生技霉素E（4″—异戊酰螺旋霉素Ⅰ）的分离和结构鉴定

为获得高产的４″－异戊酰螺旋霉素,将４″－异戊酰基转移基因整合入螺旋霉素产生菌Ｓｓｐｉｒａｍｙｃｅｌｉｃｕｓ Ｆ２１染色体,构建成功卫株稳定的生物工程菌ＷＳＪ－１,继从该菌株代谢产物中分离获得生技霉素Ａ１（４″－异戊酰螺旋霉素Ⅲ）,生技霉素Ｂ１（４″－异戊酰螺旋霉素Ⅱ）,又分离获得一主要组分生技霉素Ｅ。     

生技霉素的组分研究

利用对流分配、硅胶柱层析、薄层层析、中压液相层析等分离技术 ,从基因工程菌 WSJ- 1的活性产物生技霉素中分离了 16个化合物。其中除主要产物生技霉素 A1 、B1 、E1 (4″- O-异戊酰螺旋霉素 、 、 )外 ,还包括生技霉素 A2α,A2β,生技霉素 B3,C1 (4″- O-丁酰 ,异丁酰 ,丙酰 ,乙酰螺旋霉素 )及生技霉素 B2α,B2β,C2 ,D1 (4″- O-丁酰 ,异丁酰 ,丙酰 ,乙酰螺旋霉素 ) ,以及新的 4″-酰化螺旋霉素生技霉素 B0 [4″- O- (3-甲基 - 2 -丁烯酰基 ) -螺旋霉素 ]。还有可能是 4″- O-酰化螺旋霉素生物合成中间体的生技霉素 A0 (普拉特霉素 A1 ) ,生技霉素 P1 、P2 (螺旋霉素 , )和生技霉素 P3(新螺旋霉素 )。文中报道了这些化合物的分离 ,性质及结构。并总结报道了具有重要鉴别意义的这些化合物中 C- 3,C- 4″酰基侧链的 1 H及 1 3C- NMR数据。     

生技霉素小组分的研究I.分离纯化和4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ(生技霉素B2β)的结构鉴定

生技霉素是一组以4"-异戊酰螺旋霉素为主的基因工程杂合抗生素,除了主要组分4"-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ(生技霉素A1、B1、E1)和小组分4"-丁酰/异丁酰螺旋霉素Ⅲ(生技霉素A2α/A2β)以外,还含有其它4"-酰化螺旋霉素和少量杂质.采用连续逆流分配法,碱性硅胶柱层析,制备薄层层析和中压柱层析等分离方法,并以薄层层析和HPLC作为检测手段,从生技霉素混合物中分离得到了四个小组分A0、B2、B3和C2,其含量分别为0.5%、3.3%、6.2%和2.6%,其中B2为B2α和B2β两个异构体的混合物.经过UV、IR、SI-MS、GC-MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY等光谱分析,并与生技霉素A1、B1、A2α、A2β等的光谱数据进行比较,确定了生技霉素B2α为4"-丁酰螺旋霉素II,B2β为4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ,其中4"-异丁酰螺旋霉素II为一个新的基因工程杂合抗生素.     

生技霉素小组分的研究 Ⅱ.生技霉素A0、B3和C2的结构鉴定

生技霉素中除了主要组分4“－异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、I（生技霉素A1、B1、E1）和小组分4“－丁酰／异丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素A2α/A2β）以外，还含有其它4“－酰化螺旋霉素和少量杂质。经过UV、IR、SIMS、^1H-NMR、^13C-NMR、^1H-^1H COSY等光谱分析，并与生技霉素书籍组分的光谱数据进行对照，确定了生技霉素A0为普拉特霉素A1，生技霉素B3为4“－丙酰螺旋霉素Ⅲ，生技霉素C2为4“－丙酰螺旋霉素Ⅱ，并对各组分所有碳氢信号的化学位移作出了明确的归属。     

生技霉素小组分的研究 Ⅲ.新螺旋霉素类抗生素生技霉素B0的分离和结构鉴定

生技霉素是一个多组分的基因工程杂合抗生素,含有主要成分4"-O-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ(生技霉素A1、B1、E1)和其它4"-O-酰化螺旋霉素及少量杂质.采用逆流分配层析、碱性硅胶柱层析和中压柱层析等分离方法,从生技霉素混合物中又分离得到一个新的小组分--生技霉素B0.经UV、IR、FAB-MS、1H-NMR、13C-NMR和1H-1H COSY等光谱分析表明,生技霉素B0的结构为4"-O-(3-甲基-2-丁烯酰)螺旋霉素Ⅱ,是一个新的4"-O-酰化螺旋霉素类抗生素.     

