干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

背景：骨髓间质干细胞体内、外均能分化为心肌细胞，但数量少且定向分化率较低。 目的：探讨干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的作用。 设计：开放性实验。 单位：咸宁学院心血管疾病研究所，华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科。 材料：实验于2003-10／2004—08在咸宁学院心血管疾病研究所实验中心完成。选取出生1-2d的SD新生大鼠20只，用于心肌细胞的培养。另选取清洁级成年SD大鼠25只，随机数字表法分为干细胞因子组、空白对照组，12只／组，剩余1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取、培养及纯化。 方法：①在共培养前用4，6-联脒-2-苯基吲哚标记骨髓间充质干细胞。干细胞因子组对大鼠进行体内动员，连续5d皮下注射重组鼠干细胞因子，20μg／（kg&;#183;d），然后提取其骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。空白对照组皮下注射相等剂量的生理盐水，未施加任何干预的骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。②用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测MHC α／β、肌钙蛋白T的表达，测定4，6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的百分率。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞生长情况。②检测4，6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的核标记率。③拟做共培养的心肌细胞活力、纯度分析。④共培养后骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化情况。 结果：①骨髓细胞悬液接种于塑料培养皿，细胞呈圆形散在分布于瓶底，24h换液后可见稀少的长梭形贴壁细胞，4d后梭形贴壁细胞开始增多，进入对数增长期，8～12d达到80％的融合。传代细胞增殖更加迅速，随着换液与传代，骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。②4，6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的胞核标记率为100％。③心肌细胞体外培养第3天，搏动细胞的百分比为63％，搏动频率40～60次／min。免疫细胞化学技术检测肌钙蛋白T表达的阳性细胞百分比为75％。④在共培养的第2，3天，干细胞因子组4，6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达MHC α／β的阳性百分率均显著高于空白对照组（P〈0.01）；在共培养的第3，4，5天，干细胞因子组4，6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达肌钙蛋白T的阳性百分率亦均显著高于空白对照组（P〈0．01）。 结论：干细胞因子对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖分化作用。     

4,6-联脒-2-苯基吲哚标记超薄表皮片移植效果体内示踪评价

目的:评价4,6-联脒-2-苯基吲哚作为荧光示踪剂在标记超薄表皮片移植中的效果,为研究表皮片移植后细胞增殖和分化现象奠定基础。方法:实验于2005-01/05在解放军总医院第一附属医院全军创伤修复实验室完成。表皮片用中性蛋白酶分离自人环切术的包皮。①分离出的表皮片分为两组,空白对照组和实验组,实验组移植前用激发蓝色荧光的4,6-联脒-2-苯基吲哚标记皮片,空白对照组以磷酸盐缓冲液代替。②将表皮片随机移植于8只裸鼠32个创面,分别于移植4d和7d后取材。③用冰冻技术将皮片及其下组织切成厚度约为5μm的冰冻切片,选用罗丹明标记的广谱抗角蛋白抗体作为参照荧光,常规处理后在荧光显微镜观察皮片的染色效果。结果:8只裸鼠均进入结果分析。①皮片移植后的生长情况:空白对照组16个创面13个成活良好;4,6-联脒-2-苯基吲哚组16个创面14个成活良好。两组皮片成活率差异无显著性意义(χ2=1.34,P>0.05)。②皮片移植后的荧光显色结果:荧光显微镜下,4,6-联脒-2-苯基吲哚组可见圆点状的蓝色激发荧光;皮片激发的蓝色荧光与鼠源性组织的自发荧光有明显的对比度,在红色波长激发下可见皮片呈现均匀不一的红色荧光,合成荧光显色表明蓝色荧光多位于中央细胞核区域,红色荧光位于胞浆区域,荧光的对比度明显,且在皮片标记的8d之内荧光未见明显的衰退现象。结论:用4,6-联脒-2-苯基吲哚示踪移植表皮片,效果良好且标记稳定,故4,6-联脒-2-苯基吲哚可以在表皮片移植的细胞增殖分化研究中加以运用。     

骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠血管内皮功能的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死对血管内皮功能的影响。方法:实验于2005-09/2006-06在唐山工人医院中心实验室完成。①选用清洁级健康近交系SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组、细胞培养基组,10只/组。另取1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取。②大鼠处死后无菌条件下分离股骨和胫骨,剔除肌肉、骨膜,剪一侧骨端,用10mL无血清DMEM低糖培养基冲出骨髓细胞后,收集冲洗液制成单细胞悬液,过滤离心,弃上清液,密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞。待细胞80%贴满培养瓶底时,用乙二胺四乙酸和胰蛋白酶混合消化传代。将4,6-二脒-2-苯基吲哚以50mg/L浓度加入第3代细胞培养基中,制成细胞悬液备用。③术前各组大鼠均行气管插管,建立急性心肌梗死模型,以远端供血区心肌组织颜色苍白、心电图检测Ⅱ导联ST段持续抬高为模型建立成功的标志。假手术组仅开胸予以前降支穿线但不结扎。④造模成功后1～3h,干细胞移植组用微量注射器吸取4,6-二脒-2-苯基吲哚标记好的第3代骨髓间充质干细胞悬液50μL,直接注入梗死区边缘的心肌组织。细胞培养基组按干细胞移植组的方法于相同部位注射等量无血清DMEM低糖培养基(pH值6.9)。⑤造模后4周处死各组大鼠,切取心脏组织,于梗死边缘区心肌组织制作切片,荧光显微镜下观察4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的供体细胞。留取2mL全血,离心后抽取血清500μL,酶联免疫吸附法测定血清中细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量。结果:40只大鼠均进入结果分析。①体外培养骨髓间充质干细胞的性状观察:从正常大鼠骨髓中分离培养的原代骨髓间充质干细胞,24～48h贴壁生长,短棒状;7～10d达到80%～90%融合;传至第3代骨髓间充质干细胞分布均匀,呈纺锤形。②各组心脏标本4,6-二脒-2-苯基吲哚标记移植细胞的存活状况:干细胞移植组可见成团及散在的4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的阳性细胞,其余3组心脏标本中均未见荧光细胞。③各组大鼠血清中细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量检测:与假手术组比较,模型对照组、细胞培养基组、干细胞移植组细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量均明显升高(P<0.01或0.05);与模型对照组比较,干细胞移植组细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量均有所降低[(3.37±0.14),(2.10±0.15)μg/L;(2.64±0.13),(1.74±0.06)μg/L;P均<0.05]。结论:骨髓间充质干细胞移植到实验性大鼠心肌梗死模型后成功存活,能降低血清中增高的细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1含量,提示骨髓间充质干细胞移植可能通过降低黏附分子的表达来改善血管内皮功能。     

Notch信号系统调控骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:Notch信号系统在调控骨髓间充质干细胞的定向分化中起关键作用,但尚无涉及干细胞分化为心肌细胞及其分化机制的报道.目的:分析Notch信号系统在骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中的调控作用.方法:将分离培养的骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,Jagged1组加入Notch激活剂Jagged1,DAPT组加入Notch激活剂Jagged1和抑制剂DAPT,对照组加入PBS缓冲液.用反转录-聚合酶链反应、免疫组化等方法检测干细胞分化为心肌细胞的情况及Notch信号系统的表达.结果与结论:骨髓间充质干细胞在体外可分化为心肌细胞,与DAPT组及对照组相比,Jagged1组的干细胞分化为心肌细胞的比率提高,心肌标志物表达增多,并且Notch1和Jagged1表达增强.证实Notch信号系统对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞起正向调控作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞增殖及定向分化能力的增龄性变化

