原儿茶酸调节神经干/祖细胞分化的作用研究

目的观察原儿茶酸调节体外培养的神经干/祖细胞分化及对细胞分化显型的保护作用。方法神经干/祖细胞取自胚胎14 d小鼠海马组织,以单层贴壁方式培养。免疫荧光染色标记分化的细胞,CCK-8试剂盒检测细胞的生存力,流式细胞仪分析凋亡细胞。结果原儿茶酸单独使用不能诱导神经干/祖细胞的分化,但与1%胎牛血清的联合应用时,原儿茶酸(0.06 mmol.L-1)有效地提高神经元的分化比例,介导神经元的成熟并促进突触的伸长;另一方面,原儿茶酸明显提高了分化显型的生存力并抑制了细胞凋亡,同时激活了细胞内源性的抗氧化酶系统。结论原儿茶酸能够有效地促进神经干/祖细胞分化为神经元的比例并提高细胞分化显型的生存力。     

双嘧达莫对体外培养神经干细胞增殖的影响

目的研究双嘧达莫(dipyridamole)对体外培养神经干细胞的促增殖作用.方法取新生小鼠大脑进行神经干细胞原代培养,通过神经球生成的观察、特异性蛋白质免疫细胞化学染色和BrdU标记鉴定并判断其增殖能力;双嘧达莫按0.1,0.5,2.5 μmol·L-13个浓度加入神经干细胞培养基中,同时设立溶媒对照组和阳性对照组,通过观察神经球形态、神经球生成数目及MTT法定量比较,分析不同浓度双嘧达莫对神经干细胞分裂增殖的影响.结果在培养物中有大量神经球生成,神经干细胞的特异性蛋白质免疫细胞化学染色呈阳性,BrdU标记亦呈阳性反应,表明所培养的细胞为神经干细胞,具有增殖能力.双嘧达莫中、高浓度组神经球数目、MTT比色结果明显高于溶媒对照组.结论双嘧达莫具有促进神经干细胞增殖的作用.     

刺梨提取物CL1对胃癌SGC-7901细胞增殖和人脐血CD34+造血干/祖细胞增殖分化能力的影响

目的观察刺梨提取物CL1对胃癌SGC-7901细胞增殖和人脐血CD34+造血干/祖细胞(HSPC)增殖分化能力的影响.方法采用MTT法测定活细胞OD值,计算CL1对胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率.免疫磁珠分选人脐血CD34+造血干/祖细胞,细胞记数、双色直接免疫荧光标记法和流式细胞仪分析细胞增殖分化能力变化.结果MTT检测法显示,0.01～10 μmol·L-1的CL1处理,剂量依赖性和时间依赖性地抑制胃癌SGC-7901细胞生长.经 14 d 的培养,与细胞对照组相比,10、1 μmol·L-1的CL1细胞数有下降趋势,但差异无显著性;表达粒系/单核巨噬系细胞表型CD15和CD11b的细胞百分数无显著差异.经 14 d 的培养,与培养 0 d 比较,CD15显著增高(P＜0.05),CD11b有增高趋势,但无显著性差异.结论CL1对胃癌SGC-7901细胞的体外生长具有抑制作用,但对人脐带血CD34+ HSPC的增殖、和向粒细胞、单核巨噬细胞分化无明显影响,表明CL1在抗肿瘤作用剂量下,不会明显抑制造血干/祖细胞向粒-单细胞的增殖分化,提示CL1可能不会引起明显的造血抑制.     

腺苷促进体外培养神经干细胞增殖作用研究

目的研究腺苷促进体外培养神经干细胞（NSCs）增殖作用。方法取新生小鼠大脑进行神经干细胞原代培养,观察神经球生成情况,特异性蛋白质免疫细胞化学染色和BrdU标记鉴定并判断其增殖能力;将腺苷按0.4,2.0,10.0 μmol•L 13个浓度加入神经干细胞培养基,同时设立溶媒对照组和阳性对照组,通过观察神经球形态、神经球生成数目及 MTT法定量比较,分析不同浓度腺苷对神经干细胞分裂增殖的影响。结果培养物中有大量神经球生成,神经干细胞特异性蛋白质免疫细胞化学染色呈阳性,BrdU标记亦呈阳性反应,所培养的细胞为神经干细胞,具有增殖能力;腺苷中、高浓度组神经球数目、MTT比色结果明显高于溶媒对照组。结论腺苷具有促进NSCs增殖作用。     

