CML中TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17亚家族sjTRECs的检测情况

目的检测慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血TCR Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的存在情况．从而了解相应3种Vβ亚家族naiveT细胞的近期胸腺输出情况．方法利用半巢式PCR扩增9例CML患者外周血单个核细胞（PBMC）、CD^4＋细胞和CD8^＋细胞DNA的Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs，13例正常人外周血作为对照．结果TCR Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在部分正常人和1例CML患者CD4^＋或CD8^＋细胞可以检测到，而在CML患者PBMC中则未能检测到．结论在CML患者Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs检出率低，与其胸腺输出相应的TCR Vβ亚家族naiveT细胞水平低下有关．     

TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在正常人胸腺、脐血和外周血中的检测情况

目的建立检测TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的方法,分析其在胸腺细胞、脐血和正常人外周血T细胞中的存在情况,从而了解近期胸腺输出相应的TCR Vβ亚家族naive T细胞的情况。方法利用半巢式PCR分别扩增3例正常胸腺细胞、10例脐血和10例正常人外周血单个核细胞DNA中的Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1基因片段重排时产生的sjTRECs。结果在正常胸腺细胞、脐血和正常人外周血单个核细胞中均可检测到Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1片段形成的sjTRECs,其中胸腺细胞和脐血单个核细胞DNA中3种删除环的检出率均为100％,正常人外周血3种删除环的检出率分别为50％、70％和40％。结论成功地建立检测3种Vβ-Dβ1 sjTRECs的方法,并提供了Vβ2、Vβ5和Vβ17亚家族sjTRECs在胸腺、脐血和外周血中的检测情况。     

AML患者外周血中TCR Vβ亚家族naive T细胞的检测

目的 检测急性髓性白血病(AML)患者外周血中TCR 23个Vβ亚家族的T细胞受体删除DNA环(sjTRECs)的存在特点,从而间接了解AML患者相应Vβ亚家族naive T细胞的近期胸腺输出情况.方法利用半巢式PCR分别扩增32例AML患者每5×104和1×104个外周血单个核细胞(PBMCs)中的23个Vβ亚家族sjTRECs,10例正常人外周血作为对照.结果在5×104和1×104两种PBMCs水平,AML患者检出sjTRECs的Vβ亚家族数分别为(5.09±3.28)和(2.59±2.06)个,与正常人的(13.70±2.67)和(5.50±2.07)个相比,两组的差异均有统计学意义(两组均为P=0.000).AML患者5×104个PBMCs中约可检测到5/23(20%)个Vβ亚家族sjTRECs,并且有13个Vβ亚家族sjTRECs的检出率明显低于正常人水平,其中Vβ10-和Vβ14-Dβ1 sjTRECs的检出率最低,而Vβ21最高.不同FAB分型AML患者间的检出差别未显示出统计学意义.32例AML患者检出sjTRECs的Vβ亚家族数量差别较大(1～15个),年龄与检出的亚家族数量呈负相关,＜30岁者的检出量高于≥30岁者,尤其在5×104个PBMCs水平差异有统计学意义(r=-0.481,P=0.005).结论 AML患者胸腺近期输出的23个Vβ亚家族naive T细胞存在不同程度的缺失或水平降低,表明AML患者存在严重的细胞免疫功能缺陷以及T细胞谱系重建的能力和潜能严重受损.     

正常人外周血和脐血中TCR Vβ亚家族sjTRECs的检测情况

目的:检测TCR23个Vβ亚家族sjTRECs在正常人外周血中的存在特点,从而进一步了解正常人胸腺近期各Vβ亚家族初始T细胞的输出情况。方法:采用半巢式PCR对4例胸腺、10例脐血和10例正常人外周血分别在2×105、5×104、1×104和1×103个单个核细胞中的23个Vβ亚家族sjTRECs进行扩增。结果:在细胞数相同的情况下,各Vβ-Dβ1sjTRECs的检出率胸腺细胞最高,其次是脐血,正常人最低。当细胞数为2×105、5×104和1×104时,正常人Vβ2、Vβ4、Vβ7、Vβ11和Vβ19亚家族sjTRECs的检出率以及检出sjTRECs的亚家族数量均显著低于脐血。当细胞数为2×105和5×104时,正常人可检测到绝大多数Vβ亚家族的sjTRECs,随着细胞数的降低,部分Vβ亚家族的sjTRECs则检测不到,而少部分Vβ亚家族的sjTRECs则在1000个细胞时仍能检测到。结论:成功建立了半定量检测23个Vβ亚家族sjTRECs的检测方法;在2×105细胞中约可以检测到80%左右的Vβ亚家族初始T细胞,而在5×104细胞中约有半数的Vβ亚家族初始T细胞可检测到,提示不同Vβ亚家族初始T细胞的出现频率有所差异。     