生技霉素小组分的研究 Ⅲ.新螺旋霉素类抗生素生技霉素B0的分离和结构鉴定

生技霉素是一个多组分的基因工程杂合抗生素，含有主要成分4”-O-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、I(生技霉素A1、B1、E1)和其它4”-O-酰化螺旋霉素及少量杂质。采用逆流分配层析、碱性硅胶柱层析和中压柱层析等分离方法，从生技霉素混合物中又分离得到一个新的小组分——生技霉素B0。经Uv、IR、FAB—MS、^1H—NMR、^13C-NMR和^1H-^1H COSY等光谱分析表明，生技霉素B0的结构为4”-O-(3-甲基-2-丁烯酰)螺旋霉素Ⅱ，是一个新的4”-O-酰化螺旋霉素类抗生素。     

生技霉素小组分的研究I．分离纯化和4″—异丁酰螺旋霉素II（生技霉素B2β）的结构鉴定

生技霉素是一组以4″－异戊酰螺旋霉素为主的基因工程杂合抗生素，除了主要组分4″－异戊酰螺旋霉素III、II、I（生技霉素A1、B1、E1）和小组分4″－丁酰／异丁酰螺旋霉素III（生技霉素A2α/A2β）以外，还含有其它4″－酰化螺旋霉素II和少量杂质。采用连续逆流分配法，碱性硅胶柱层析，制备薄层层析和中压柱层析等分离方法，并以薄层层析和HPLC作为检测手段，从生技霉素混合物中分离得到了四个小组分A0、B2、B3和C2，其含量分别为0．5％、3．3％、6．2％和2．6％，其中B2为B2α和B2β两个异构体的混合物。经过UV、IR、SI－MS、GC－MS、^1H-NMR、^13C-NMR、^1H-^1H COSY6等光谱分析，并与生技霉素A1、B1、A2α、A2β等的光谱数据进行比较,确定了生技霉素B2α为4″－丁酰螺旋霉素II，B2β为4″－异丁酰螺旋霉素II，其中4″－异丁酰螺旋霉素II变一个新的基因工程杂合抗生素。     

生技霉素小组分的研究 Ⅰ.分离纯化和4″-异丁酰螺旋霉素Ⅱ(生技霉素B_(2β))的结构鉴定

生技霉素是一组以4"-异成酰螺旋霉素为主的基因工程杂合抗生素，除了主要组分4"-异戊酚螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ（生技霉素A1、B1、E1）和小组分4"-了酰／异丁酞螺旋霉素Ⅲ（生技霉素A2a／A2β）以外，还含有其它4"-酸化螺旋霉素和少量杂质。采用连续逆流分配法，碱性硅胶柱层析，制备薄层层析和中压柱层析等分离方法，并以薄层层析和HPLC作为检测手段，从生技霉素混合物中分离得到了四个小组分A0、B2、B3和C2，其含量分别为0．5％、3．3％、6．2％和2．6％，其中B2为B2a和B2β两个异构体的混合物。经过UV、IR、SI－MS、GC－MS、1H－NMR、13C－NMR、1H－1H COSY等光谱分析，并与生技霉素 A1、B1、A2a、A2β等的光谱数据进行比较，确定了生技霉素B2a为4"-丁酰螺旋霉素Ⅱ，B2β为4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ，其中4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ为一个新的基因工程杂合抗生素。     

天然来源的新化合物4~"-异丁酰螺旋霉素Ⅲ(生技霉素A_(2β))

生技霉素是一组４＂－酰化螺旋霉素，继从生技霉素产生菌发酵液中分离到主要组分生技霉素Ａ和Ｂ之后，利用两相分配及柱层析的分离方法，又分离到分子量为９６８的化合物生技霉素Ａ２。根据其ＵＶ、ＩＲ、ＦＡＢ－ＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＥＰＴ谱、１Ｈ－１ＨＣＯＳＹ的分析及与４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅲ（即生技霉素Ａ）光谱数据的比较表明生技霉素Ａ２含分子式皆为Ｃ５０Ｈ８４Ｎ２Ｏ１６的４＂－异丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素Ａ２β）和４＂－丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素Ａ２α）。生技霉素Ａ２碱水解产物中游离脂肪酸的气相色谱及ＧＣ－ＭＳ分析支持了以上结论。     

