大鼠肝卵圆细胞的分离培养和体外分化研究

目的 观察大鼠肝卵圆细胞的活化，为进一步研究肝卵圆细胞特征建立简单的分离培养方法。方法 利用2-乙酰氨基笏／部分肝切除建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型，采用选择性消化法从该模型中分离纯化肝卵圆细胞，并做免疫细胞荧光鉴定。用丁酸钠诱导其分化。结果 成功地建立了肝卵圆细胞活化模型，并从中分离培养了表达OV6、CK19、AFP、白蛋白、c-kit、Thy1、CD45和CD34的卵圆细胞。在丁酸钠刺激下它可向肝细胞分化。结论 利用选择性消化法可以分离到肝卵圆细胞，并且其具有肝干细胞的特征。     

大鼠肝卵圆细胞的体外分离、培养及脾内移植

我们在成功建立和优化大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上[1,2 ] ,在体外对大鼠肝卵圆细胞进行分离与培养 ,并将其移植入同种异体大鼠脾脏内 ,观察其在脾内的演变结果 ,为肝干细胞移植的临床应用提供实验依据。一、材料与方法1.大鼠肝卵圆细胞分离 :采用本室建立和改进的体外两步灌流法分离大鼠肝实质细胞和非实质细胞[3 ] ;所获细胞先用 5 0g离心 ,沉淀即为肝实质细胞 ,上清液中富含肝卵圆细胞 ,上清液采用 5 0 0g进行离心 ,沉淀物中富含肝卵圆细胞 ,加F12培养液悬浮细胞 ,再用相同条件离心 ,反复 3次 ,将沉淀物用F12培养液制备成细胞悬液 ;…     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析

目的研究简单易行的成体大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞鉴定方法。方法采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12d切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达。结果分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达。生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性。结论简单易行的肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础。     

肝卵圆细胞来源分化增殖的研究进展

卵圆细胞为肝内一种祖细胞，在肝细胞严重受损或分裂增生受抑制时可向肝细胞和胆管上皮细胞分化，是一种具有双向分化潜能的祖细胞。卵圆细胞的分化增殖受多种因素调控．新近研究认为SDF-1-CXCR4生物学轴在卵圆细胞增殖过程中起非常重要的作用。肝癌的发生与卵圆细胞的分化异常有一定的关系。卵圆细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞使其可能成为旰脏细胞移植的重要细胞来源，在治疗终末期肝病、生物人工肝及基因治疗的研究领域有着广阔的应用前景。     

大鼠肝卵圆细胞中matrilin-2的表达及其意义

目的探讨大鼠肝脏再生过程中肝卵圆细胞matrilin-2的表达及其意义。方法利用大鼠部分肝切除(PH)或2-乙酰氨基芴灌胃+/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝脏再生模型,并设正常对照组。应用免疫组织化学和RT-PCR方法研究肝脏组织中matrilin-2表达情况。结果免疫组化发现正常对照组及PH组肝脏组织中只有极少量的matrilin-2表达位于胆管血管周围及肝窦状隙内,而在2-AAF/PH模型中可见matrilin-2表达位于门静脉周围的肝窦状隙内,RT-PCR发现2-AAF/PH组肝卵圆细胞中matrilin-2mRNA高表达,而PH组及正常对照组成熟肝细胞中无matrilin-2mRNA表达。结论matrilin-2是肝卵圆细胞在肝脏再生过程中产生的重要的细胞外基质蛋白,与肝卵圆细胞的增殖分化过程有密切关系。     

急性肝损伤大鼠肝卵圆细胞活化增殖的研究

目的用D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)联合胆总管结扎(Common Biliary Duct Ligation,CBDL)建立大鼠急性肝损伤模型,观察肝损伤后再生过程中肝卵圆细胞(Hepatic Ovel Cell,HOC)的活化和增殖.方法雄性SD大鼠,胆总管结扎离断术后予腹腔注射D-GalN 2.0g/kg,对照组不做任何处理.处理后第1、2、3、4、5及6天6个时间点测血清肝功能,取肝组织分别行苏木精-伊红染色、电镜、免疫组织化学及RT-PCR检测,并对符合HOC形态学特征且胞浆OV-6阳性染色的细胞进行计数.结果肝功能损害以第2天明显(P＜0.01);对照组肝组织内未见HOC,处理组各时间点均见有不同程度的HOC增殖反应,以第3天HOC计数最多(P＜0.05);HOC胞质AFP、OV-6染色阳性,胞核BrdU染色阳性;RT-PCR示模型组CGT-mRNA表达明显增多.结论用D-GalN2.0g/kg联合CBDL可获得较满意的大鼠HOC增殖模型,在急性肝损伤时HOC被活化和不同程度的增殖,参与了肝再生过程.     