MDS患者外周血中TCR Vβ1-24-Dβ1 sjTRECs的分析

目的检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血中TCRVβ1-24-Dβ1 sjTRECs的存在情况。方法利用半巢式PCR扩增9例MDS患者外周血单个核细胞DNA中TCRβ链基因重排时形成的T细胞受体DNA删除环（Vβ1-24-Dβ1 sjTRECs）,10例正常人外周血作为对照。结果所有TCRVβ1-24-Dβ1sjTRECs在正常人组外周血T细胞DNA中均有检出,除TCR Vβ12-Dβ1sjTRECs和TCRβ19-Dβ1sjTRECs外,其余TCRVβ-Dβ1 sjTRECs在MDS患者外周血T细胞DNA中均可检。大多数TCRVβ1-24-Dβ1sjTRECs在正常人组中的检出率较MDS患者高,但其中只有6种TCRVβ-Dβ1sjTRECs（分别是TCRVβ3、12、13、15、21、22-Dβ1sjTRECs）的检出率差异有统计学意义。结论本研究率先提供了MDS患者外周血T细胞中TCRVβ-Dβ1sjTRECs的存在情况。MDS患者TCRVβ-Dβ1sjTRECs出现频率低于正常人提示其胸腺近期输出功能存在部分缺陷情况。     

多发性骨髓瘤患者外周血中TCR Vβ亚家族na(i)ve T细胞水平变化

目的:检测多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中23个TCR Vβ亚家族的T细胞受体删除DNA环(sjTRECs)的存在特点,从而了解MM患者相应Vβ亚家族na(i)ve T细胞的近期胸腺输出情况.方法:利用半巢式PCR分别扩增12例MM患者每5×104个外周血单个核细胞(PBMCs)中的23个Vβ亚家族sjTRECs,10例正常人外周血作为对照.结果:在5×104个PBMCs中,检测到MM患者sjTRECs的Vβ亚家族数量约为(5.00±2.45)个,与正常人的(9.60±5.48)个相比,检出的亚家族数量明显减少(P＜0.05);23个Vβ亚家族sjTRECs在正常人中均可以检测到,而在MM患者仅检测到部分;并且Vβ2、Vβ10、Vβ16、Vβ17和Vβ21等5个亚家族sjTRECs的检出率明显低于正常水平.12例MM患者检出的亚家族数量(2-9个)不等,患者的年龄与检出的亚家族数量存在负相关(r=-0.892;P＜0.01).结论:MM患者胸腺近期输出的23个Vβ亚家族na(i)ve T细胞存在不同程度的缺失或水平降低,表明患者存在不同程度的细胞免疫功能缺陷以及T细胞谱系重建的能力和潜能受损.     

多发性骨髓瘤患者外周血中TCR Vβ亚家族nave T细胞水平变化

目的： 检测多发性骨髓瘤（MM）患者外周血中23个TCR Vβ亚家族的T细胞受体删除DNA环（sjTRECs）的存在特点，从而了解MM患者相应Vβ亚家族nave T细胞的近期胸腺输出情况。方法: 利用半巢式PCR分别扩增12例MM患者每5×104个外周血单个核细胞（PBMCs）中的23个Vβ亚家族sjTRECs，10例正常人外周血作为对照。结果: 在5×104个PBMCs中，检测到MM患者sjTRECs的Vβ亚家族数量约为（5.00±2.45）个，与正常人的（9.60±5.48）个相比，检出的亚家族数量明显减少（P<0.05）；23个Vβ亚家族sjTRECs在正常人中均可以检测到，而在MM患者仅检测到部分；并且Vβ2、Vβ10、Vβ16、Vβ17和Vβ21等5个亚家族sjTRECs的检出率明显低于正常水平。12例MM患者检出的亚家族数量（2-9个）不等，患者的年龄与检出的亚家族数量存在负相关（r=-0.892；P<0.01）。结论: MM患者胸腺近期输出的23个Vβ亚家族nave T细胞存在不同程度的缺失或水平降低，表明患者存在不同程度的细胞免疫功能缺陷以及T细胞谱系重建的能力和潜能受损。     

