尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fim H基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌临床分离株Ⅰ型菌毛编码基因fimH 为目的基因的真核表达载体pcDNA3.0-fimH.方法 提取尿路致病性大肠杆菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR 、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒.通过PCR 、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定.结果 PCR 法克隆出全长为903 bp 的fimH基因并构建了pcDNA3.0-fimH重组质粒.结论 本研究成功构建尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3.0-fimH,为尿路致病性大肠杆菌基因疫苗的研制奠定了基础.     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

PCR检测产毒性大肠杆菌及初步应用

本文应用聚合酶链反应(PCR)检测产毒性大肠杆菌(ETEC).在ETEC的肠毒素基因内设计合成3对引物,扩增出LT(627bp)和ST(STa;24bp,STb:169bP)基因片段,一次性分型检测各种ETEC,对标准菌株、模拟标本及临床标本进行检测,结果表明PCR有较好的特异性和敏感性,在临床有较好的应用价值.     

尿路致病性大肠杆菌iha基因敲除及其对细菌生物膜形成的影响

目的构建尿路致病性大肠杆菌(UPEC)W140菌株的黏附素基因iha缺陷株,分析iha基因缺失对UPEC生物膜形成的影响。方法采用Red重组系统的3种质粒(pKD46、pKD3、pCP20)敲除W140菌株的iha基因。pKD46表达λ噬菌体的3个重组蛋白,转入W140菌株使其具有同源重组能力。以pKD3携带的两侧带有翻转酶结合位点(FRT)的氯霉素抗性基因替换目的基因iha,再利用表达翻转酶重组酶的质粒pCP20将FRT之间的氯霉素抗性基因删除,从而获得iha基因敲除菌株。采用结晶紫染色法比较野生菌株与基因敲除菌株的细菌生物膜形成差异。结果 PCR验证和DNA测序表明,UPEC W140菌株染色体上的iha基因被成功敲除,得到iha基因缺陷株UPEC W140Δiha。基因缺陷菌株与野生菌株相比生物膜形成能力降低(P<0.01)。结论 iha基因及其编码产物参与UPEC生物膜的形成,通过抑制该基因的表达有望为控制尿路感染提供新的靶点。     

致肾盂肾炎大肠杆菌P菌毛粘附素基因的型别鉴定

目的 从基因水平鉴定致肾盂肾炎大肠杆菌P菌毛粘附素的类型。方法 根据P菌毛I型（PapGJ96)、Ⅱ型（PapGIA2)和Ⅲ型（PrsGJ96)粘附素的基因序列，选择非同源区设计合成三对引物。以全菌DNA样品为模板，应用普通PCR和复合PCR技术获得三型papG的扩增。结果 UPEC J96分别产生461bp和258bp的DNA片段；UPEC132和UPEC136均产生190bp的DNA片段。无P菌毛对照株为阴性扩增。复合PCR结果与普通PCR完全一致。PapG132扩增产物的序列分析表明其与PapGIA2之间具有97．9％的同源性，但存在4处点突变。结论 UPEC132株P菌毛粘附素为Ⅱ型PapG，但与国外同型PapG比较，存在基因变异。复合PCR技术用于papG基因分型具有很高的敏感性和特异性。     

PCR检测ETEC中的irp1基因

目的：探讨高致病岛（High Pathogenility Island,HPI)的irp1基因在ETEC菌株中的分布状况。方法：利用小肠结肠耶尔森菌HPI的irp1基因,设计合成引物,对ETEC菌株进行PCR（多聚酶链反应）检测。结果：94株ETEC菌中有10株呈现阳性。结论：HPI的irp1基因在小肠结肠炎耶尔森菌与ETEC（肠致病性大肠杆菌）之间存在着基因的水平转移,但其转移机制如何及转移过程有待于进一步研究。     