胚胎干细胞源性肝卵圆细胞的体外研究

肝卵圆细胞对肝脏生长发育有重要意义。已建立的啮齿类动物肝卵圆细胞诱导实验模型使人们对啮齿类动物肝卵圆细胞的认识有了很大的提高，诱导过程烦琐耗时，显然不适用于人类。现将本研究结果报道如下     

大鼠肝卵圆细胞的形态学及免疫组织化学特征研究

肝卵圆细胞等肝干细胞有可能在肝衰竭及遗传性肝病治疗中发挥重要作用[1 ] 。我们在已建立的大鼠肝卵圆细胞增殖模型基础上 ,对大鼠肝卵圆细胞的形态学参数及细胞表型等生物学特征进行研究。一、材料与方法1.大鼠模型建立 :按照我们建立和改进的方案[2 ] ,选择体重 15 0 ｇ左右的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (第三军医大学动物研究所提供 ) ,2～ 3个月龄 ,实验前单只分笼饲养 1周以上。实验大鼠通过胃管灌喂2 乙酰氨基芴 (ＡＡＦ ,Ｓｉｇｍａ公司产品 ) ,每天 1次 ,连续 4ｄ ,第 5天在戊巴比妥全身麻醉下行 2 3肝切除 (手术当日不灌喂ＡＡＦ) ,…     

转化生长因子β1 对大鼠肝卵圆细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在肝卵圆细胞增殖过程中发挥的调控作用.方法 60只雄性SD大鼠随机分成实验组和对照组,建立肝卵圆细胞增殖动物模型(2-AAF/PH),采用免疫组织化学、RT-PCR、原位细胞凋亡检测方法,观察上述两组动物模型不同时间点肝脏卵圆细胞增殖情况和TGF-β1 及其受体动态表达变化.结果 实验组在肝切除术后2 d 即出现卵圆细胞,10 d达高峰,16 d 卵圆细胞数目明显减少,肝小叶和肝索结构恢复;TGF-β1 表达在术后6 d开始增多,16 d达高峰,21 d 降至正常水平;TUNEL 染色阳性细胞高峰出现在卵圆细胞的增殖高峰后期,和TGF-β1 表达高峰出现在同一时期.结论 TGF-β1 与卵圆细胞增殖和凋亡密切相关,在肝卵圆细胞增殖过程中起负调控作用.     

大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞在2-AAF/PH模型中的增殖及关系研究

目的 研究大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞增殖过程中关系,探讨肝星状细胞(HSCs)对卵圆细胞增殖分化的调控作用.方法 利用2-乙酰氨基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型,对术后不同时间点的肝组织标本进行常规组织学观察,并用卵圆细胞标志物OV-6和HSCs激活标志物desmin进行免疫组化染色和免疫荧光双标,对阳性细胞进行半定量计数并分析两者相关性.结果 PH后第2天,门静脉区域开始出现小管样结构的卵圆细胞和HSCs增殖;PH后第4～6天,HSCs形成网格状伴随卵圆细胞迅速增殖,向肝实质内侵入;PH后第9天,HSCs与卵圆细胞增殖达到顶峰;PH后第12～15天,出现新生小肝细胞结节及小肠样化生,HSCs随卵圆细胞显著减少,位于小肝细胞结节周围,结节内有少量HSCs;PH后第18～21天,HSCs与卵圆细胞进一步减少或消失.直线相关分析表明两者高度相关.结论 HSCs参与了肝卵圆细胞介导的肝再生,可能通过产生多种生长因子以及重塑胞外基质对卵圆细胞的增殖分化具有重要的调控作用.     

肝卵圆细胞在进行性肝损伤过程中分布及迁移的实验研究

目的 探讨卵圆细胞在进行性肝损伤过程中的分布及迁移规律。方法 清洁型SD大鼠60只随机分为对照组(20只)和实验组(40只)，两组均于肝癌造模后的不同时相切取肝组织标本进行形态学观察、常规病理和原癌基因编码蛋白(C-kit)免疫组化检测。结果 对照组大鼠肝脏表面光滑，组织学形态正常，偶见C-kit阳性细胞。实验组于肝癌造模后的第2周，首先于汇管区发现卵圆细胞沿胆管上皮依次排列增生，这些卵圆细胞呈C-kit阳性表达。随着肝损伤进行性加重，卵圆细胞以汇管区为中心向肝小叶穿插、迁移。肝癌形成期，以混合型癌多见，癌结节内外均见有卵圆细胞，此期C-kit阳性细胞仍集中于汇管区。结论 卵圆细胞为肝组织内对损伤反应最敏感的一种细胞；肝卵圆细胞的无序迁移参与假小叶形成；卵圆细胞与肝癌的发生密切相关。     

