实时荧光RT—PCR定量检测BRMS1基因表达

目的建立一种实时荧光RT—PCR定量检测乳腺组织中BRMS1 mRNA表达水平的方法。方法采明逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增目的基因片段,并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,计算出待测样本中BRMS1 mRNA含量,并以BRMS1 mRNA与GAPDHmRNA的比值作为BRMs1 mRNA的表达水平。结果实时荧光RT—PCR检测BRMS1及GAPDH的线性范围为4×10^2-4×10^8拷贝／μl。批内和批间变异系数分别为3．9％-4．6％和4．8％-5．5％。BRMS1 mRNA表达范围为0—1．65．结论实时荧光定量检测BRMS1 mRNA含量的方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。     

荧光定量RT—PCR快速检测手足口病病原研究

目的建立荧光定量RT—PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法利用TaqMan技术，设计一对共引物及探针，建立、优化反应体系后，构建质粒标准品，利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线，根据TCID。倍比稀释，建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT—PCR法进行比较。结果定量标准曲线的灵敏度为10^5／μl（R^2=0．999），PCR扩增效率为94％。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5．0TCID50／ml（R^2=0．99），PCR扩增效率为97．6％。荧光RT—PCR检出率为80．9％，显著高于RT—PCR（检出率为62．92％）。结论研究建立的荧光定量RT—PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高，可以作为肠道病毒的快速检测方法。     

TSHR及活性多肽对BALB/c小鼠甲状腺的影响

目的:探讨促甲状腺激素受体(TSHR)及活性多肽对BALB/c小鼠甲状腺的影响。方法:对BALB/c小鼠腹腔注射血蓝蛋白耦联的人TSHR(hTSHRaa352～366)和从豚鼠脂肪细胞提取的TSHR(gTSHR)进行免疫,每2周免疫1次共6次,每次免疫前2d取血,检测血清T4、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)水平。12周后处死小鼠,取甲状腺做病理组织学检查。结果:血清T4水平hTSHRaa352～366组从第6周开始下降(P<0.01),而且一直维持到12周,血清TRAb水平明显升高(P<0.01),甲状腺组织显示滤泡上皮细胞扁平、核缺失、皱缩、胶质浓缩等甲状腺功能减退病理改变;gTSHR组血清T4水平在第6周已下降,而12周时有的下降、有的则升高,无统计学意义,血清TRAb水平升高(P<0.01),甲状腺组织出现不均一的病理表现。结论:hTSHRaa352～366刺激BALB/c小鼠产生TRAb和促甲状腺激素受体抑制抗体(TBAb),抑制促甲状腺激素(TSH)与TSHR结合,降低了甲状腺激素T4水平;而gTSHR刺激BALB/c小鼠同时产生TRAb、促甲状腺激素受体刺激抗体(TSAb)和TBAb,引起甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退。     

实时荧光定量PCR检测人肝癌组织皮层肌动蛋白基因

目的建立实时荧光定量PCR检测皮层肌动蛋白基因表达水平的方法。方法提取人肝癌组织总RNA,RT—PCR扩增CTTN和GAPDH基因片段并分别构建两片段阳性表达载体。采用SYBR Green I实时荧光定量PCR绘制两基因拷贝数标准曲线,实测人肝癌标本并进行方法学评价。结果成功构建pMD18-T（＋）／CTTN和pMD18-T（＋）／GAPDH重组质粒。CTTN和GAPDH基因模板拷贝数分别在1．6×10^3-1．6×10^7和1．6×10^4-1．6×10^7之间时标准曲线有良好线性关系,R^2分别为0．996和0．985。由Ct值统计两基因组内变异系数分别为0．11％～2．25％和0．75％-3．63％;组间变异系数分别为0．83％～1．48％和0．47％～1．36％。组间无统计学差异（P〉0．05）。结论成功建立实时荧光定量PCR检测人肝癌组织CTTN基因的方法,为研究人肝癌组织CTTN基因表达水平奠定了方法学基础。     