背景：自体骨髓间充质干细胞移植治疗心血管疾病已经成为当前研究的热点之一,但是患者自体骨髓间充质干细胞的增殖能力及向心肌样细胞方向分化的能力是否随年龄的改变而有所变化尚不清楚。目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的增龄性差异。方法：纯化培养不同年龄组 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪分析其细胞周期,同时骨髓间充质干细胞与乳鼠心肌细胞共培养,细胞免疫荧光技术分析骨髓间充质干细胞心肌肌钙蛋白T的表达。结果与结论：流式细胞仪分析显示处于G0/G1期骨髓间充质干细胞的百分率随年龄的增加而增加;骨髓间充质干细胞的肌钙蛋白T表达率亦随年龄的增加而减少。结果表明大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与定向分化能力随着年龄的增长而下降。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的:观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法:体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论:人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

Notch信号系统调控骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：Notch信号系统在调控骨髓间充质干细胞的定向分化中起关键作用,但尚无涉及干细胞分化为心肌细胞及其分化机制的报道。目的：分析Notch信号系统在骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中的调控作用。方法：将分离培养的骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,Jagged1组加入Notch激活剂Jagged1,DAPT组加入Notch激活剂Jagged1和抑制剂DAPT,对照组加入PBS缓冲液。用反转录-聚合酶链反应、免疫组化等方法检测干细胞分化为心肌细胞的情况及Notch信号系统的表达。结果与结论：骨髓间充质干细胞在体外可分化为心肌细胞,与DAPT组及对照组相比,Jagged1组的干细胞分化为心肌细胞的比率提高,心肌标志物表达增多,并且Notch1和Jagged1表达增强。证实Notch信号系统对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞起正向调控作用。     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

大鼠骨髓间充质干细胞表达心肌基因表型的时间依赖效应

背景:前期实验已经证实30%心肌培养上清是诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度.目的:在前期实验基础上,观察30%心肌培养上清条件下诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的时间依赖效应.设计、时间及地点:对比观察,于2007-08/2008-06在徐州市心血管病研究所完成.材料:健康成年SD大鼠,体质鼍180～220 g.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞和心肌细胞并在体外培养纯化.以1×108L-1的细胞密度种植心肌细胞,培养72 h后收集上清.将骨髓间充质干细胞的DMEM/F12培养基换为含有30%M199心肌细胞培养上清作为实验组,对照组仍将细胞接种在DMEM/F12培养基上继续培养.主要观察指标:30%心肌细胞培养上清诱导7,14,21d后,应用免疫细胞化学技术检测骨髓间充质干细胞中α-平滑肌肌动蛋白、β-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达.结果:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞后,细胞的形态没有改变,但与对照组相比,α-平滑肌肌动蛋白、β肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达均呈阳性,其中以第14天的蛋白表达量最高(P＜0.01).结论:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳诱导时间是14 d.     

骨髓间充质干细胞旁分泌途径与阿霉素损伤心肌细胞凋亡:怎样证明其抑制效应?

背景:近来研究发现骨髓间充质干细胞移植后短期心功能受益主要是因为其可分泌多种细胞因子,促进了内生性修复过程,而不是心肌细胞的再生.目的:观察骨髓间充质干细胞旁分泌途径对阿霉素损伤心肌细胞凋亡的影响.方法:体外培养的乳鼠心肌细胞按3×10~8~(-1)浓度加入6孔培养板,3 mL/孔,培养72 h后分为3组:阿霉素损伤组、共培养组加入1 mg/L阿霉素作用4 h建立心肌细胞损伤模型,正常对照组不进行任何干预.共培养组取培养至第3代大鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为3×10~8~(-1),以3 mL/孔加入共培养插件Millicell装置中,预培养24 h,在造模后将Millicell装置插入到预先培养心肌细胞的6孔培养板中,建立共培养体系.检测条件培养基内细胞因子的质昼浓度变化,骨髓间充质干细胞对阿霉素损伤心肌细胞Caspase-9和Caspase-3活性、细胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.结果与结论:与正常对照组比较,阿霉素损伤组胰岛素样生长因子1及肝细胞生长因子的质量浓度、心肌细胞Caspase-3及Caspase-9活性、心肌细胞凋亡率,心肌细胞Bax蛋白表达均明显升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白表达明显降低(P＜0.05).与阿霉素损伤组比较,共培养组胰岛素样生长因子1及肝细胞生长因子的质量浓度、心肌细胞Bcl-2蛋自表达均明显升高(P＜0.05),心肌细胞Caspase-3及Caspase-9活性、心肌细胞凋亡率、心肌细胞Bax蛋白表达均明显降低(P＜0.05).结果证实骨髓间充质干细胞在损伤环境下细胞因子分泌增加,并可通过旁分泌途径抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡.     