AML-M5患者外周血naive T细胞水平和TCR Vβ谱系利用特点

目的了解急性髓性白血病M5亚型(AML-M5)患者 T细胞受体重排删除DNA环(TRECs)的含量和TCR Vβ基因谱系利用和克隆性,从而了解AML患者的胸腺近期输出功能和TCR Vβ亚家族T细胞增殖特点.方法利用实时定量PCR(TaqMan)方法检测5例M5患者外周血单个核细胞TRECs的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平.利用RT-PCR和基因扫描分析患者外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因表达和克隆性.9例正常人外周血作为对照.结果 M5患者外周血中TRECs含量为0.76±1.21/1000 CD3+细胞,明显低于正常人TRECs水平(6.84±4.71/1000 CD3+细胞,p<0.05).5例患者外周血T细胞表达不同数量Vβ亚家族(2-16个).基因扫描分析显示4例病人外周血中的一些Vβ亚家族出现克隆性T细胞, Vβ1,Vβ15和Vβ21克隆性T细胞均分别见于3例病人中.结论率先报道了AML-M5型患者胸腺近期输出naive T细胞功能明显降低,尽管整体T细胞免疫功能低下,患者仍存在优势利用和克隆性增殖Vβ亚家族T细胞,提示其具有一定地对白血病细胞相关抗原产生特异性免疫反应的能力.     

TCR Dβ-Jβ sjTRECs检测方法的建立和应用

目的：建立检测TCR Dβ-Jβ sjTRECs的方法，并了解不同T细胞受体Dβ-Jβ之间T细胞受体删除DNA环(sjTRECs)在胸腺细胞和外周血T细胞中的形成情况。方法：利用巢式PCR分别扩增10例正常人外周血单个核细胞和3例正常胸腺细胞DNA中不同的Dβ片段和Jβ重排时形成的sjTRECs的情况，PCR产物进一步进行克隆和序列分析以确定结合区的位置。结果：可检测到Dβ1与5个Jβ1基因片段、Dβ2与4个Jβ2基因片段分别形成的sjTRECs，其中以Dβ1-Jβ1S1、Dβ1-Jβ1S2和Dβ2-Jβ2S2sjTRECs最常见，PCR产物经克隆和序列分析证实其形成Dβ-jβsjTRECs的情况。结论：成功地建立了检测Dβ-Jβ-sjTRECs的方法，为分析各TCRβ亚家族的sjTRECs含量和确定TCRβ naive细胞提供了新方法。     

白血病异基因造血干细胞移植后TCR Vβ亚家族基因谱的研究

目的：了解白血病病人异基因外周血干细胞移植后1年以上患者TCR VβT细胞免疫功能重建的情况，方法，采用RT－PCR扩增5例CML和1例AML－M3a移植后（12－56个月）患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因，分析其TCR Vβ亚家族的表达。结果：经24个Vβ引物所分别进行的RT－PCR检测TCRVβ各亚家族基因的表达情况，发现6例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同，病人的部分Vβ亚家族T细胞仍款能重建，仅表达5－22个亚家族基因。结论：移植后1年以上患者尽管CD3＋T细胞已恢复，但外周血TCR Vβ亚家族基因谱的表达仍不完全，T细胞免疫功能仍未完全重建。     

CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的：了解慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞中TCR Vβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性.方法：利用RT-PCR分别扩增19例CML-CP患者外周血单个核细胞（PBMCs）、CD4^＋和CD8^＋细胞TCR Vβ亚家族基因的CDR3,阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性.结果：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞分别表达部分（1～21个）Vβ亚家族,均以Vβ13的表达率最高,其次为Vβ9,多数患者的一些Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖,主要出现于CD8^＋细胞中,分别以Vβ21（CD4^＋）和Vβ11（CD8^＋）亚家族的克隆性增殖多见.结论：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞的TCR Vβ谱系均存在限制性分布,患者存在的克隆性增殖CD4^＋和CD8^＋T细胞可能与宿主抗CML抗原反应有关,它们可能在抗CML效应中起主要作用.     

