;将这两种方法构建的组织工程骨分别植入羊的背部肌袋内,同时植入单纯DBM作为阴性对照;术后2、8周取标本,进行大体观察、组织学染色检查和免疫组织化学检测.结果双相接种技术体外复合MSCs与DBM构建组织工程骨,细胞在支架上体外生长情况优于普通方法,植入山羊肌肉内术后2周观察到异位成骨,并随时间延长成骨量增加,其组织学半定量评分术后2周为(2.46±0.32)、8周为(4.13±0.42),明显优于普通方法的术后2周(1.96±0.21)、8周(3.66±0.37)(P＜0.01).植入后的组织工程骨材料边缘均可检测到BrdU标记阳性的细胞.单纯DBM植入未见成骨表现,亦无BrdU标记阳性的细胞.结论双相接种技术有利于组织工程骨在体内的成骨,是一种值得推广的组织工程骨体外构建技术.     

小肠黏膜下层复合骨髓间充质干细胞体外构建心肌组织薄片的实验研究

目的 探讨利用小肠黏膜下层（SIS）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外构建心肌组织薄片的可行性。方法 将自大鼠骨髓分离培养的BMSCs经5-氮胞苷（5-Aza）诱导培养3周后种植在经脱细胞处理的SIS浆膜面,在体外动态条件下共培养2周,构建组织工程心肌组织薄片,并进行病理组织学、超微结构和免疫组织化学染色观察。结果 与BMSCs体外共培养2周的SIS经苏木精-伊红（HE）染色显示,细胞在SIS上不只局限于材料表层,呈多层分布,部分细胞逐步向深层迁移和渗透。扫描电子显微镜观察发现,细胞较好地在SIS上黏附、生长和迁移,细胞分泌大量的细胞外基质。免疫组织化学染色结果显示,SIS上的细胞为表达α-actin、cTnⅠ和connexin-43的心肌样细胞。结论 在体外将SIS复合经5-Aza诱导的BMSCs,成功地初步构建出组织工程化心肌组织薄片。SIS是一种良好的心肌组织工程生物支架材料。     

PLGA/Ⅰ型胶原复合支架用于组织工程化骨再造的研究

目的:采用PLGA/Ⅰ型胶原复合改良生物支架,构建组织工程化骨组织.方法:采用Ⅰ型胶原和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)复合,制作改良的生物支架,将原代培养的成骨细胞接种于复合支架上,培养1周,扫描电镜观察成骨细胞在支架上的生长及黏附情况;同时,将细胞-支架复合体自体异位植入,并取材观察其成骨情况.结果:经鉴定,原代培养的细胞符合成骨细胞的特征;扫描电镜:在生物支架上大量成骨细胞呈簇状生长,并形成多个细胞突起;大体标本:4个月时可见骨块形成;自体异位植入后1个月可见新生骨组织形成,周围有多个活性成骨细胞和骨母细胞,至4个月时骨组织渐趋成熟.结论:Ⅰ型胶原和PLGA复合支架是一种理想的生物可降解支架,可用于组织工程化骨再造的研究.     

体外培养骨髓基质细胞在珊瑚羟磷灰石上生长的表面形态观察

目的 观察体外培养的骨髓基质细胞与珊瑚羟基磷灰石复合后的生长特性,论证珊瑚羟磷灰石作为骨组织工程学载体材料的可行性.方法 分离纯化的狗骨髓基质细胞与珊瑚羟基磷灰石复合体体外培养,分别在相差显微镜下、扫描电镜下观察细胞的表面形态结构.结果 骨髓基质细胞在珊瑚羟基磷灰石上贴附生长良好,功能正常.结论 骨髓基质细胞在珊瑚羟基磷灰石上生长增殖良好,珊瑚羟磷灰石是骨组织工程载体材料的可靠选择.     