大鼠骨髓间充质干细胞体内造血分化过程中加入硝普钠的作用

背景:硝普钠作为血管扩张剂加入骨髓间充质干细胞培养过程中,对其分化潜能发生何种影响?目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化过程中加入硝普钠后的变化,并与单纯细胞移植的效果进行比较。设计:随机区组,对照观察。单位:广东医学院微生物免疫学教研室,广州医学院病理生理教研室。材料:实验于2006-08在广州医学院完成。选取清洁级出生七八周balb/c小鼠27只作为受体,随机数字表法分为3组:细胞移植组、硝普钠 细胞移植组、空白对照组,9只/组。另选取4周龄SD大鼠1只作为实验用骨髓间充质干细胞的供体来源。注射用硝普钠(50mg/支,北京双鹤现代医药技术有限责任公司,国药准字H11020907)。方法:①无菌条件下取出SD大鼠的股骨,进行骨髓间充质干细胞的分离培养。传至六七代作为供体细胞,消化离心,调整浓度为1×109L-1。细胞悬液中加入荧光素标记的抗体,流式细胞术检测表型。②取50mg/支的注射用硝普钠1支,加入2.5mL生理盐水混匀,从中取出1.0mL液体加入到100mL的生理盐水中,配成终浓度为200mg/L,配置后4h内使用。③各组小鼠细胞移植前均经5.0GyX射线全身照射4h,吸收剂量率为1.45Gy/min。照射完毕后,细胞移植组直接经尾静脉输注0.3mL骨髓间充质干细胞悬液(含1.5×106个细胞);硝普钠 细胞移植组先注射已配好的200mg/L硝普钠液体0.15mL,1min后立即输注骨髓间充质干细胞悬液0.3mL(含1.5×106个细胞);空白对照组输注等量无血清培养液。④移植后60d,各组存活小鼠眼眶外周取血,处死后常规制备骨髓及脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测大鼠源性造血细胞CD11a与CD45的植入水平。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞培养扩增情况。②不同组织大鼠源性造血细胞的植入水平检测。结果:作为受体的27只balb/c小鼠均存活至实验结束。①骨髓间充质干细胞培养扩增情况:培养3d后细胞贴壁,形态比较均一,长梭形,至第6天细胞90%融合,无重叠。传代后24h内细胞完全贴壁,长梭形,增殖生长迅速,3d即达到完全融合。②不同组织大鼠源性造血细胞的植入水平检测:细胞移植组、硝普钠 细胞移植组在外周血、骨髓、脾细胞悬液中均可检测到低表达的大鼠源性造血细胞CD11a与CD45,且硝普钠 细胞移植组明显强于细胞移植组(t=2.619,P<0.05);空白对照组CD11a与CD45呈阴性表达。结论:大鼠骨髓间充质干细胞具有向造血细胞分化的潜能,硝普钠可促进其分化。     

骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨

背景:骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力.目的:验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限.方法:①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞.实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照.②取20只兔.建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组.实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞:空白对照组植入生理盐水.分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测.主要观察指标:①细胞形态学.②碱性磷酸酶活性的测定.③大体标本观察.④X射线观察.⑤组织切片观察.结果:①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态.②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P＜0.05).③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清:X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善:组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致.结论:自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤.     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力

