双抗体夹心法微量ELISA测定人血小板因子4

测定血小板因子4(PF_4)有多种方法,但是都有一定的局限性。本文介绍一种敏感性强、特异性高、重复性好的方法,即双抗体夹心微量酶联免疫吸附试验(ELISA)。测定过程如下:(1)包被:聚苯乙烯微板的每个孔加150μl缓冲液稀释的抗人PF_4抗体,置37℃孵育20小时,用PBST(磷酸盐缓冲盐水-吐温20溶液)洗4次。(2)抗原孵育:加200μl/孔含1％牛血清白蛋白的PBS,37℃1小时,板用PBST洗1次,再加入50μl/孔含已知量抗原的抗原标准液及血浆标本,37℃1小时,板用PBST洗3次。(3)标记抗体孵育:加100μl/孔用PBST稀释的辣根过氧化物酶标记     

16通道无标记型糖化血红蛋白检测免疫传感器的构建

目的构建1种检测糖化血红蛋白(HbA1c)的无标记电化学免疫传感器。方法通过HbA1c抗体修饰16通道丝网印刷碳电极(16-SPCE),制备特异检测HbA1c的无标记电化学免疫传感器。采用循环伏安法测定16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA1c的电信号,优化检测条件(HbA1c抗体最佳包被浓度、HbA1c抗原最佳孵育时间、电极的电化学特性、不同修饰电极的性能),同时进行初步方法学评价。结果 HbA1c抗体最佳包被浓度为50μg/mL,HbA1c抗原最佳孵育时间为60 min。构建的16-SPCE电化学免疫传感器检测HbA1c的线性范围为1～50μg/mL,线性方程为Y=0.199X+10.468(r=0.955),检测限为0.88μg/mL。50μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、50μg/m L前列腺特异性抗原(PSA)和50μg/m L葡萄糖对16-SPCE电化学免疫传感器检测Hb A1c无干扰。制备的免疫电极在4℃能稳定放置5 d。采用16-SPCE电化学免疫传感器检测模拟血清样本中的HbA1c,各浓度的电流响应值能明显区分,且检测结果的重复性较好。结论构建的16-SPCE电化学免疫传感器具有良好的电化学响应能力、线性范围、抗干扰能力等。     

血清中淀粉样蛋白的酶联免疫吸附测定法

本文介绍一种酶联免疫吸附方法测定人血清中的淀粉样蛋白质(SAP)。材料和方法:血清样本(健康男性100例、女性50例)、鼠抗人SAP 血清、纯化SAP 抗体。酶免疫方法:用SAP 抗体包被ELISA 反应板同时标记辣根过氧化物酶。包被液和洗液用pH7.4的磷酸缓冲液;用此液稀释样本、标准及标记抗体时需每升中加入牛血清白蛋白10g。向96孔微量反应板孔中加入100μl 磷酸缓冲液及20∶ng/L 的SAP 抗体,25℃温育16～18小时后甩干,用洗液洗四次。加入100μl 的稀释抗原,37℃温育2小时,冲洗。然后加入100μl 的标记抗体37℃温育2小时,冲洗反应板孔,最后加入100μl 的次酚     

流式细胞术检测白细胞糖皮质激素受体-α方法的建立

目的建立流式细胞术检测糖皮质激素受体-α的方法。方法使用细胞破膜剂处理EDTA2K抗凝外周静脉血,获得已被破膜的白细胞。将纯化的兔抗人GR-ot多克隆抗体与之反应,再与FITC标记的羊抗兔二抗反应,比较在不同抗体反应浓度（0．0004～0．004μg/μL）、不同的反应条件（室温、37℃及4℃）下获得的阳性细胞率及荧光强度,并比较标本处理前后放置不同时间的检测结果。最后作重复性试验。结果以一抗浓度为0．004μg/μL时荧光信号最强,但一抗浓度为0．0004～0．004μg/μL获得的结果无统计学差异。一抗在室温或者37℃孵育30min或者4℃反应6h,结果无统计学差异。标本可于4℃保存至24h处理。标本处理后最好及时检测,随时间延迟荧光信号有所下降。重复性试验显示阳性细胞百分率及荧光强度的CV值分别为3．4％与9．8％。结论建立了稳定可靠的糖皮质激素受体-α流式细胞术检测的方法。     