生技霉素A及B的分离及结构鉴定

从含有４＂－酰化酶基因的螺旋霉素产生菌－基因工程菌的培养物中分离到一组４＂酰化螺旋霉素，命名为生技霉素。其在体内对小鼠实验感染的治疗作用比乙酰螺旋霉素强。生技霉素主要组份为生技霉素Ａ和Ｂ。通过溶媒提取，真空层析，制备薄层层析等方法得到了生技霉素Ａ、Ｂ的纯品。生技霉素Ａ的紫外最大吸收在２３０．８ｎｍ。具有与螺旋霉素、麦迪霉素、吉他霉素类似的红外吸收光谱，分子量为９８２（ＦＡＢＭＳ：Ｍ＋Ｈ，９８３）。分子式Ｃ５１Ｈ８６Ｎ２Ｏ１６。通过对ＦＡＢＭＳ，１Ｈ－ＮＭＲ，１３Ｃ－ＮＭＲ，ＤＥＰＴ，ＣＯＳＹ及ＨＥＴＣＯＲ谱分析，鉴定生技霉素Ａ的结构为４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅲ，并对４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅲ的８４个连碳氢的１Ｈ－ＮＭＲ信号作出了明确归属。生技霉素Ｂ与生技霉素Ａ具有类似的紫外及红外吸收光谱。分子量为９６８（ＦＡＢＭＳ：Ｍ＋Ｈ，９６９），比Ａ小１４个质量单位。主要根据１Ｈ－ＮＭＲ及１３Ｃ－ＮＭＲ谱的分析及与生技霉素Ａ的１Ｈ－ＮＭＲ及１３Ｃ－ＮＭＲ谱的比较，鉴定生技霉素Ｂ的结构为４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅱ。     

天然来源的新化合物4″—异丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素A2β）

生技霉素是一组４″－酰化螺旋霉素，继从生技霉素产生菌发酵中分离到主要组分生技霉素Ａ和Ｂ之后，利用两相分配及柱层析的分离方法，又分离到分子量为９６８的化合物生技霉素Ａ２。根据其ＵＶ、ＩＲ、ＦＡＢ－ＭＳ、＾１Ｈ－ＮＭＲ、＾１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＥＰＴ谱、＾１Ｈ－＾１ＨＣＯＳＹ的分析及与４″－异戊酰螺旋霉系Ⅲ（即生技霉素Ａ）光谱数据的比较表明生技霉素Ａ２含分子式皆为Ｃ５０Ｈ８４Ｎ２Ｏ１６的４″－异丁酰螺旋霉     

中心组合设计优化必特螺旋霉素合成培养基

将克隆自卡波霉素产生菌的4＂-O-异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌Streptomyces spiratnvceticus F-21的染色体上，构建成一株稳定的生物工程菌WSJ-1-195，它产生的一组以4＂-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分基因工程新型抗生素命名为必特螺旋霉素。针对目前没有适合必特螺旋霉素产生菌的合成培养基，所以本文顺序通过部分因子析因设计法、最速上升实验、中心组合实验，并利用统计学软件SAS V8对实验数据进行分析，确定了必特螺旋霉素合成培养基的组成，为以后对必特螺旋霉素生理生化特性的研究提供基础。经过优化后必特螺旋霉素的发酵效价从173μg／ml提高到1880μg／ml。     

利用强启动子PermE*提高4"-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平

目的 提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导.方法 构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力.结果 在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍.结论 在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平.     

橄榄链霉菌CD5872产越霉素A的研究#br#

目的 放线菌CD5872的分类鉴定及其活性次级代谢产物的研究。方法 采用多相分类技术对菌株CD5872进行初步鉴定;菌株发酵液通过离子交换树脂和硅胶柱层析技术分离获得单体化合物CD-1。根据高分辨质谱、核磁共振谱图、天然产物数据库检索和高效液相分析确定活性化合物的结构。结果 该菌株为橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivoreticuli),化合物CD-1为越霉素A(destomycin A)。结论 首次报道越霉素A的新产生菌,具有工业化开发价值。     

提高基因工程菌产二素链霉菌311—10产生酰化螺旋霉素的研究

基因工程菌产二素链霉菌(Str.ambofaciens)311-10是一株含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌,可发酵直接产生酰化螺旋霉素。经质谱鉴定,所产生的酰化产物为4″—异戊酰、4″—丁酰及4″—丙酰螺旋霉素,并含有50～60％的螺旋霉素组份。为了提高酰化螺旋霉素的含量,研究了17种氨基酸及有关化合物对产二素链霉菌311-10菌株直接产生酰化螺旋霉素的影响。结果显示,在发酵过程中添加一定量α—羟基异丁酸或L—异亮氨酸,酰化螺旋霉素的的百分含量可从对照组的45％分别提高到73％和67％。如同时加入α-羟基异丁酸和L-异亮氨酸.则酰化螺旋霉素的含量可增至88％左右。研究表明含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌能利用L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸作为酰基的供体。从不同发酵时间加入试验表明合适的添加时间为发酵前期24小时左右。提示L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸不只是提供酰化螺旋霉素4”—酰化酶酰基的供体,可能对4″—酰化酶基因的转录起诱导作用。 L—精氨酸能使酰化螺旋霉素组份下降至14％左右,并能抵消α-羟基异丁酸或L-异亮氨酸对酰化螺旋霉素的促进作用。 研究提示控制基因工程菌发酵条件,可以有效地获得所需基因工程产物。     