背景:骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后,其分布和定居情况不明,这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床。目的:探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),经不同途径移植到同种异体大鼠,其定居于肝脏的能力。设计:析因设计。单位:广东省第二人民医院普外科/中山大学博士后科研基地,南方医科大学珠江医院普通外科,中山大学附属第三医院器官移植科。材料:实验于2003-01/2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成。选取清洁级成年SD大鼠36只,随机分为5组:CCL4 门静脉移植组(6只)、门静脉移植对照组(6只)、CCL4 尾静脉移植组(6只)、尾静脉移植对照组(6只)、混合组(12只)。方法:①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,以细针移植骨髓间充质干细胞悬液,移植量为0.5mL/100g。②CCL4 门静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。门静脉移植对照组:骨髓间充质干细胞移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。CCL4 尾静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。尾静脉移植对照组:移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。混合组:前4组条件下,各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞;另设CCL4喂养3d和正常喂养大鼠各2只,不行骨髓间充质干细胞移植。③于移植后的第3,7天,通过荧光定量PCR检测各组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠肝脏的表达。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外扩增及表型鉴定结果。②绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞结果。③移植同源异体骨髓间充质干细胞后大鼠的生长情况观察。④各组肝脏组织中绿色荧光蛋白阳性DNA数的定量检测结果。结果:实验选取SD大鼠36只全部进入结果分析。①Percoll梯度分离液分离大鼠骨髓,所获得的细胞传代、扩增后,形态呈基本一致的梭性。细胞表面不表达CD34与CD45,而表达CD29,CD44,CD90等骨髓间充质干细胞的表面标志,是骨髓中区别于造血干细胞的另一群处于未分化状态的非定向干细胞。②骨髓间充质干细胞转染24h后即可见发绿色荧光的细胞。48～72h阳性细胞明显增多,强度增强,高倍视野下转染率达20%～30%,多为明亮的绿色荧光的细胞。作为对照的骨髓间充质干细胞中未发现发绿色荧光的细胞。③所有大鼠从不同途径移植标记或未标记的同源异体骨髓间充质干细胞后,第1天精神、食欲差,少活动;移植后第2天基本恢复正常饮食和精神,各组大鼠之间无明显差异。④除混合组外,其余各组于移植术后第3,7天,肝脏内均可检测到含绿色荧光蛋白阳性细胞。且CCL4 门静脉移植组、CCL4 尾静脉移植组肝脏组织中的绿色荧光蛋白阳性DNA数显著高于门静脉移植对照组、尾静脉移植对照组升高(P<0.05)。结论:干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损有关,与移植途径关系不密切。正常动物肝脏未受损情况下,干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径、移植后时间相关。     

骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养诱导分化为心肌样细胞

本研究探讨间充质干细胞（MSC）分化为心肌细胞（CM）的能力。对大鼠源MSC进行标记并将大鼠源MSC与初生大鼠CM直接接触共培养5—7天，诱导MSC向CM分化。用流式细胞仪检测细胞表面抗原，免疫荧光法检测标记细胞的心肌特异性标记物肌球蛋白和肌钙蛋白T表达。结果显示：体外培养的MSC表达CD90、CD44、CD105、CD54，不表达CD34、CD45、CD31等造血细胞、内皮细胞相关抗原。MSC与CM直接接触共培养后可分化为心肌样细胞，表达心肌特异蛋白肌钙蛋白T和肌球蛋白，CM与MSC比例为4：1时，MSC分化为心肌样细胞的比例最高。结论：MSC在与CM直接接触共培养条件下可被诱导分化为心肌样细胞，两种细胞按4：1比例混合培养后MSC分化为心肌细胞的效果最明显：     