应用斑点ELISA快速研究鸡卵黄抗体IgY的理化性质

目的应用斑点ELISA研究卵黄抗体的理化性质,使多克隆抗体的性质得以确定,为今后更好地研究和利用该抗体奠定基础。方法将制备的卵黄抗体用不同的方法(加热、酸、碱、酶等)处理后,再用斑点ELISA检测卵黄抗体的剩余活性。结果IgY有很好的耐热性,巴氏消毒不会使IgY失活。卵黄抗体在pH>5和<9的环境下,37℃3h后仍保持部分活性。卵黄抗体在室温存放4个月后仍保持部分活性。在pH<5时,胃蛋白酶能发挥作用,使卵黄抗体失去活性。结论IgY的高度稳定性,使得这一多克隆抗体的保存和运输较方便,有利于IgY的推广和使用。     

Kidd血型抗原的Dot—blot纯化法

由于Kidd血型抗原明显的致免疫性及其系统抗体的不稳定性,所以,该抗原在输血实践中很重要。由于每个细胞上抗原位点数相当少,致Kidd抗原的纯化受到阻碍。作者介绍的改良DOT-BLOT纯化法,能够克服上述问题,并可识别人类红细胞的Kidd抗原。方法是:把经菠萝酶处理、以抗-Jk~a,抗-JK~b或抗-JK~3致敏的Panocell-10人类红细胞铺设在已固有抗-人IgG的ZP-膜上,置37℃孵育30分钟,用生理盐水和含7.5g/L辛基-β-D-吡喃葡糖苷的生理盐水洗涤、浸没,以除去未粘附的红细胞和抗原-抗体复合物以外的其他红细胞成分。留在Z-P-膜上,结合了抗体的特异血型抗原,用10g/L+二烷基硫酸钠(SDS)洗脱,洗脱液经十二烷基硫酸     

胶体金免疫比色法测定血清h-FABP水平的初步研究

目的初步建立一种基于胶体金均相免疫比色技术定量检测血清心脏型脂肪酸结合蛋白(hFABP)的方法。方法依据均相比色原理定量测定样本中抗原或抗体水平的免疫学检测技术原理,制备直径为80nm左右的胶体金颗粒并标记抗体,利用胶体金吸附标记物在540、660nm处吸收峰的变化初步建立用于检测血清h-FABP水平的方法。结果制备的胶体金颗粒液相分布均匀,制备的胶体金颗粒标记抗体呈均相分布,符合检测实验要求。通过实验确定反应体系组成为标本用量为30μL,h-FABP抗体标记量为100μg/100mL胶体金溶液,反应时间为10min,反应温度为37℃,以实验确定h-FABP≤3.6ng/mL为界限值,对临床标本进行初步分析并与免疫比浊的检测结果比较,符合率达95.09%。结论初步完成了h-FABP的胶体金免疫比色法的建立,与成熟的免疫比浊方法检测结果具有一定的符合性,有必要进行更深一步的研究。     

包被丙型肝炎病毒F蛋白的间接酶联免疫吸附试验的建立

目的优化检测丙型肝炎病毒(HCV)感染者血清抗-F的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)反应参数,为F蛋白用于ELISA试验提供依据。方法基因工程密码子优化后,表达、纯化了HCV F蛋白。以此蛋白为包被抗原,通过筛选反应条件,建立起检测HCV感染者血清抗-F的间接ELISA试验。结果 F抗原最佳包被浓度为1.0 ng/μL;最佳封闭条件为0.15%BSA的PBST液;血清最佳稀释度为1:10,37℃作用1 h;酶标2抗最佳稀释度为1:10 000,37℃孵育0.5 h。结论本研究初步确定了以HCV F蛋白为包被抗原,间接ELISA试验检测血清抗-F的反应参数,为后续ELISA试验打下基础。     

甲状腺球蛋白自身抗体的酶-免疫测定

酶-免疫测定为抗体检测提供了一个灵敏、特异、简便而且重复性好的方法。甲状腺球蛋白自身抗体的检测,对鉴别诊断甲状腺疾病有重要意义,作者提出了人血清中该抗体的酶-免疫测定法。甲状腺球蛋白抗原用琼脂糖4B从人甲状腺盐水抽提液中层析纯化,这种制剂中无免疫球蛋白G。将甲状腺球蛋白以6μg/ml的浓度固定于聚苯乙烯管中,在pH9.8保温过夜。把涂有甲状腺球蛋白的管子贮于4℃,至少可历时3周而无明显的损失。抗免疫球蛋白结合物由免疫纯化的家兔抗-(人免疫球蛋白G)抗体与高度纯化的硷性磷酸酶用戊二醛制备而成。此结合物在有NaN_3存在时贮存于4℃,至少可稳定一年。兔抗人甲状腺球蛋白抗血清由Feldt-Rasmussen博士赠送。测定是在涂有甲状腺球蛋白的管中进行。管子用0.5ml含0.05%(V/V)Tween-20的0.15M NaCl     