利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立

目的：建立检测大鼠P物质（SP）mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法，为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段。方法：提取大鼠中脑总RNA，扩增SP基因片段，将其克隆入pMD-18T载体，制作标准品质粒；应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析，评价所建立方法的检测灵敏度；对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性。结果：标准品质粒构建成功，经酶切及测序鉴定，目的片段已插入pMD-18T载体；所建立的实时定量PCR方法的最低检测限度为10⁴个拷贝/反应，在每反应10⁴～10⁹拷贝范围内，Ct值（荧光信号达到设定阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系，r=0.998。结论：所建立的检测大鼠SP mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点，适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测。     

实时荧光定量PCR检测人IL-9 mRNA方法的建立及应用

目的：建立检测人白介素-9（interleukin-9,IL-9）mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quantitative PCR,qRT—PCR）方法。方法：分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear ceils,PB—MC）,经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD-18T载体连接构建质粒标准品。采用qRT—PCR方法检测IL-9mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性,应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA表达水平。结果：建立了人IL-9的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r^2为0．995～0．998,熔解随线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组（P〈0．01）。结论：建立的检测人IL-9 mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好,为进一步临床应用提供了实验基础。     

TGF-β1 mRNA荧光实时定量PCR检测初筛方法的建立及初步运用

目的：建立荧光实时定量检测人转化生长因子异构体（TGF—β1）mRNA的方法。方法：抽取外周静脉血，予EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用Trizol裂解液提取总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，在扩增体系中加入SYBR Green I，应用FQ-RT-PCR定量检测TGF-β1 mRNA。结果：该法检测TGF-β1 mRNA的灵敏度达10^5拷贝／ml，线性范围为10^5～10^11拷贝／ml，Ct值的批内、批间变异系数分别为2．27％～2．56％和4．78％～5．22％。临床应用显示，糖尿病患者PBMC中TGF—β1 mRNA的含量显著高于正常对照组（P〈0．05）。结论：FQ-RT-PCR应用于检测TGF-β1 mRNA的初筛方法具有简便、快速等特点，为临床应用提供了方法学依据。     

FQ-PCR检测小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测小鼠肝癌模型中细胞周期蛋白cyclin E mRNA的方法。方法:以cyclin E和β-actin的PCR产物为阳性模板,分别将二者cDNA产物进行10倍梯度稀释,建立双标准曲线,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测cyclin E和β-actin mRNA含量,对熔解曲线进行分析确定扩增产物的特异性。结果:建立的标准曲线线性关系良好,相关系数r均为-1.00,cyclin E和β-ac-tin扩增效率分别为0.91和0.93,熔解曲线分析显示均为单峰,特异扩增产物的Tm值分别为(81.84±0.28)℃和(89.15±0.26)℃。10-4Cyclin E和β-actin cDNA标本日间变异系数(CV)和批内CV分别为1.02%、1.45%和0.90%、1.48%。结论:SYBR Green I实时荧光PCR定量检测cyclin E mRNA是一种方便快捷、经济实惠、灵敏度高、特异性好的方法,为cyclin E的进一步研究奠定方法学基础。     

三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较

目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2,而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。     

血吸虫Sj26膜锚定表达DNA疫苗的构建、表达及其免疫原性

目的构建含日本血吸虫相对分子质量为26000的抗原（Sj26GST）基因的膜锚定表达DNA疫苗，观察其免疫BALB／c小鼠后的免疫应答效应。方法用RT—PCR法，以血吸虫成虫RNA为模板，扩增获得Sj26的全长基因。利用重组PCR技术，在Sj26基因的5’端加上编码IL-2的信号肽核苷酸序列，3’端加上编码胎盘碱性磷酸酶的膜锚定序列，然后将其克隆入pIRES载体中，构建一个膜锚定型真核表达质粒pIRES-Sj26。将重组质粒转染HeLa细胞，通过RT—PCR及间接免疫荧光技术检测目的基因的表达。用构建的pIRES-Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB／c小鼠后，以ELISA试剂盒检测小鼠血清中的总IgG抗体浓度，脾细胞培养法检测脾淋巴细胞培养上清的干扰素γ（INF-γ）含量，淋巴细胞刺激指数（SI）反映淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测脾细胞CD4／CD8亚群。结果经过酶切鉴定、PCR及测序证实重组质粒pIRES-Sj26构建成功，经转染HeLa细胞及免疫荧光检测证明质粒pIRES-Sj26能在体外进行表达。免疫小鼠后检测结果表明pIRES-Sj26组的血清总IgG抗体浓度、INF-γ的含量明显高于空白对照组和空载体组（均P〈0．01）；其脾SI高于空白对照组和空载体组（P〈0．05）；CD8^＋细胞百分比高于空白对照组和空载体组（均P％0．05），CD4^＋细胞百分比没有显著变化（P〉0．05）。结论成功构建日本血吸虫膜锚定表达DNA疫苗pIRES-Sj26，表达的Sj26蛋白大部分锚定在细胞膜上。pIRES—Sj26疫苗能增强BALB／c小鼠的免疫应答反应。     

甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因启动子甲基化研究

目的 探讨甲状腺乳头状癌组织中促甲状腺激素受体基因(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)基因启动子区5′端CpE岛甲基化改变的特点与临床特征的关系. 方法 采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法检测TSHR基因启动子甲基化情况. 结果 (1)甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因启动子甲基化的发生率为64.7%(22/34),癌旁组织中TSHR基因启动子甲基化的发生率为26.5%(9/34),癌组织中TSHR基因启动子甲基化率显著高于癌旁组织(P<0.05).(2)有淋巴结转移的甲状腺乳头状癌组织TSHR基因启动子甲基化的发生率为83.3%(15/18),高于无淋巴结转移组43.8%(7/16)(P<0.05). 结论 TSHR基因启动子异常甲基化是甲状腺乳头状癌发展过程中的分子事件之一,可能影响了甲状腺乳头状癌细胞的摄碘的功能.     

GD甲状腺功能亢进中TSHR和TRAb的研究现状

Graves病(GD)是常见的自身免疫性甲状腺病之一,发病机制尚不清楚。已有研究证实多个易感基因与GD发病相关,其中促甲状腺激素受体(TSHR)基因不仅是GD甲状腺功能亢进发病的一个易感基因,而且具有特异性。TSHR作为主要的自身抗原引起促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的产生,是GD自身免疫反应的主要环节。TSHR易感基因及其编码的TSHR在免疫应答中的作用成为研究热点。由于TRAb是GD甲状腺功能亢进发生、发展的主要免疫标志,所以应关注TRAb在GD甲状腺功能亢进诊断、治疗选择、转归预测等方面的研究,为制订个体化的治疗方案提供科学依据。     

甲状腺乳头状癌中促甲状腺激素受体与钠碘转运体mRNA的表达

目的钠碘转运体(Na+/I-symporter,NIS)是介导甲状腺细胞摄取碘的重要载体,其表达、定位与促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)关系密切。文中主要研究甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinomas,PTC)及癌旁组织中TSH受体(TSH receptor,TSHR)与NIS基因的表达。方法实时荧光定量PCR法测定36例PTC及癌旁组织,20例正常组织中TSHR mRNA及NIS mRNA的表达水平。结果 PTC及癌旁组织中TSHR mRNA表达水平明显低于正常组织,P<0.05;NIS mRNA表达水平在PTC组织中显著下降,P<0.05。结论 PTC组织中TSHR与NIS mRNA基因表达水平呈现同步下降趋势,可能与TSH-TSHR信号通路的调控有关。     