粒细胞集落刺激因子与干细胞因子合用对急性心肌梗死模型大鼠心功能的影响

背景:骨髓干细胞动员以其无创伤、无免疫排斥反应,不需要干细胞提取、培养、扩增等工作倍受青睐。目的:观察联合应用粒细胞集落刺激因子和干细胞因子对大鼠急性心肌梗死的治疗作用。设计:随机对照观察。单位:锦州医学院药理教研室实验室。材料:选用32只成年雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,购自锦州医学院实验动物中心。重组人粒细胞集落刺激因子(北京双鹭制药),重组人干细胞因子(成都地奥有限公司)。方法:实验于2005-07/11在锦州医学院药理教研室实验室进行。①5mg/kg盐酸异丙基肾上腺素左下腹腔注射复制急性心肌梗死模型,3h后将大鼠随机分为4组,每组8只。综合治疗组:用生理盐水稀释浓度至10mg/L的重组人粒细胞集落刺激因子1mL/kg和重组人干细胞因子1mL/kg皮下注射,连续5d。粒细胞集落刺激因子组:单用生理盐水稀释浓度至10mg/L的rhG-CSF1mL/kg皮下注射,每只大鼠和综合治疗组大鼠注射药品差量用生理盐水(1mL/kg)补足,连续5d。干细胞因子组:单用生理盐水稀释浓度至10mg/L的人干细胞因子1mL/kg皮下注射,每只大鼠和综合治疗组大鼠注射药品差量用生理盐水(1mL/kg)补足,连续5d。对照组:单用生理盐水(2mL/kg)皮下注射。②分别于造模后第14d和28d,摸球法从每组大鼠中抽取4只麻醉,自左心室心尖部插入内充肝素钠的塑料管至左心腔,用Medlab-u18c生物信号采集处理系统描记左心室峰压,左心室舒张末压,左室内压最大上升/下降速度,并同步记录心率。拔出气管插管,立即剪掉心脏,剪掉心房及右心室,微量天平称重,计算左心室质量/体质量,评估心肌重塑情况,将组织块切片,光镜下观测大鼠心肌病理形态及梗死面积。采用细胞图像分析仪病理图文分析每组大鼠心肌梗死面积。主要观察指标:各组大鼠左心功能指标、心肌梗死面积、心率和心室重塑情况及大鼠心肌病理形态。结果:纳入大鼠32只全部进入结果分析,无脱落。①大鼠左心功能指标比较结果:综合治疗组大鼠造模14,28d后左心室收缩压、左心室舒张末压、左心室内压最大上升/下降速度高于其他3组,造模28d时上述各指标均高于14d,差异有统计学意义(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组两时间点上述指标均大于干细胞因子组及对照组(P<0.05)。②大鼠两时间点心肌梗死面积、心率和心室重塑情况:综合治疗组大鼠造模14,28d后心肌梗死面积及左心室重量小于其他3组,造模后28d心肌梗死面积小于14d(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组两时间点上述指标均小于干细胞因子组与对照组。③大鼠心肌病理形态改变:造模后14及28d,综合治疗组和粒细胞集落刺激因子组均未见明显心肌瘢痕组织,有新生毛细血管生长,粒细胞集落刺激因子组毛细血管密度小于综合治疗组,均有成纤维细胞浸润。干细胞因子组和对照组可见瘢痕组织呈散在的灶性分布,有成堆或散在分布的淋巴细胞,其核小、深染、胞浆少,细胞间胞浆融合,新生肉芽组织增生不明显。结论:粒细胞集落刺激因子和干细胞因子合用对急性心肌梗死大鼠缺血损伤心肌的保护和再生作用优于单用,可改善急性心肌梗死大鼠的心室功能。     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化

背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚。“环境诱导分化学说”认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用。骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验。单位:西安交通大学第一医院心内实验室。材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成。SD大鼠60～80g、90～110g,雌雄不限,由本校动物中心提供。PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen)。方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照。骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%。细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室。将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%。用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。③骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞混合培养,观察细胞形态变化。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果。②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果。结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性。骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性。②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90。③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周。④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好。骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性。骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞。②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