阿尔茨海默病尿神经丝蛋白检测方法的建立及其临床意义

目的 研制检测尿中AD7C-NTP诊断试剂盒,并分析评价其在诊断AD中的临床应用价值.方法 固相法合成具有免疫原性的AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段,通过免疫动物、制备抗体、配对筛选,以小鼠抗ADTC-NTP抗体作为包被抗体,以生物素标记兔抗AD7C-NTP抗体和辣根过氧化物酶标记亲和素建立ELISA检测尿AD7C-NTP的方法;并用以检测和分析121例AD患者与118名同龄健康人清晨中段尿液中AD7C-NTP的水平差异.结果 经过鉴定,小鼠抗AD7C-NTP抗体的ELISA检测效价为1:8 000,兔抗AD7C-NTP抗体的ELISA检测效价为1:32 000;WB检测人脑标本中抗AD7C-NTP抗体的相对分子质量为41 000.自建ELISA检测AD7C-NTP的灵敏度为0.2μg/L,线性范围为0-10μg/L,正常参考值1.5μg/L,平均回收率为100.2%,批内CV为3.8%和4.5%,批间CV为7.6%和6.8%.AD组尿AD7C-NTP[2.25(0.43-8.62)μg/L]高于健康对照组[0.82(0.47-2.77)μg/L,P<0.01],AD组和健康对照组阳性率分别为89.3%和15.3%,AD7C-NTP检测的敏感度为89.3%、特异度为84.7%.结论 用自行设计合成的多肽片段免疫动物,成功制备了抗AD7C-NTP抗体,初步建立的尿AD7C-NTP的ELISA检测方法精密度和灵敏度高,有可成为临床诊断AD的辅助手段.     

Dot-immunobinding assay with the globular domain of collagen type IV for antiglomerular basement membrane antibodies

A dot-immunobinding assay for the detection of antiglomerular basement membrane antibodies has been developed. The globular domain NC1 of basement membrane collagen type IV was used as antigen. The assay proved to be specific, sensitive, and reproducible. Circulating antibodies in each of 12 sera from patients with florid Goodpasture's syndrome could be demonstrated, whereas sera from patients with Goodpasture's syndrome in clinical remission and various control sera showed no reactivity. The advantages of the dot-blot assay are: the usage of the purified Goodpasature target antigen NCI reduces unspecific binding of IgG; only minimal amounts of antigen are required to give a positive signal; evaluation of the assay is possible without expensive laboratory equipment; precoated nitrocellulose sheets can be stored for several months without loss of activity.     

阿尔茨海默病血清Aβ42检测方法的建立及其临床意义

目的 建立β淀粉样肽42(β-amyloid peptide 42,Aβ42)酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA),并探讨其检测阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)患者血清Aβ42含量及其早期诊断、治疗的临床意义.方法 利用噬菌体抗体库技术制备抗Aβ42的单链抗体,用作包被抗体；并与用Aβ42免疫兔制备的抗Aβ42的多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG建立检测外周血Aβ42的ELISA方法.然后,用其检测120例AD患者和120例血管性痴呆(vascular dementiao,VD)或脑梗死患者、120名健康人血清的Aβ42含量,同时通过重复性、稳定性、回收试验和与国外试剂比对分析进行方法学评价与诊断性能分析.结果 建立的Aβ42 ELISA法检测2份血清标本重复20次的批内变异系数(coefficient of varible,CV)分别为3.6％和3.5％,重复检测20 d的批间CV分别为6.8％和7.1％；回收率为97.2％～103.1％,线性范围为0.050～2μg/L;在37℃放置6d及4℃保存6个月的活性降低均＜12％.与比利时INNOTEST双抗体夹心ELISA β淀粉样肽检测试剂盒平行检测90份标本,自建方法检测Aβ42含量为(0.207±0.039)μg/L,INNOTEST试剂盒为(0.206 ±0.038) μg/L；两种方法有较好的一致性(回归方程为Y=1.011X-0.003,R2=0.979,P＜0.01).ELISA检测AD组血清Aβ42为(0.247 ±0.032) μg/L,VD或脑梗死组为(0.173±0.028) μg/L,健康对照组为(0.172±0.032)μg/L;AD组分别高于VD或脑梗死组和健康对照组(q值分别为18.687、18.907,P均＜0.01).用受试者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线确定Aβ42的临界值为0.212 μg/L,正常参考值范围为0～0.212 μg/L时,ELISA Aβ42诊断VD的敏感度为86.7％(104/120),特异度为90.8％(218/240).结论 建立的AD血清Aβ42 ELISA法的敏感度和特异度较高,重复性及稳定性较好,为AD患者的早期诊断和治疗监测提供了新的有效方法.     