原发性血小板减少性紫癜患者T细胞受体Vβ亚家族基因的表达特点

目的：了解原发性血小板减少性紫癜（ITP）患者T细胞受体 Vβ亚家族基因表达特点。 方法： 采用反转录酶－多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测5例ITP患者外周血T细胞TCR Vβ 24个亚家族基因表达情况，10例正常人作为对照。 结果： 正常人外周血T细胞表达全部24个TCR Vβ亚家族，而5例ITP患者外周血T细胞仅表达4-11个Vβ亚家族，主要为Vβ2（100％）和Vβ3（100％），其次为Vβ19（80％）和Vβ21（80％）部分。全部样本未检测出Vβ4、Vβ6、Vβ17、Vβ20、Vβ24亚家族表达。 结论： ITP患者外周血T细胞TCR Vβ基因谱系呈限制性表达，与其存在细胞免疫功能异常有关。     

AML-M5患者外周血naive T细胞水平和TCR Vβ谱系利用特点

目的　了解急性髓性白血病M5亚型 (AML -M5 )患者T细胞受体重排删除DNA环 (TRECs)的含量和TCRVβ基因谱系利用和克隆性 ,从而了解AML患者的胸腺近期输出功能和TCRVβ亚家族T细胞增殖特点 .方法　利用实时定量PCR(TaqMan)方法检测 5例M5患者外周血单个核细胞TRECs的水平 ,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平 .利用RT -PCR和基因扫描分析患者外周血单个核细胞的TCRVβ2 4个亚家族基因表达和克隆性 .9例正常人外周血作为对照 .结果　M5患者外周血中TRECs含量为 0 .76± 1.2 1/ 10 0 0CD3 细胞 ,明显低于正常人TRECs水平 (6 .84± 4 .71/ 10 0 0CD3 细胞 ,p <0 .0 5 ) .5例患者外周血T细胞表达不同数量Vβ亚家族 (2 - 16个 ) .基因扫描分析显示 4例病人外周血中的一些Vβ亚家族出现克隆性T细胞 ,Vβ1,Vβ15和Vβ2 1克隆性T细胞均分别见于 3例病人中 .结论　率先报道了AML -M5型患者胸腺近期输出naiveT细胞功能明显降低 ,尽管整体T细胞免疫功能低下 ,患者仍存在优势利用和克隆性增殖Vβ亚家族T细胞 ,提示其具有一定地对白血病细胞相关抗原产生特异性免疫反应的能力     

慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化的研究

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化特征。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8例CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果:基因扫描显示所有8例CHB患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生。Vβ8、Vβ11、Vβ12出现单克隆增生的频率相对较高。8例健康者TCR Vβ基因亚家族均为多克隆。结论:CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ亚家族存在克隆性增生。     

肿瘤患者胸/腹水和外周血中TCR Vβ亚家族表达及调节性T细胞亚群的研究

目的:探讨肿瘤患者胸/腹水中肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和外周血T细胞中T细胞受体(TCR)Vβ亚家族的表达变化情况、CD4/CD8细胞比例变化和Treg细胞的分布情况,分析肿瘤患者的免疫状态。方法:分离11例肿瘤患者胸/腹水和外周血以及4例健康人外周血的T细胞,采用流式方法检测Vβ24个亚家族及CD3、CD4、CD8、CD25、CD127的表达情况,统计分析T细胞中Vβ24个亚家族、Treg细胞的特点。结果:TCR Vβ亚家族的表达在肿瘤患者胸/腹水TIL中与血液淋巴细胞中存在着显著差异,其中肺癌患者(4/5)TIL中TCR Vβ8,结肠癌患者(3/4)TIL中TCR Vβ2等亚家族显著高表达;11例肿瘤患者胸/腹水样本中Treg的比例均比外周血高(P<0.05),其中5例肺癌患者胸腹水中CD8+T细胞比例降低。结论:肿瘤患者胸/腹水中的淋巴细胞TCR Vβ亚家族表达与外周血存在差异,表明肿瘤患者体内淋巴细胞发生了明显的优势取用和定向趋化。此外肿瘤微环境可能影响了TIL中CD4+细胞的分化导致胸腹水中Treg细胞的比例升高,同时伴随着CD8+T比例的下降,并可能因此影响到TIL中TCR Vβ亚家族的优势取用情况,且导致免疫耐受。     