纳米晶羟基磷灰石与兔骨髓间充质干细胞复合培养回植体内的成骨性能

背景:骨髓间充质干细胞具有自我更新及多向分化的能力,经诱导后能够向成骨细胞分化,与基质材料结合可以具备形态功能良好的骨缺损修复效应。目的:观察骨髓间充质干细胞与基质材料复合后同体移植修复节段性骨缺损的成骨性能。设计:开放性实验。单位:无锡市第三人民医院细胞实验室。材料:实验于2004-05/2005-03在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。选取清洁级6月龄新西兰兔18只,随机数字表法分为细胞支架复合组、单纯支架组、空白对照组,6只/组。支架材料由清华大学材料系生物组提供纳米晶羟基磷灰石胶原材料,具备天然骨微结构特征(组成:羟基磷灰石约57%,胶原约30%,聚乳酸约13%)。方法:①分离培养兔骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代细胞应用EPICS-ALTRA流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。②支架材料按实验需求切割成6mm×6mm×4mm大小,60Co辐照灭菌,使用前DMEM-LG浸润。收集培养两三代的细胞,调整浓度为109L-1,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养。③各组均建立兔桡骨节段性缺损模型。细胞支架复合组将已备好的复合物采用同体移植的原则嵌入骨缺损中,单纯支架组将空白支架材料嵌入骨缺损中,空白对照组不植入任何材料。各组动物均不作内外固定,严密缝合软组织、皮肤。④扫描电镜下观察各组材料表面结构及细胞附着情况。⑤各组分别于术后4,8,16周行大体观察、组织学分析及X光摄片,了解成骨情况。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定情况。②各组扫描电镜观察结果。③术后各组放射学检测结果。④术后各组大体形态观察结果。⑤术后各组组织学检测结果。结果:实验选取清洁级新西兰兔18只,全部进入结果分析。①原代培养4h后可见有贴壁细胞,静置培养48h后贴壁细胞呈克隆样生长,细胞多为不规则鳞片状,胞体大,核居中。流式细胞仪检测可见CD29,CD44,CD105呈阳性,3种阳性细胞比率分别为97.4%,98.1%,86.2%。②单纯支架组表面不规则,孔隙较多。细胞支架复合组材料表面及孔隙内均有细胞附着。③术后4,8,16周各时间点细胞支架复合组X线片吸光度均高于单纯支架组、空白对照组,且16周时细胞支架复合组可见骨性愈合。④术后16周细胞支架复合组骨痂已能环包植入物,单纯支架组植入物中段仍有部分未被骨组织覆盖,空白对照组没有成型骨痂形成。⑤细胞支架复合组术后各时间点的成骨能力均强于单纯支架组,且16周时有骨小梁形成,成骨细胞排列有序。单纯支架组骨组织大多集中于材料表面,材料吸收少。空白对照组缺损近端有少许新生骨样组织形成,中段则未见。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合培养具有很强的成骨作用,是一种较好的组织工程种子细胞。     

骨髓间充质干细胞体内分化为肾小管上皮细胞的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能否在体内分化为肾小管上皮细胞。方法取SD雄性大鼠胫、股骨骨髓,密度梯度离心法分离MSCs,采用4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)进行标记。32只雌性SD大鼠复制缺血再灌注肾损伤模型后随机分为移植组和对照组,移植组于缺血45min后经下腔静脉注入用DAPI标记的MSCs,对照组注入等量的生理盐水。分别于术后1d、2d、3d、4d处死大鼠,留取肾组织,荧光显微镜观察移植的MSCs在肾组织中的分布,采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素(Ricinus communis agglurinin,RCA)对迁移入肾脏的MSCs分化状况进行鉴定。结果移植组术后第三天肾组织内可见DAPI标记细胞,第四天DAPI标记细胞明显增多(P<0.05),且多数DAPI标记细胞能结合RCA。对照组没有发现DAPI标记细胞。结论移植的外源性MSCs能够迁移、定居于肾组织中并分化为肾小管上皮细胞。     