皮肌炎患者骨髓造血干/祖细胞体外增殖分化功能的研究

目的：比较皮肌炎患与正常人的造血干/祖细胞体外增殖分化能力及从造血干/祖细胞水平探讨皮肌炎的发病机制。方法：用半固体甲基纤维素集落培养法观察22例皮肌炎患的粒-巨噬细胞系、红系、巨核细胞系的集落及丛落数。结果：皮肌炎患的粒-巨噬细胞系、红系、巨核细胞系的集落分别为119.4351.44、75.1236.26、9.183.76均明显低于正常对照组，丛落数分别为240.5392.11、60.6920.72、29.0113.54均高于正常对照组。结论：皮肌炎患的造血干/祖细胞集落数减少而丛落数不减少，提示皮肌炎患和造血干/祖细胞的增殖、分化功能异常，造血干/祖细胞的异常可能是皮肌炎的发病机制。     

骨骼肌提取液促进体外培养神经干细胞增殖作用研究

目的寻找促神经干细胞分裂增殖物质,为神经系统发育研究和神经系统疾病的治疗研究提供新的依据。方法用硫酸铵盐析及超滤离心法分离骨骼肌蛋白质,体外培养新生小鼠神经干细胞,通过神经球生成的观察、特异性蛋白质免疫细胞化学染色和MTT比色检测法鉴定神经干细胞并判断其增殖能力。结果在培养物中有大量神经球生成,且与对照组差异有显著性(P<0.01),神经干细胞的特异性蛋白质(Nestin)免疫细胞化学染色呈阳性。结论骨骼肌提取液可促进体外培养神经干细胞增殖分裂,且呈一定量效关系,其有效成分为分子量≤100 ku的蛋白质分子。     

氯胺酮对胚胎大鼠培养神经干细胞增殖和细胞周期的影响

目的　探讨氯胺酮对体外培养的大鼠神经干细胞细胞增殖、细胞周期的影响。方法　采用MTT法检测氯胺酮对体外培养的大鼠神经干细胞细胞生长的抑制作用 ,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果　氯胺酮对体外培养的大鼠神经干细胞细胞具有生长抑制作用 ,并存在量效关系。流式细胞仪分析表明G0 /G1期细胞百分率上升 ,S期细胞百分率下降。结论　氯胺酮对大鼠培养神经干细胞的增殖有抑制作用 ,其机制与细胞周期阻滞有关。     

托吡酯促进体外培养神经干细胞增殖的实验研究

目的:研究托吡酯对体外培养神经干细胞的促增殖作用。方法:取新生小鼠大脑进行神经干细胞原代培养,托吡酯按0.4、2、10μmol.L-13个量级(或3种浓度)加入神经干细胞培养基中,同时设立溶媒对照组和阳性对照组,通过神经球生成数目及MTT法定量比较,分析不同浓度托吡酯对神经干细胞分裂增殖的影响。结果:2、10μmol.L-1托吡酯组神经球数目分别为20.67±4.04和49.68±3.79;MTT比色结果分别为0.3546±0.0705和0.5018±0.0369,明显高于溶媒对照组(7.34±2.31、0.2880±0.0093,P<0.01)。结论:托吡酯具有促进神经干细胞增殖的作用。     

姜黄素对β-淀粉样蛋白损伤神经干细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨姜黄素对β-淀粉样蛋白损伤神经干细胞(NSC)增殖和凋亡的影响。方法选取NSC分为对照组、姜黄素组、Aβ组和观察组,其中姜黄素组、Aβ组和观察组分别加入终浓度为5μmol/L的姜黄素、0.5μmol/L的Aβ+DMSO(10μL)、5μmol/L的姜黄素+0.5μmol/L的Aβ,对照组加入DMSO(10μL)。使用姜黄素治疗NSC,通过细胞计数法计算NSC的增殖速度,噻唑蓝(MTT)测定NSC活性,逆转录。聚合酶链反应(RTPCR)测定NSC中Nestin mRNA及凋亡相关基因Caspase3 mRNA表达,免疫组化测定NSC向神经元和星形胶质细胞的分化潜能。结果与对照组比较,姜黄素组NSC的细胞活力、Nestin mRNA表达明显增加,Caspase3mRNA表达明显降低(P 0.05或P 0.01),而Aβ组和观察组NSC活力、Nestin mRNA表达和Tuj-1、GFAP明显降低,Caspase3 mRNA表达明显增加,差异有统计学意义(P 0.05或P 0.01)。与Aβ组比较,观察组NSCs细胞活力、Nestin mRNA表达和Tuj-1、GFAP明显增加,Caspase3 mRNA表达明显降低,差异有统计学意义(P 0.05或P 0.01)。结论姜黄素促进NSC增殖,促进NSC向神经元分化,逆转Aβ对NSC的损伤可能是由于抑制了凋亡基因表达。     