促甲状腺激素受体基因启动子区甲基化与乳头状甲状腺癌的关系研究

目的观察促甲状腺激素受体（TSHR）在乳头状甲状腺癌（PTC）中的表达,分析其基因启动子区甲基化与肿瘤发生的关系。方法选择50例PTC和32例良性甲状腺肿瘤患者（对照组,包括20例结节性甲状腺肿和12例甲状腺腺瘤患者）,对两组患者手术获取的标本提取RNA后,逆转录为cDNA,进行PCR,检测鸭HR基因的表达情况;运用甲基化特异性PCR（MSP）法检测上述组织中TSHR基因启动子区甲基化的情况。结果PTC组患者中,有34例（68．0％）TSHR基因启动子发生甲基化,16例（32．0％）TSHR基因mRNA表达缺失;对照组患者中,有7例（21．9％）TSHR基因启动予发生甲基化,4例（12．5％）TSHR基因mRNA表达缺失,PTC组织TSHR基因启动子区甲基化率及TSHR基因mRNA表达缺失率均显著高于对照组,差异有统计学意义（X^2值分别为16．61和4．02,P〈0．05）。34例发生了TSHR基因启动子区甲基化的PTC患者中,有14例（41．2％）TSHRmRNA表达缺失;16例未发生甲基化的PTC患者中,2例（12．5％）发生了mRNA表达缺失,二者mRNA表达缺失率间差异有统计学意义（X^2=4．11,P〈0．05）。结论PTC患者TSHR基因启动子甲基化发生率显著高于良性甲状腺肿瘤患者,而TSHR基因mRNA的表达则较良性甲状腺肿瘤降低;推测TSHR基因启动子区甲基化可能与PTC的发生、发展相关。     

促甲状腺素受体在亚临床甲状腺功能减退小鼠心室肌的表达及意义

【摘要】 目的 探讨促甲状腺素受体（TSHR）在亚临床甲状腺功能减退（SCH）小鼠心室肌的表达及意义。方法 30只BALB/c小鼠随机分为对照组及实验组,每组15只。实验组小鼠构造亚临床甲状腺功能减退动物模型,对照组小鼠饮用正常水,腹腔注射等量生理盐水。比较两组小鼠超声心动图检测结果,血清TT3、TT4、TSH水平。免疫组织化学染色法检测各组小鼠心室肌组织中TSHR的表达情况。结果 两组超声心动图检测结果显示,实验组E/E’值高于对照组（P＜001）。两组TT3水平比较差异无统计学意义(P＞005);实验组血清TT4水平明显低于对照组,血清TSH水平明显高于对照组（P＜001）。免疫组织化学染色结果显示,实验组心室肌组织中TSHR表达明显高于对照组。结论〓当发生亚临床甲状腺功能减退时,心室肌组织TSHR表达上调,与高浓度的TSH结合后可能通过某种机制影响心脏舒缩功能。     

TSHR和MMP-9在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

[目的]探讨甲状腺乳头状癌(PTC)组织中促甲状腺激素受体(TSHR)与基质金属蛋白酶(MMP-9)的表达及其与病理参数之间的关系。[方法]应用免疫组织化学(SP)法检测56例PTC,30例结节性甲状腺肿及11例正常甲状腺组织标本的TSHR和MMP-9蛋白表达。[结果]TSHR蛋白在PTC、结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织的表达率分别为91.07%、70.00%和27.27%,三组间比较差异有显著性意义(P<0.05);TSHR在有淋巴结转移PTC组与无淋巴结转移组的表达率分别为76.92%与95.35%(P>0.05);在Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期的表达率分别为89.66%与92.60%(P>0.05)。MMP-9蛋白在PTC、结甲和正常甲状腺组织中表达率分别为88.37%、36.67%和0%,三组间比较差异有显著性意义(P<0.05);在有淋巴结转移PTC组与无淋巴结转移PTC组的表达率分别为92.31%与79.07%(P>0.05),在Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期的表达率分别为89.66%与74.07%(P>0.05)。TSHR、MMP-9的表达与患者的性别、年龄及肿瘤大小均无相关性(P>0.05)。[结论]TSHR蛋白高表达与甲状腺乳头状癌的发生有关,可能是甲状腺癌发生的一个早期标志;MMP-9高表达可能与甲状腺癌细胞侵袭和转移密切相关。     