不育男性精液大肠杆菌感染及其菌毛检测结果分析

生殖道感染的微生物种类较多，致病方式各异。T株支原体可直接吸附于精子表面。引起免疫损伤；沙眼衣原体可引起生殖道炎症而影响精子及附属腺的功能；细菌可通过异源性凝集、吸附运动的精子而引起不育，其中大肠杆菌是不育男子精液中较常见的感染菌之一。本文就234例不育男性病人精液中大肠     

应用插入序列PCR进行大肠杆菌O157:H7基因分型的研究

目的对不同地区、不同宿主大肠杆菌O157：H7分离株进行基因分型。方法应用插入序列PCR方法，对反应体系中dNTPs、引物以及镁离子浓度等反应条件进行优化。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测和分析。结果14株不同来源O157：H7分离株根据插入序列PCR图谱可分为A、B、C、D四个基因型。不同地区O157：H7菌株存在不同的基因型；同一地区、毒力基因谱相同的O157：H7菌株基因型也不相同；不同宿主O157：H7菌株也存在相同的基因型。结论插入序列PCR技术用于大肠杆菌O157：H7的基因分型，简便、快速、敏感，对大肠杆菌O157：H7的分子流行病学研究具有重要价值。     

乙型肝炎病毒基因定量检测及临床应用

目的：了解乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒基因(HBVDNA)水平与乙型肝炎病毒(HBV)感染的临床关系及HBVDNA定量分析在拉米夫定治疗中的应用；方法：用聚合酶链反应(PCR)技术测定109例HBV感染者血清中HBVDNA水平及观察35例乙型肝炎患者拉米夫定治疗效果；结果：109例HBV感染者血清中HBVDNA水平与乙型肝炎病毒五项指标(HBV—M)的阳性模式有一定相关性，在HBsAg、HBeAg阳性模式中约有93％以上病例HBVDNA阳性，其含量最高，而在HBsAg，抗—HBe，抗—HBc阳性模式中其HBVDNA阳性检出率仅为67．7％，其含量不高。HBVDNA水平与乙型肝炎临床分型的相关性不显著(P＞0．05)。拉米夫定治疗前后血清HBVDNA含量有显著性差别(P＜0．01)；结论：应用PCR技术定量检测血清HBVDNA含量是诊断乙型肝炎和了解病毒复制与临床关系的重要指标，是指导乙型肝炎抗病毒治疗的重要手段。     

102株肺炎克雷伯杆菌CTX-M型基因检测

目的:了解泸州地区临床分离的肺炎克雷伯杆菌中CTX型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)发生情况.方法:按美国全国临床检验标准委员会(2005年版)表型确正试验检出产ESBLs肺炎克雷伯杆菌;分别用CTX4组引物对其进行聚台酶链反应(PCR)扩增.结果:表型确正试验检出产ESBLs菌株38株,检出率为37.25%;PCR扩增显示:CTX-M型ESBLs阳性是18株,检出率为47,37%.结论:泸州地区肺炎克雷伯杆菌CTX-M型产生率较高.     

尿路感染大肠杆菌耐药性与1类整合子的关系分析

目的 分析尿路感染大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)1类整合子对其耐药性的影响.方法 留取临床泌尿系感染患者中段尿分离株,常规方法鉴定为大肠杆菌感染者;K-B法做耐药菌株的药敏实验;PCR扩增检测intI1基因.结果 58株菌中有26株(44.8%)1类整合子检测阳性,有500、750、1 000、1 800、20 000 bp等5种不同大小的整合子结构,且绝大多数(92.3%)的整合子在500bp以上,其中10株含有2种整合子结构;整合子阳性菌株对20种抗菌药物的耐药率多数都在50%以上,尤其是对头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、氟喹诺酮类和庆大霉素的耐药率显著高于整合子阴性的菌株,经χ2检验差异有统计学意义.结论 1类整合子广泛分布于UPEC中,整合子阳性菌株对部分第三代头孢菌素、氨基糖甙类、氟喹诺酮类等抗生素的耐药率明显高于阴性菌株,说明整合子对UPEC耐药性的播散有一定的作用.     

