外源性p16基因对人前列腺癌的作用

目的:研究外源性p16基因对人前列腺癌PC-3M细胞系生长及致瘤性的抑制作用,探索前列腺癌基因治疗的新途径.方法:利用携带约800 bp的外源性p16 cDNA的真核表达质粒,通过脂质体介导将其导入人前列腺癌PC-3M细胞系中,用G418筛选阳性克隆,经流式细胞仪及细胞生长曲线测定等方法研究p16基因对人前列腺癌细胞周期生长特性的影响,并观察导入外源性p16基因的人前列腺癌细胞PC-3M对裸鼠致瘤能力的影响.结果:野生型p16基因转染到有p16基因缺失的人前列腺癌细胞PC-3M上,细胞周期明显变化,细胞从G1期到S期发生抑制,细胞增殖活性降低.结论:转染外源性p16基因可阻止人前列腺癌细胞由G1期进入S期,并使肿瘤恶性增殖受到抑制.     

上调stathmin基因表达对食管鳞癌EC9706细胞的作用

目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25～28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点.     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

3p21.3区域肺癌相关基因RASSF1A的抑癌功能研究

目的观察将野生型RASSF1A通过质粒载体pcDNA3.1导入不表达该基因的非小细胞肺癌(NSCL)细胞系A549后,肺癌细胞生物学特性的变化.方法通过脂质体Lipofectamine2000将质粒载体pcDNA3.1,pcDNA3.1-RASSF1A分别转染入A549细胞系中,通过流式细胞仪检测瞬时转染该基因对细胞周期的影响以及是否诱发凋亡;通过绘制细胞生长曲线,MTT检测,以及集落形成实验来分析稳定转染细胞的生物学特性;同时分析稳定转染RASSF1A对A549细胞裸鼠转移能力的影响.结果瞬时转染RASSF1A使细胞周期阻断在G1/S期(P<0.001);稳定转染该基因的细胞其增殖能力和集落形成能力均显着下降(P<0.01),同时裸鼠转移能力也明显被抑制(P<0.01).结论野生型RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制肿瘤细胞的生长和转移,提示该基因在肺癌的发生发展中发挥重要作用.     

炎症信号受体TLR-4基因的克隆及真核表达

为探讨TLR 4基因在真核细胞的表达情况 ,用RT PCR技术从人脐静脉血管内皮细胞总RNA扩增TLR 4全密码子cDNA序列。限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切真核表达质粒pcDNA3和TLR 4cDNA片段 ,构建重组质粒pcDNA3 TLR4。用Dosper阳离子转染试剂包裹质粒 ,转染人胚肾 2 93细胞 (HEK 2 93细胞 )。用免疫荧光细胞化学染色及流式细胞术分析TLR 4基因表达。结果 :从人脐静脉血管内皮细胞扩增出 2 72 6bp的TLR 4cDNA片段。经PCR、酶切及序列测定分析证实质粒 pcDNA3内插入了TLR 4cDNA片段 ,免疫荧光细胞化学染色和流式细胞术分析均检测到TLR 4基因在人胚肾 2 93细胞表达。本研究显示重组真核表达质粒 pcDNA3 TLR4在HEK 2 93细胞表达TLR 4蛋白 ,有利于进一步研究其相应配体和信号传导通路     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA.获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3.1（＋）-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响.以空白质粒转染组作为对照.结果在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因.6-10B在转染了pcDNA3.1（＋）-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1（＋）,肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低（P＜0.05）.结论结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因.获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

白血病细胞株KG-1中Mxi1基因突变的检测和表达载体的构建

目的 检测白血病细胞株KG-1中Mxil基因SID和bHLHzip区突变情况并构建Mxi1基因的野生型和突变型真核表达载体,观察其转染真核细胞后基因表达的情况。方法 应用RT-PCR和SSCP分析KG-1细胞株Mxil基因的突变,将Mxi1野生型/突变型基因cDNA插入到pDs-red2-N1质粒中,构建pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体,采用脂质体方法将质粒转染COS-7细胞,流式细胞仪检测红色荧光蛋白表达并计算转染效率。RT－PCR检测转染后Mxi1基因的表达。结果 Mxi1基因突变位于Helix II区第82编码子的CAT/TAT(His/Tyr)。成功构建pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体,经酶切、电泳可以看到在4700、1845bp存在两条电泳条带, Mxi1基因在COS 7细胞中得到表达,转染后COS-7细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞为18.07％,表达高峰出现在转染后第3天,并可持续表达6d左右。结论 Mxi1基因的高度保守区域bHLHzip存在基因突变,Mxi1突变基因的真核表达载体构建成功,并成功转染真核细胞COS-7     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响.方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓.结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长.     

PCNA蛋白突变体的真核表达载体构建及鉴定

目的构建带FLAG标签的细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白Y211A、Y211D突变型重组质粒,真核表达及鉴定。方法以FLAG-PCNA野生型基因为模板,运用PCR定点突变技术扩增出带突变位点的基因序列,将其插入真核表达载体pCMV-N-FLAG,进行双酶切实验和测序验证。然后,利用脂质体将重组质粒转染至293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果 FLAG-PCNA(Y211A)、FLAG-PCNA(Y211D)重组质粒测序结果正确,获得PCNA蛋白突变体。结论成功构建了带FLAG标签的PCNA蛋白Y211A、Y211D真核表达载体,验证了突变型PCNA融合蛋白的表达,为PCNA蛋白功能的深入研究奠定了基础。     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及
DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方
法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1（+）,二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切,经T4
DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+）中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoR
Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL及空质粒pcDNA3.1
（+）分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重
组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL
构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在
重组质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL
基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高
于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该
稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。
     