过表达人TSHR-A亚单位的重组腺病毒Ad-TSHR289/6xHis载体构建与鉴定

目的：构建以促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor,TSHR）A亚单位（TSHR289）基因片段为免疫原的重组腺病毒载体,以期建立Graves病（Graves’s disease,ＧＤ）动物模型,为探讨中药复方对GＤ的防治作用提供条件。方法：利用重叠PCR技术从 pSV2neoECE-TSHR289-6H-dhfr 质粒中将目的基因TSHR289扩增至载体attB1-Kozak-TSHR289/6xHis/IRES/eGFP-attB2,琼脂糖凝胶电泳回收,GatewayR技术构建重组腺病毒载体（pAV.EX1d-TSHR289/6xHis/IRES/eGFP,pAd-TSHR289/6xHis）,转化到大肠杆菌Stbl3中,菌落PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将pAd-TSHR289/6xHis转染HEK293A细胞包装腺病毒,CsCl梯度离心法纯化腺病毒,TCID50法检测病毒滴度。RT-PCR法检测HEK293A中TSHR289的mRNA表达。应用该腺病毒免疫BALB/c小鼠制备GＤ模型。结果：菌落 PCR 筛选阳性克隆,测序证明构建正确;细胞感染腺病毒后出现明显细胞病变及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）表达;RT-PCR 检测证实重组腺病毒转染的细胞中TSHR289的mRNA表达量是未转染的285倍;实验测得病毒滴度为3.16×1010 PFU/ml;BALB/c小鼠免疫第10周T4、TSHR抗体（TRAb）阳性率7/10。结论：成功构建了过表达人TSHR289基因的重组腺病毒载体,动物实验证明该腺病毒诱发自身免疫,产生TRAb。为下一步体内药物治疗GＤ试验提供了条件。     

甲状腺乳头状癌中TSHR、NIS基因甲基化和蛋白表达及其与BRAF突变的关系

目的 探讨甲状腺乳头状癌(PTC)中促甲状腺激素受体(TSHR)和钠/碘协同转运体(NIS)蛋白表达与相应基因的甲基化及T1799A BRAF基因突变的关系.方法 应用直接测序法检测60例PTC和20例癌旁正常甲状腺组织中T1799A BRAF突变;甲基化特异性PCR(MSP)检测上述标本中的TSHR和NIS的基因甲基化;免疫组化法检测蛋白表达.结果 60例PTC标本中,BRAF突变率为65%(n = 39),TSHR和NIS基因甲基化的发生率分别为43%(n = 26)和27%(n = 16),突变和甲基化与临床病理特征未见显著关联.TSHR蛋白表达阳性评分在TSHR甲基化阳性组和阴性组中分别为1.3±0.5和1.7±0.7(P = 0.009),NIS蛋白表达阳性评分在NIS甲基化阳性组和阴性组中分别为1.1±0.5和1.5±0.6(P = 0.019).BRAF突变的PTC病例中,TSHR和NIS蛋白表达阳性评分显著低于野生组(TSHR,1.4±0.5 vs 1.8±0.8,P = 0.031;NIS,1.3±0.6 vs 1.7±0.6,P = 0.009),TSHR和NIS基因甲基化发生率显著高于野生组(TSHR,54% vs 36%,P = 0.049;NIS,24% vs 10%,P = 0.034).结论 PTC中相应基因的甲基化和BRAF突变可能是TSHR和NIS蛋白表达减弱并分布异常的原因.     

促甲状腺激素受体第三胞内环基因突变与甲状腺癌发病的相关研究

目的 研究甲状腺癌发病是否与促甲状腺激素受体(Thyroid stimulating hotmone receptor，TSHR)第三胞内环基因突变有关。方法采用多聚酶联反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及DNA测序方法，对75例甲状腺癌(其中10例滤泡型癌，65例乳头状癌)和44例对照组织TsHR第三胞内环基因突变进行检测。结果 经PCR-SSCP检测甲状腺癌TSHR第三胞内环未发现明显带型异常，取2例对照组织和4例甲状腺癌组织进行DNA测序，6例组织TSHR2000位点碱基均由C-T，使得所编码的601位氨基酸由组氨酸(CAT)-酪氨酸(TAT)(His→Tyr)，余无明显基因突变。结论甲状腺癌TSHR第三胞内环未发现基因突变，提示甲状腺癌发病与TSHR第三胞内环基因突变无关；由于所测6例标本601位氨基酸均为酪氨酸，考虑中国人TSHR基因与国外人群存在多态性差异。