门诊与住院尿路感染病人大肠杆菌耐药性分析与比较

目的了解本院尿路感染病人最常见病原菌大肠杆菌耐药特点,为临床合理治疗提供依据。方法2008年1月—2012年12月,我院确诊并有完整病原学资料的大肠杆菌尿路感染病人602例,其中住院病人368例,门诊病人234例。对门诊与住院病人大肠杆菌耐药率、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检出率进行比较。结果对绝大部分抗生素住院病人耐药率明显高于门诊病人;住院病人大肠杆菌ESBLs检出率远远高于门诊病人。对大肠杆菌历年耐药率较低的药物依次为：碳青酶烯类、丁胺卡那霉素、耐酶青霉素、头孢西丁。结论门诊与住院病人大肠杆菌耐药率和ESBLs检出率有明显差异,本研究药物敏感性分析结果为临床治疗用药提供了参考。     

青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况,探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC-460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测,聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段,69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株,其中耐药株13株,敏感株5株;SSCP泳动正常者51株,其中耐药株14株,敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCR—SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变,可弥补常规药敏试验的不足。     

急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义

目的 观察 Livin 基因在急性白血病(AL)病人白血病细胞中的表达及其临床意义.方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测41例不同时期AL病人白血病细胞Livin mRNA的表达水平,以10例健康人作为正常对照.结果 AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率为53.7%.其中急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)病人Livin mRNA 阳性表达率分别为53.8%、53.6%,二者比较差异无显著性,但均高于正常对照组(10.0%)(P=0.035、0.017).初治和复发AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率分别为52.4%、85.7%,明显高于对照组(P=0.025、0.004).缓解组病人Livin mRNA阳性表达率为15.4%,明显低于初治组和复发组(P=0.004、0.030),而与对照组相比差异无统计学意义.白细胞计数≥50×109/L的初治白血病病人Livin mRNA的阳性表达率(77.8%,7/9)明显高于白细胞计数＜50×109/L的初治病人(25.0%,3/12)(P=0.022),其表达水平也明显高于后者(T=6.50,P<0.05).结论 Livin mRNA过度表达参与了AL的发病,可作为AL的诊断、复发及预后判断的指标之一.Livin mRNA表达在AL细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用,可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一,可作为治疗的一个潜在靶点.     

骨髓增生性疾病降钙素基因高度甲基化的检测

①目的探讨骨髓增生性疾病（ＭＰＤ）与降钙素（ＣＴ）基因高度甲基化的关系。②方法采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了５０例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）、６例原发性骨髓纤维化（ＭＦ）及１例真性红细胞增多症（ＰＶ）病人的ＣＴ基因高度甲基化的阳性程度。③结果４２．００％的ＣＭＬ和６６．６７％的ＭＦ病人发生了ＣＴ基因高度甲基化；１例ＰＶ病人为阴性。ＣＭＬ病人阳性率分别为慢性期２０．６９％，加速期为６６．６７％，急变期为７７．７８％，慢性期比加速期和急变期的阳性率均明显降低（χ２＝９．６７７１，Ｐ＜０．０１）。④结论ＣＴ基因的高度甲基化与ＣＭＬ，ＭＦ病人的病程进展有关，它可作为ＣＭＬ，ＭＦ病人判断预后的一个有临床应用价值的分子标志     

MAL基因在原发食管癌组织表达及临床意义

目的 探讨MAL基因表达下调与食管癌病理分期、组织学分级的相关性.方法 采用RT-PCR和半定量RT-PCR方法检测45例食管癌组织和癌旁食管黏膜组织中MAL基因的表达.结果 40例食管癌组织中MAL mRNA表达明显低于相应的癌旁食管黏膜组织(χ2=30.59,P<0.01);Ⅰ～Ⅱ期病人的MAL基因表达水平显著高于Ⅲ期病人(t=5.952,P<0.001),淋巴结转移阳性病人MAL mRNA表达水平显著低于淋巴结转移阴性病人(t=6.743,P<0.001).结论 MAL mRNA在食管癌组织中的表达与临床分期、组织学分级等临床病理因素有一定相关性,可作为判断食管癌恶性程度、转移潜能及预后的实验室指标.     