异戊酰螺旋霉素基因工程菌发酵放大实验的研究

普利用基因工程重组技术得到发酵主要产物为４″异戊酰螺旋霉素的基因工程菌。本文报道该工程菌在发酵罐罐放大实验中的稳定性以及生产能力，为进一步中试作好准备。     

可利霉素片在比格犬体内的药代动力学

目的建立同时测定比格犬血浆中可利霉素的3种主要成分异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及3种主要代谢物螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浓度的UPLC-MS/MS分析方法,并用于药代动力学研究。方法选用Kinelex XB-C_(18)柱,以乙腈-5 mol·L~(-1)乙酸铵-甲酸(体积比为88∶12∶0.2)为流动相,流速为0.2 mL·min~(-1),采用电喷雾离子源,以多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)方式进行正离子扫描。结果该方法在1～250μg·L~(-1)内螺旋霉素I、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ线性关系良好,1～1 000μg·L~(-1)内螺旋霉素Ⅱ、Ⅲ线性关系良好,回收率90.58～96.73%,基质效应96.78～114.98%,日间和日内的精密度和准确度值均小于15%。结论该方法可用于可利霉素片在比格犬体内的血浆浓度测定,且血浆中代谢物SPM的浓度远高于主要组份Iso-SPM。     

旱地小单孢菌FIM03-712生物转化雷帕霉素为14-去氧雷帕霉素

在生物转化研究中,获得对雷帕霉素具有转化作用的一株小单孢菌,经分类学研究鉴定为旱地小单孢菌(Micromonospora chersina)FIM03-712.该菌株转化雷帕霉素产生4个化合物,从转化发酵液中分离到一个分子量为900的转化产物,理化性质和波谱分析研究表明,该转化产物为14-去氧雷帕霉素.     

海绵共附生菌Streptomyces olivaceus LHW2444的分离鉴定及其抗青枯菌活性代谢产物研究

目的 从海绵中分离培养放线菌,筛选具有抗青枯菌活性的菌株,分离鉴定活性代谢产物。方法 以来源于南海西沙永兴岛附近海域的海绵Leucetta chagosensis为实验材料,采用三种选择性分离培养基分离海绵的共附生放线菌,利用16S rRNA序列分析对各菌株进行种属鉴定。对各菌株的发酵提取物进行抗青枯菌活性筛选,采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和高效液相色谱法对筛选到的活性菌株的发酵产物进行分离、纯化,运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)等手段,鉴定化合物的结构。采用微量稀释法测定化合物的最小抑菌浓度(MIC)。结果 分离培养海绵共附生放线菌16株,筛选得到一株具有较好抗青枯菌活性的菌株Streptomyces olivaceus LHW2444,并从该菌株的发酵产物中分离鉴定2个吡咯类化合物、1个苯并二恶茂类化合物、2个吡喃酮类化合物,分别为pyrrole-2-carboxamide(1)、pyrrole-2-carboxylic acid(2)、1,3-benzodioxole-2-one-4-carboxylamide(3)、germicidin B(4)、germicidin C(5),化合物1-5为首次从该种属放线菌分离得到。首次发现pyrrole-2-carboxylic acid对青枯菌具有较强抑制作用,MIC值为8 μg/mL。结论 海绵共附生菌Streptomyces olivaceus LHW2444是潜在的植物青枯病生防菌,pyrrole-2-carboxylic acid是抗青枯菌的活性代谢产物。     

纤维堆囊菌菌株So0157-2中的四个天然埃博霉素衍生物(英文)

从纤维堆囊菌菌株So0157-2发酵吸附树脂的提取物中分离得到四个天然埃博霉素衍生物,包括两个14元环埃博霉素L(1)和L1(2),以及两个环氧环打开的埃博霉素A(3)和B(4)。并根据核磁共振和质谱等方法鉴定了它们的结构。这四个化合物都是首次作为天然产物从该菌株中分离得到,也是首次对化合物的数据进行全指定。