基质细胞来源因子1及其受体CXCR4参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区的迁移

背景:骨髓基质细胞具有体内、外迁移特性,但目前关于其迁移的具体机制还不十分清楚.目的:探讨基质细胞来源因子1及其受体CXCR4存骨髓基质细胞体内、外迁移中的作用.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-03/06在新加坡国立大学解剖系完成.材料:清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养.清洁级成年Wistar大鼠40只,随机分为损伤模型组、假手术组,20只/组.方法:骨髓基质细胞体外趋化实验在48孔Boyden小室上进行,取25 μL基质细胞来源因子1,分别以5,50,500 μg/L质量浓度加到趋化板的下层,以8 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖;并设立空白对照,单纯添加DMEM条件培养基.以含生血清白蛋白的DMEM条件培养基调整细胞浓度至1.5×109L-1,50 μL细胞悬液加到Boyden小窜上层,37℃、CO2培养箱培养10 h.损伤模型组大鼠制各脊髓全横断损伤,假手术组大鼠只打开椎板.脊髓全横断后1 h,将5-(6-)羟基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯荧光标记的骨髓基质细胞悬液1.0 mL(1×109L-1)经颈内静脉注入体内.主要观察指标:免疫荧光组化染色观察骨髓基质细胞趋化因子受体CXCR4的表达,基质细胞来源因子1体外对骨髓基质细胞的趋化迁移作用,Real-time PCR定量检测脊髓损伤区基质细胞来源因子1 RNA的表达,荧光显微镜下观察骨髓基质细胞向脊髓损伤区的体内迁移.结果:纯化的骨髓基质细胞呈CXCR4阳性.与空白对照比较,5,50,500 μg/L基质细胞来源因子1均可明显促进骨髓基质细胞的体外趋化迁移(P<0.06),且质量浓度为50 μg/L时趋化作用达峰值.与假手术组比较,损伤模型组造模后7 d基质细胞来源因子1 RNA的表达明显升高(P<0.05),14 d时恢复至正常水平.细胞注射2周后与假手术组比较,损伤模型组损伤区迁移细胞数明显增加(P<0.05).结论:基质细胞来源因子1体内、外可趋化骨髓基质细胞迁移,基质细胞来源因子1及其受体CXCR4参与骨髓基质细胞向脊髓全横断损伤区的迁移.     

重组血型改造工具酶稳定性的研究

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。     

纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用

背景:纳米氧化锌作为无机抗菌剂,与有机杀菌剂的抗菌机制明显不同。目的:探讨纳米氧化锌对白色念珠菌等真菌的抗菌作用。方法:分别配制成100,75,50,25,10g/L的纳米氧化锌与普通氧化锌悬浊液,以生理盐水作为阴性对照,采用KB纸片扩散法将30μL不同浓度悬浊液分别作用于白色念珠菌,将培养平板上置于37℃恒温箱培养24h观察并测量抑菌圈大小。结果与讨论:随着纳米氧化锌浓度的提高,对白色念珠菌的抑制作用逐渐增强,抑菌圈直径逐渐增大。普通氧化锌的无明显抑菌作用。证实纳米氧化锌能够抑制白色念珠菌等真菌的生长。     