SCN3A 基因突变型表达载体的构建及在 HEK 293 细胞中的表达

目的 体外构建含有SCN3A基因mRNA片段的质粒pCMV₆-XL₄-SCN3A的突变体N302S(c.905A>G),为进一步的功能研究奠定实验基础。方法设计带突变位点的引物,以野生型质粒为模板进行定点诱变,构建突变质粒。质粒经扩增纯化后瞬时转染到HEK293细胞中,24 h后用RT-PCR方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定及测序证实突变成功。突变质粒转入HEK293细胞系24 h后,RT-PCR可以检测到目的基因的表达。结论本实验成功地构建了SCN3A 基因突变型真核表达载体pCMV₆-XL₄-SCN3A-N302S,并在基因水平上验证了能在HEK293 细胞中表达。     

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,

Abstract：

Objective To construct a eukaryotic fluorescent expression vector of truncated lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF-1) gene and investigate its effect on the proliferation and apoptosis of human colonic carcinoma cell line SW480. Methods Truncated LEF-1 gene was obtained by PCR and DNA recombination from human lymphoid node cDNA library. The PCR product of LEF-1 gene was inserted into the plasmid pMD-18T and sequenced. The truncated LEF-1 gene was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 and fused with mRFP for tracing. Using Lipofectamine~(TM) 2000, the plasmid pcDNA3.1 -LEF-1 -mRFP was transfected into Hela cells and detected by Western blotting and fluorescence activated cell sorting (FACS). The changes in the growth, proliferation and apoptosis of the SW480 cells were observed after transfection with the plasmids. Results The truncated LEF-1 gene was successfully cloned. After transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, the Hela cells expressed the product of LEF-1 as detected by Western blotting and FACS. The growth and proliferation of SW480 cells was inhibited and the cell apoptosis increased after transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, which also caused cell cycle arrest in G_(0/1) phase. Conclusion The eukaryotic expression fluorescent vector pcDNA3.1-LEF-1-mRFP has been constructed and expressed in eukaryotic cell line successfully. The truncated LEF-1 protein expressed in the transfected SW480 cells results in inhibition of the cell growth and proliferation with increased cell apoptosis and cell cycle arrest in G_(0/1) phase.     

外源性p16基因稳定转染对胶质瘤细胞周期和增殖的影响

目的：研究外源性ｐ１６基因对胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４的抑制作用,探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法：利用携带４９０ｂｐ的人ｐ１６全长ｃＤＮＡ真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人恶性胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４中,用Ｇ４１８筛选阳性克隆,以原位杂交,免疫组化方法检测ｐ１６基因在细胞转染前后的表达情况。,应用流式细胞仪,电子显微镜,生长曲线测定等方法研究ｐ１６基因对胶质瘤细胞周期,形态,生长等的影响.     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

稳定转染维生素D受体反义cDNA的人骨肉瘤细胞系的建立

目的：建立稳定转染维生素D受体（VDR）反义cDNA的人骨肉瘤细胞系,方法：构建VDR反义cDNA的真核表达载体,用Lipofectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS－8603,经G418筛选后获得稳定转染细胞株,并用免疫组化技术检测内源性VDR蛋白折表达情况,采用瞬时转染报告基因技术从靶基因水平检测VDRas3细胞内VDR的转录激活功能,结果“筛选出6株抗G418细胞克隆（VDRas1-6),其中VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达量低于对照细胞,激素作用72h后,对照组细胞的报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）转录活性增加约3．5倍,而VDRas3细胞CAT的转录基本不受激素诱导。结论：获得了稳定转染VDR反义cDNA的细胞系,为今后进一步研究1,25（OH）2D3及其类似物调节细胞增殖分化的分子机制提供了一个良的细胞模型。     

重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染

目的获取人突变CD59基因（HM3）并构建HM3真核表达体系,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,以获得稳定转染的细胞克隆.方法应用重组PCR定点诱变技术获得突变的CD59 DNA,进一步构建重组质粒pALTER-HM3;与pcDNA3共转染CHO细胞,转染细胞按一定比例稀释后加入G418压力筛选稳定转染细胞克隆,传代扩增培养并及时冻存备用.结果酶切及序列测定均证实成功构建了突变的pALTER-HM3重组质粒;转染细胞培养约2周后套取出G418抗性细胞克隆,获得生长较好的细胞.结论重组PCR定点诱变技术成功获得突变DNA,合适的细胞稀释有利于转染细胞克隆的筛选纯化.     

赖氨酸490突变对OATP-C分子底物转运能力的影响

目的研究人肝脏特异的有机阴离子转运蛋白基因OATP-C蛋白分子膜外区保守的490位阳离子赖氨酸对其有机阴离子底物摄取能力的影响。方法从人肝脏mRNA中克隆OATP-C野生型基因全长cDNA序列,通过定点突变将高度保守的第490位赖氨酸残基突变为中性氨基酸-苏氨酸,构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体,转染HEK293细胞,观察突变体的细胞膜定位能力和底物摄取功能的变化。结果OATP-C野生型及突变体均能定位表达于HEK293细胞质膜;[3H]硫酸盐雌酮底物摄取实验显示,突变体5min底物摄取量较野生型下降了38.66%,浓度依赖的[3H]硫酸盐雌酮底物摄取动力学分析表证明,突变体Km和Vmax分别明显增高和降低。结论OATP-C蛋白膜外区第490位赖氨酸是关键的功能氨基酸,是其重要的结构功能单位。