大肠埃希菌临床分离株的基因组结构分型研究

目的 通过基因组结构分析对临床分离的大肠埃希茵进行分型,并探讨型别与临床疾病的关系。方法 取临床不同疾病病人的痰、尿、血、分泌物等标本,分离大肠埃希菌。用I-CeuI酶切全基因组DNA以及用脉冲场凝胶电泳分离DNA片段后,根据酶切图谱的异同进行分型。结果 从临床上分离的64株大肠埃希菌中,62株有7个I-CeuI酶切住点,2株有8个I-CeuI酶切位点。菌株间I-CeuI酶切图谱差异明显。这些菌株根据基因组结构的差异分为32个型,某些疾病与特定基因组型密切相关。结论 临床分离的大肠埃希菌基因组结构存在多样性,其与临床疾病之间存在一定的对应关系,但尚需大宗病例进一步研究。     

人巨细胞病毒的PCR检测

①目的 寻找早期快速检测人类巨细胞病毒（HCMV）感染的敏感方法。②方法 用HCMV即刻早期（IE）基因和晚期（LA）基因的7对待异性引物分别进行普通聚合酶链的反应（PCR），套式PCR（nPCR)和双重PCR，检测血清中的HCMV DNA，比较不同引物及不同PCR方法的灵敏度。③结果 同一基因的不同引物扩增HCMV DNA灵敏度差别无显著意义；LA基因的引物扩增灵敏度高于IE基因的引物；3种方法中以nPCR灵敏度最高，其次为双重PCR，普通PCR最低。④结论 用LA基因的特异性引物进行nPCR是早期快速检测HCMV感染的敏感方法。     

应用PCR—SSCP检测结核分支杆菌链霉素耐药基因的研究

结核病耐药问题十分严重，传统的药敏实验需1～2月。Sm是一线抗结核药物，结核分支杆菌耐Sm最常见的分子机制是由于核糖体S12蛋白编码基因（rpsL）突变。该文应用PCR－SSCP分析了62个结核分支杆菌临床分离株的rpsL基因，以H37Rv标准菌株为对照，13个药物敏感菌株中12个rpsL基因未见SSCP异常；37个耐Sm株中，31个（83．8％）有rpsL基因泳动异常；12个耐其它抗结核药物林中，仅1个单链DNA泳动异常。因此，PCR－SSCP有希望成为简便、快速地检测结核分支杆菌耐药突变株的方法，弥补常规药敏试验的不足，指导临床治疗。     

急性白血病多药耐药基因MDR1表达及临床意义

①目的　探讨急性白血病（ Ａ Ｌ）多药耐药基因 Ｍ Ｄ Ｒ１ 的表达及临床意义。②方法　采用半定量逆转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）,对７７ 例 Ａ Ｌ病人及 １０ 例正常人 Ｍ Ｄ Ｒ１ 基因表达进行检测。③结果　７７ 例 Ａ Ｌ病人 Ｍ Ｄ Ｒ１ 阳性率为６４．９％ （５０／７７）,其平均表达水平为 ０．２６±０．１９,与对照组比较,差异无显著性（χ２ ＝ ０．０９４,ｔ＝１．５４８, Ｐ＞ ０．０５）;复发组和临床耐药组表达水平明显高于初治组和完全缓解组（ｔ＝ ２．４９,２．４４, Ｐ＜ ０．０５）。④结论 Ａ Ｌ的临床耐药和复发与 Ｍ Ｄ Ｒ１ 的过度表达有关