急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+ T细胞受体α和β链亚家族特点

目的:分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体α和β链亚家族特点。方法:从1例HLA*0201的急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用乙肝抗原HBsAg表位S335-343多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导CD8+ T增殖,用流式细胞仪分选出特异性CTL到96孔培养板,培养10～14 d后,提取细胞RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和TCR Vβ,并用非特异性CD8+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果:从HBV急性肝炎患者分离的HBsAg335-343表位特异性CD8+ T细胞扩增出15个Vα亚家族和10个Vβ亚家族,其中用少量CTL仅检出Vα2、Vα9和TCR Vβ3、Vβ4、Vβ9,提示这几种亚家族可能为该特异性CTL TCR的优势取用亚家族,除Vα2呈现3种序列和Vβ9呈现2种序列外,其他亚家族内序列单一;而从患者非特异性CD8+ T对照细胞中可扩增到所有的32个TCRVα和25个Vβ亚家族,且同一亚家族序列呈现高度多样性。结论:急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体存在优势利用的特点,可能是由于针对同一抗原的特异性CD8+ T细胞克隆性增殖所致,其机制有待进一步分析。     

AML-M1相关TCR Vβ克隆性增殖T细胞的研究

目的：了解急性髓细胞白血病M1亚型（AML－M1）患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性分布特点。方法：采用RT－PCR扩增9例M1患者外 周血的单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因，分析其TCR Vβ亚家族的利用情况。PCR产物进一步经基因扫描分析，了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果：不同标本中可检测到2－5个Vβ亚家族T细胞，以Vβ2、Vβ3、Vβ17和Vβ19为常见，并在Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ8、Vβ9和Vβ19中发现克隆性生长T细胞。结论：M1病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞表达呈现明显的选择性和克隆性增殖情况，这可能与M1细胞相关抗原有关，且克隆性增殖Vβ亚家族分布以个体特异性为主。     

NOD/SCID小鼠人源化TCR Vβ亚家族T细胞分布与克隆性分析

目的 应用脐血CD34 细胞移植NOD/SCID鼠所建立的人源化SCID模型,分析人源化TCR Vβ亚家族T淋巴细胞分布与克隆性.方法 磁珠分选法分离脐血中CD34 细胞,分别经尾静脉输入亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠.第6周处死小鼠提取外周血、骨髓、胸腺的RNA,RT-PCR扩增人TCR Vβ亚家族基因,并用基因扫描进行T细胞克隆性分析.结果 采用RT-PCR技术在模型小鼠骨髓中检测到部分人TCR Vβ亚家族基因Vβ1、2、9、13、19.经进一步基因扫描分析,发现部分TCR Vβ亚家族基因Vβ9、13、19呈寡克隆表达.结论 在NOD/SCID模型可重建分化成熟的TCR Vβ亚家族T细胞.未能检测到全部人TCR VβT细胞的原因可能与免疫重建不完全或存在移植物抗宿主的反应有关.人源T淋巴细胞在模型鼠骨髓中分化成熟.     

无症状HBV携带者外周血CD4~+TCR Vβ基因亚家族克隆化特征的研究

分析无症状HBV携带者(AsC)CD4+TCR Vβ基因家族克隆化特征。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增7例AsC外周血CD4+TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对CD4+TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果基因扫描显示,7例AsC CD4+TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生;7例健康者CD4+TCR Vβ基因亚家族均呈正态分布。提示,AsC外周血CD4+TCR Vβ亚家族存在克隆性增生,这可能与AsC免疫耐受的形成有关。     

CML细胞诱导自体和脐血T细胞TCR Vβ谱系和杀伤性分析

目的 了解慢性粒细胞白血病(CML)细胞诱导T细胞的TCR Vβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况，及其对CML细胞的杀伤活性。方法 采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法，利用CML细胞体外诱导脐血或患者的T细胞增殖，用RT-PCR和基因扫描分析MLTC前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区(CDR3)，了解各Vβ亚家族的利用和T细胞克隆性特点。并利用LDH方法检测MLTC后T细胞的细胞毒性。结果 脐血T细胞表达8～11个TCR Vβ亚家族，经MLTC后，2～3个Vβ亚家族呈克隆性增殖，CML细胞诱导的自体T细胞的TCR Vβ亚家族也类似。经MLTC后T细胞对原诱导细胞有较强的杀伤活性。结论 CML细胞可诱导脐血T细胞和自体T细胞TCR Vβ优势利用和克隆性增殖，诱导后T细胞具有特异性杀伤CML细胞的作用。