钙调神经磷酸酶在人外周血内皮祖细胞增殖调节中的作用

目的观察钙调神经磷酸酶(CaN)活性改变对培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖和凋亡的影响。方法密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,贴壁培养获得EPCs。依据干预方式分四组:对照组;苯肾上腺素(PE,10μmol/L)组;环孢素A(CsA,1μg/mL)组;CsA+PE组。比色法测定CaN活性和细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡。结果 PE干预能明显增加细胞CaN活性,促进细胞增殖能力;CsA作用可明显抑制PE促进的CaN活性和细胞增殖,增加EPCs凋亡率。结论在培养的人外周血来源EPCs,CaN活性的维持具有促进细胞增殖和防止细胞凋亡的作用。     

Endogenous nitric oxide generation linked to ryanodine receptors activates cyclic GMP / protein kinase G pathway for cell proliferation of neural stem/progenitor cells derived from embryonic hippocampus

Nitric oxide (NO) activates the cyclic GMP (cGMP) / protein kinase G (PKG) pathway during physiological processes in numerous types of cells. Here, we evaluated whether this NO/cGMP/PKG pathway is involved in the proliferation of neural stem/progenitor cells (NPCs) derived from the hippocampus of embryonic mice. In culture, the exposure to the NO synthase inhibitor N(ω)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) significantly decreased the number of viable cells and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation into the cells, as well as the levels of intracellular reactive oxygen species, extracellular NO(2), and intracellular cGMP. Like L-NAME, the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) and PKG inhibitor KT5823 also decreased cell viability and BrdU incorporation. The membrane-permeable cGMP analogue 8-bromo-cGMP partially abolished the L-NAME-induced decrease in the BrdU incorporation. BrdU incorporation was decreased by Ca(2+)-channel blockers, including dantrolene, MK-801, ifenprodil, and nifedipine. Interestingly, the NO(2) level was decreased by dantrolene, but not by the other 3 blockers. L-NAME and ODQ attenuated phosphorylation of Akt, but not that of extracellular signal-regulated kinases or epidermal growth factor receptors. Our data suggest that endogenous NO generation linked to dantrolene-sensitive ryanodine receptors activates the cGMP/PKG signaling pathway for positive regulation of proliferation of hippocampal NPCs derived from embryonic mice.     

胎鼠神经干细胞培养方法的建立及药物对干细胞增殖的影响

目的建立神经干细胞培养模型，观察药物对其增殖能力的影响。方法建立大鼠胎脑神经干细胞的培养方法，并用MTT法和3H-胸腺嘧啶核苷参入法观察黄皮酰胺、丹酚酸A及人参皂苷Rg1等对第2代神经球细胞状态的影响。结果免疫细胞化学结果显示，培养的神经细胞具备干细胞的基本特性；MTT和液闪结果则表明，上述3种药物可不同程度地影响神经干细胞的存活率和/或增殖活性。结论本实验所建立的胚胎大鼠神经干细胞培养模型可以观察到一些有脑保护作用的药物对干细胞存活和增殖有一定影响。     

核糖体蛋白S6激酶1抑制剂对气道上皮干/祖细胞 增殖及分化功能的影响

李敏敏 1,李宽 1,2,孙昕 1,2,吴琦 1,2,陈怀永 摘要：目的 研究mTOR信号通路下游元件核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）抑制剂PF-4708671对气道干/祖细胞增 殖与分化功能的影响。方法 准备10只C57BL/6小鼠,采用流式细胞分选技术将气道干细胞（vClub）和气道祖细胞 （Club）从小鼠气道分选出来;采用类器官培养技术分别把vClub细胞、Club细胞和成纤维细胞（MLg）混合培养。细胞 设0、4、20、100 nmol/L PF-4708671处理组,培养第8天时显微镜下观察克隆生长情况,统计克隆形成数量;第10天时 荧光定量PCR检测S6K1激酶基因Rps6kb1、Club细胞标志物细胞色素氧化酶（Cyp2f2）、纤毛细胞标志物乙酰化微管 蛋白（Act）和叉头框转录因子J1（Fox j1）,杯状细胞标志物氯化物通道钙活化家族成员3（Clca3）叉头框转录因子a3 （Foxa3）的mRNA表达情况。结果 不同浓度的PF-4708671对vClub细胞克隆数量无明显影响（P＞0.05）,而4、20、 100 nmol/L PF-4708671浓度组Club细胞克隆数量均较0 nmol/L组减少（P＜0.05）。不同浓度的PF-4708671对vClub 向Club细胞的分化无明显影响,其特征分子Cyp2f2在mRNA表达水平差异方面无统计学意义。PF-4708671对Club 细胞向纤毛细胞和杯状细胞的分化能力均无明显影响,4组间2种细胞的标志物Act、Fox j1及Clca3、Foxa3表达水平 差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 mTOR/S6K1信号通路对小鼠气道干/祖细胞的增殖功能呈正调控作用,对其 分化功能影响甚微。     