恒温培养箱加温对不同贮存期红细胞的影响

目的探讨恒温培养箱加温对不同时间贮存红细胞悬液的影响。方法红细胞悬液在恒温培养箱中37℃、44.5℃分别放置30min,观察红细胞形态渐进规律性改变。将室温预热组、37℃加温组、44.5℃加温组的红细胞悬液进行涂片,Wright、Giemse染色后油镜下计数1000个红细胞计算其比值,并对3组RBC、WBC、Plt,测其Hb和K+的改变,详细观察溶血程度和渗透性。结果红细胞形态、WBC、RBC、Plt,Hb和血K+及红细胞的溶血程度,没有随着温度升高而改变,只是随着贮存时间的延长略有升高,Hb室温预热组为(170.8±29.18)g/L,37℃加热组为(170.72±27.9)g/L,44.5℃加温组为(171.08±22.3)g/L(P>0.05)。血清K+3组没有明显差别(P>0.05)。在1%NaCl溶液中,开始溶血与完全溶血室温预热组是(4.5±0.18),(3.6±0.1)g/L,37℃加温组为(4.41±0.38)和(3.42±0.36)g/L,44.5℃加温组为(4.3±0.2)和(3.4±0.1)g/L在室温预热时溶血值已在正常参考范围的最高上限。5种红细胞形态的变化:在14、21、28、35d时光滑球形红细胞的比率3组无显著差异,但是在35d时,随着贮存时间的延长,光滑球形红细胞也略有升高。结论红细胞悬液在温度可控培养箱(44.5℃)中加温30min,红细胞不会产生明显的溶血反应和其它损害。而随着贮存时间的延长,红细胞形态略有改变。     

Detection of cell surface antigens on biopsied human tumor cells using monoclonal antibody-containing fluorescent microspheres

An immunoassay using fluorescent microspheres was developed for the detection of cell surface antigens on biopsied human cancer cells. A murine IgM monoclonal antibody 202 that was raised against a human melanoma cell line detected monosialogangliosides having sialic acid-galactose residue, and was used as an antibody source. Purified 202 antibody was coupled with 1-μm fluorescent micro-spheres (Immunosphere) by carbondiimide reaction at pH 4.7–5.5, and the assay was standardized using an antigen-positive human melanoma cell line. Over 90% of cells were positive when 4 μg antibody-containing immunospheres were used. The specificity of the reactivity was demonstrated by a blocking assay using uncoupled 202 antibody. The binding activity was stable for 2 weeks after preparation. Biopsied specimens that had been viably frozen in a form of single-cell suspension were thawed and purified by Ficoll density gradient centrifugation. All of the five melanoma specimens tested were positive (>5% fluorescent cells) with a mean percent of positive cells = 35%, whereas only two of the five nonmelanoma tumor specimens were positive (m = 10.8%). None of the ten noncancer tissues, including skin, liver, kidney, and lymphocyte cells, showed greater than 5% positivity. When these tissues were tested after a 3-day incubation of the cells in a CO₂ incubator, a significant increase in the antibody reactivity was obtained in melanoma tissues (m = 57.8%). In contrast, the antigenic expression of other types of human cancer was changed only slightly (m = 16.2%) within the same period of incubation. Whether the assay is applicable to cell surface antigens of other epitopes of human biopsied tissues or only to ganglioside antigens is currently under investigation.     

乙型肝炎表面抗原破坏试验载体法的研究

为改进HBsAg破坏试验,对比了悬液常量、悬液微量、载体常量与载体微量等4种方法的结果。其中,以载体微量法测出的消毒剂有效剂量最高。载体与回收液的种类对HBsAg回收率有影响,而HBsAg污染量多少对回收率影响不大。     

血清酸性α-醋酸萘酯酶的比色测定及初步临床应用

目的建立比色测定血清酸性α-醋酸萘酯酶总活性的方法。方法用α-醋酸萘酯为底物,在37℃、pH6.2的酸性环境中经酶水解产生α-萘酚,然后与重氮试剂固蓝B偶联反应显色测定。结果最适pH6.0~6.4,底物浓度为2mmol/L,吸收峰波长为520nm,线性范围0~2500U/L,酶促反应时间为20min,显色反应时间为20min,显色稳定时间为20min,批内、批间变异系数分别为2.67%和5.1%。血红蛋白1g/L和胆红素172umol/L无干扰。枸橼酸钠、草酸盐、肝素、EDTA-K2常用浓度无抑制,氟化钠可抑制该酶活性。标本2~8℃冰箱保存7d结果无变化。正常参考值(n=100)为(1645±378.5)U/L(x-1.96s)。结论该方法简便实用,适于各级实验室开展,可作为评价肝细胞变性坏死、肝纤维化、肝脏合成功能异常的一项新的血清学指标。