骨膜成骨细胞与生物衍生骨材料联合培养的实验研究

目的探索山西省医用组织库生产的冻干人同种骨植入材料作为组织工程支架材料的可行性。方法取兔胫骨前骨膜的成骨细胞，传代培养后作为种子细胞与冻干人松质骨小粒在体外联合培养，通过倒置相差显微镜、光镜及扫描电镜观察，了解成骨细胞在人松质骨小粒支架材料中的生长情况。结果冻干人松质骨材料具有天然不规则网孔结构，体外复合培养3天，细胞贴敷伸展，个别部位有少量细胞增殖；培养1周，形成了由一层或几层细胞构成的细胞膜片，覆盖整个骨小梁网架表面；培养3周，所形成的细胞膜片已较厚，细胞表面有基质分泌。结论人同种骨为天然骨基质，具有良好的生物相容性及细胞吸附性，是细胞良好的载体材料，可作为骨组织工程中较好的支架材料。     

羟基磷灰石／壳聚糖复合微球的制备及其生物学作用的体外研究

目的：通过探究羟基磷灰石（HAp）壳聚糖（CS）复合微球支架对骨髓间充质干细胞体外生物学行为的影响,评估其作为骨组织工程支架的可行性。方法纳米 HAp 和CS 复合物通过微流体技术自组装成微球支架,显微镜下形态学观察。将 P2代骨髓间充质干细胞（BMSCs）与微球行体外共培养,计算前6 h 黏附率。培养1、3、6、9 d,计算增殖率并用 GraphPad Prism 6软件对数据进行处理;行扫描电镜及共聚焦扫描式显微镜检测,观察细胞黏附及分布。将细胞微球复合物填入自制模具中培养14～21 d,进行形态观察。结果显微镜镜下微球为完整的圆形,大小一致。BMSCs 与微球体外培养6 h,黏附率达90％以上。6 d 时,BMSCs 的增殖率达到最高。扫描电镜结果显示微球上有大量 BMSCs 黏附定植并分泌大量胞外基质将微球连接成整体;共聚焦扫描式显微镜结果可见明显的细胞骨架微丝蛋白。细胞微球体外模具培养18 d 后,形成了结构完整的组织块。结论HAp-CS 微球是一种良好的促BMSCs 种子细胞黏附定植的支架材料,是促进细胞生长的有效支撑载体,与共培养细胞形成的复合组织块有望应用于体内动物实验修复标准缺损。     

绿色荧光蛋白标记骨髓基质干细胞在恒河猴体内构建组织工程骨的示踪作用

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)标记恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC),以示踪其在体内参与组织工程骨形成的情况.方法 用OBI-293A细胞对腺病毒Ad5.CMV-GFP进行扩增,用Ad5.CMV-GFP转染rBMSc,将转染成功的第三代BMSc在转染后48 h消化制成细胞悬液,接种至块状可吸收HA上,体外培养3 d后,将其植入恒河猴(同体移植)背阔肌的肌袋内,以未转染GFP的BMSC用同样的方法接种块状可吸收HA上,作为对照,术后6周取材,4%的中性多聚甲醛固定,塑料包埋,制作骨磨片PI染色在激光共聚焦显微镜下进行观测.结果 转染GFP后,rBMSc仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低.48 h可见细胞发出强烈的荧光,呈全细胞分布,计数转染率达80%.在激光共聚焦显微镜下观察骨磨片,可见材料内有发出较强荧光的细胞结构,能同时被PI染液着色.结论 绿色荧光蛋白能有效示踪组织工程骨种子细胞,种人体内的BMSC是组织工程骨骨组织形成的主要细胞来源.     

兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨成骨实验研究

目的:探讨带部分松质骨的小牛皮质骨材料作为组织工程材料的可能,为该材料的临床应用提供实验依据.方法:分离兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs);BMSCs与带部分松质骨的小牛皮质骨复合培养,测定细胞黏附率及细胞毒性,应用电镜观察细胞在骨材料表面生长情况.并饲养3月龄新西...     

联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复兔桡骨缺损的实验研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸复合物（ Po （ yclactic - co - glycolic acid ）, PLGA ）支架作为组织工程骨支架修复骨缺损的可行性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）,在成骨诱导荆地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后PLGA支架复合,植入兔桡骨缺损模型,作为实验组。对照组a为PLGA材料对照,对照组b为空白对照,通过影像学观察骨缺损的修复情况。结果地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达I型胶原。应用多聚赖氨酸修饰的PLGA与成骨诱导的BMSCs复合植入骨缺损后,与对照组相比影像学显示明显促进骨缺损的愈合。结论适当浓度成骨诱导剂可成功的将免骨髓间充质细胞向成骨细胞诱导,诱导后细胞与PLGA支架联合应用可较好修复兔桡骨缺损。