利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞的初步研究

目的 利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞.方法 利用非整合型载体,将四个转录因子:Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc导入脐血来源的造血干/祖细胞(CD34+细胞)重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs),再利用与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养法将其定向分化成CD34+造血干/祖细胞.借助iPSCs可以在体外无限传代、大量扩增的特点,实现体外保存及大量扩增造血干/祖细胞的目的.结果 脐血CD34+细胞可以在体外重编程为非整合型iPSCs,并能够高效定向分化成为CD34+细胞,其分化效率比胚胎干细胞(ESCs)有显著提高.结论 利用诱导性多能干细胞技术体外大量扩增脐血造血干/祖细胞是一个可行的方案,具有良好的应用前景.     

X染色体耦联锌指蛋白在人脑胶质瘤干祖细胞中的表达及意义

目的探讨X染色体耦联锌指蛋白(Zfx)在人脑胶质瘤干祖细胞中的表达及意义。方法逆转录PCR方法检测人脑胶质瘤干祖细胞SU2及其分化后贴壁细胞中mRNA的表达;细胞免疫组化检测人脑胶质瘤干祖细胞SU2中Zfx、CD133、nestin的表达;然后在含有10%胎牛血清培养液中诱导SU2分化,并检测分化后的细胞中Zfx、S100、GFAP的表达。结果 Zfx在胶质瘤干祖细胞SU2及其分化后贴壁细胞中的mRNA均有表达。Zfx在人脑胶质瘤干祖细胞SU2中的蛋白水平表达高,但SU2经诱导分化后细胞中Zfx蛋白水平表达减弱。结论 Zfx在人脑胶质瘤干祖细胞中高表达,可能在人脑胶质瘤干祖细胞自我更新和分化抑制过程中起重要作用。     

胍丁胺对体外培养海马神经前体细胞增殖的影响及作用机制

目的前期证明胍丁胺(agmatine,Agm)作为一种新型神经递质具有抗抑郁作用,能够促进慢性应激小鼠海马神经元再生。本实验通过观察胍丁胺对体外培养海马神经前体细胞增殖的影响及作用机制,探讨其抗抑郁作用的细胞分子机制。方法培养扩增新生大鼠海马神经前体细胞,通过3H-TdR参入法和CCK-8试剂盒检测胍丁胺对其增殖的影响;培养体系内加入H89(PKA特异性抑制剂)或PD98059(MEK特异性抑制剂),观察这两种抑制剂对胍丁胺作用的影响。结果胍丁胺在0.1~10μmol·L-1浓度范围内,浓度依赖性地促进神经前体细胞的增殖,这种促增殖作用可以被H89(10μmol·L-1)和PD98059(10μmol·L-1)取消。结论胍丁胺可以促进体外培养的海马神经前体细胞增殖,此作用与cAMP-PKA-CREB通路和MEK-ERK-CREB通路相关。     

Metabotropic glutamate receptors in stem/progenitor cells

Functional mGlu receptor subtypes are found in stem/progenitor cells, and regulate proliferation, differentiation, and survival of these cells. Activation of mGlu5 receptors supports self-renewal of embryonic stem cells, which are pluripotent cells isolated from the blastocyst capable of generating all the body's cell lineages, including germ cells. Differentiation of embryonic stem cells into embryoid bodies is associated with the induction of mGlu4 receptors, the activation of which drives cell differentiation towards the mesoderm and endoderm lineages. Different mGlu receptor subtypes, mGlu3 and mGlu5 receptors in particular, are found in neural stem cells (stem cells resident in the CNS that give rise to neurons, astrocytes or oligodendrocytes) isolated from the developing brain or from regions of persistent neurogenesis of the adult brain (e.g. the subventricular zone lining the wall of the lateral ventricles). The evidence that activation of mGlu3 and mGlu5 receptors stimulates proliferation of these cells is particularly interesting because of the similarities between neural stem cells and putative cancer stem cells that support the growth of malignant gliomas. A link among mGlu receptors, stem cells and cancer is supported by the finding that mGlu4 receptors are expressed by cerebellar granule cell neuroprogenitors, which are the putative cells of origin of medulloblastomas. The study of mGlu receptors in stem/progenitor cells has potential applications in the optimisation of protocols of cell expansion and differentiation aimed at cell replacement strategies, and may gain new insights into the pathophysiology of neurodevelopmental disorders and brain tumours.