同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮细胞生长因子基因转染治疗心肌梗死

背景:骨髓间质干细胞和血管内皮细胞生长因子移植具有促进血管再生、改善心功能的作用,但是二者联合应用是否优于单独应用尚不清楚。目的:观察同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠急性心肌梗死血管再生和心功能的影响。设计:大鼠骨髓间质干细胞培养采用单一样本观察;细胞移植和基因转染采用随机对照动物实验。单位:华中科技大学协和医院心内科,同济医学院心血管病研究所。材料:健康雄性Wistar大鼠94只。表达载体PAdTrack/VEGF165。方法:实验于2004-06/2005-06在同济医学院心血管病研究所实验室完成。①体外分离、纯化、培养大鼠骨髓间质干细胞,以5-溴-2’-脱氧尿苷标记细胞。②制备、抽提、纯化、鉴定质粒PAdTrack/VEGF165。③结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型2周后,随机将其分为4组,每组均为12只,干细胞 质粒组、干细胞组、质粒组、对照组,分别进行心肌内大鼠骨髓间质干细胞移植和/或VEGF165转染、DMEM注射。④4周后行免疫组织化学和超声心动图检查。主要观察指标:①各组大鼠梗死及缺血区免疫组织化学和苏木精-伊红染色检查。②血管计数。③超声心动图检查。结果:48只大鼠进入结果分析。①干细胞 质粒组和干细胞组梗死及缺血心肌处可见大量5-溴-2’-脱氧尿苷标记的移植细胞,其中缺血心肌处部分移植细胞分化为血管内皮细胞并形成新生毛细血管。②Ⅷ因子染色阳性的新生血管密度分布为干细胞 质粒组>质粒组>干细胞组>对照组(P均<0.01)。③细胞移植和基因转染治疗后室壁厚度和室壁运动幅度改善,射血分数值增加幅度为干细胞 质粒组>干细胞组>质粒组>对照组(P均<0.01)。结论:同种异体骨髓间质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染能进一步增强大鼠梗死缺血区血管再生、改善室壁厚度和心功能。     

兔骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境诱导下向肌纤维母细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞可以促进肿瘤间质重构,但具体机制尚不明确,而肌纤维母细胞则是肿瘤间质重构过程中发挥重要作用的一类细胞.目的:观察骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境诱导下能否分化为肌纤维母细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内移植实验,于2006-06/2007-12在山东大学齐鲁医院低温医学实验室完成.材料:3月龄雄性新西兰大白兔12只,购自山东省农业科学院.方法:穿刺抽取兔骨髓,密度梯度法分离培养骨舒间充质于细胞,传至第2代行DAPI标记,调整细胞密度为5×10~(10) L~(-1),分为2组:实验组加入含体积分数为10%胎牛血清、30% VX2瘤细胞株培养上清的低糖DMEM,对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM,培养14 d.向兔大腿肌肉内注入VX2细胞悬液,2周后触摸到生成肿瘤后,抽取DAPI标记的第2代骨髓间充质干细胞悬液100 μL,从前后左右4个方向均匀回输入肿瘤组织内,3周后取材.主要观察指标:采用免疫荧光法和RT-PCR检测骨髓间充质干细胞中α-SMA和Vimentin的表达,免疫荧光法鉴定骨髓间充质干细胞回输后在肿瘤组织中的分布及分化.结果:第2代骨髓间充质干细胞经VX2培养上清诱导2周后,Cy3免疫荧光结果显示α-SMA和Vimentin呈强阳性表达,对照组呈弱阳性表达.与对照组比较,实验组α-SMA及Vimentin mRNA的表达水平均明显升高(P＜0.01,P＜0.05).回输入 VX2肿瘤组织3周后,骨髓间充质干细胞主要分布于肿瘤间质,其细胞核周围胞浆中α-SMA和Vimentin均呈强阳性表达,表明骨髓间充质干细胞在肿瘤组织中已分化为肌纤维母细胞.结论:在肿瘤微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞可以分化为肌纤维母细胞,从而促进肿瘤的生长与发展.