游离脂肪酸对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞周期的影响

目的：探讨游离脂肪酸（FFAs）对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖和生长周期的影响。方法：用不同浓度的游离脂肪酸处理大鼠HBZY-1细胞株（即大鼠肾小球系膜细胞）24h～72h。采用噻唑蓝比色（MTT）法检测内皮细胞增殖情况,流式细胞术（FCM）分析法测定细胞周期变化。结果：游离脂肪酸可抑制HBZY-1细胞的生长增殖（与对照组比较,P〈0.01）,且这种抑制作用具有剂量和时间依赖性;游离脂肪酸作用于HBZY-1细胞24h、48h、72h,细胞周期发生明显改变,G1期细胞数增多,S期细胞数减少（与对照组比较,P〈0.01）。结论：游离脂肪酸可通过停滞细胞生长于G1期,抑制大鼠肾小球系膜细胞的生长增殖。     

白细胞介素-13对肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响

目的：探讨白细胞介素—13(IL—13)对肾小球系膜细胞(MC)增殖及其细胞周期的影响。方法：用甲基偶氮唑法(MTT)测定MC增殖，流式细胞术分析细胞周期。结果：IL—13在1ng／ml、5ng／ml、10ng／ml、100ng／ml浓度范围呈剂量依赖性抑制5％FCS培养的和脂多糖(LPS)诱导的MC增殖，抑制率分别为19．8％和29．23％、24．35％和37．05％、30．03％和46．6％、46．93％和55．23％。IL—13作用MC48h，使MC较多滞留于G1期，而S期细胞减少。结论：IL—13通过参与细胞周期的调控而抑制MC增殖。     

SDF-1/CXCR4在大鼠肝卵圆细胞增殖过程中的表达及意义

目的研究基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）及其受体CXCR4、CK18、CK19及AFP在大鼠肝卵圆细胞增殖过程中的表达情况,进一步探讨SDF-1/CXCR4生物学轴的作用。方法选择144只体重180～200g雄性Wistar大鼠,按随机抽签法平均分为4组后分别给予不同的处理,即灌喂2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene,AAF）和（或）尾静脉注射CXCR4的特异性抑制剂AMD3100,并联合行部分肝切除术（PH）,因而分别命名为AAF组、AAF/AMD3100组、AMD3100组和PH组。AAF剂量为15mg/（kg·d）,AMD3100剂量为1.25mg/（kg·d）。各组分别于手术后第3、5、7、10、14和21d各处死6只大鼠,取其肝组织行常规组织学观察,采用免疫组织化学染色法检测肝卵圆细胞中SDF-1及其受体CXCR4、CK18、CK19和AFP的表达。结果AAF组大鼠肝组织内见明显的肝卵圆细胞增殖反应且卵圆细胞胞浆CK18、CK19、AFP和SDF-1及其受体CXCR4染色均呈阳性;AAF/AMD3100组大鼠肝卵圆细胞增殖的数量和SDF-1及CXCR4阳性细胞数较AAF组明显减少（P〈0.05,P〈0.01）;AMD3100组及PH组大鼠肝组织均未见到卵圆细胞。结论肝卵圆细胞在增殖过程中表达CK18、CK19、AFP和SDF-1及其受体CXCR4,SDF-1/CXCR4轴可能有刺激肝卵圆细胞增殖的作用。     

胎兔颅骨成骨样细胞体外培养模型的建立△

目的建立成骨细胞体外培养模型,为骨代谢和成骨机理研究提供细胞学基础.方法用酶消化和组织块移行生长相结合方法,从胎兔颅骨中分离出成骨样细胞群进行原代及传代培养,应用组织学、酶细胞化学、免疫细胞化学和染色体染色对其生物学和遗传学特性进行鉴定.结果胎兔颅骨成骨样细胞具有体内成骨细胞的形态特征、ALP活性及合成分泌BMP等的功能,并能在体外发生钙化,其遗传学性状稳定.结论该模型具有体内成骨细胞的生物学和遗传学特性,可用于成骨细胞代谢和成骨作用的体外研究.     

睾酮对体外大鼠阴茎海绵体组织细胞增殖的影响

目的:探讨睾酮对雄性SD大鼠阴茎海绵体组织细胞增殖的影响。方法:无菌条件下获取大鼠阴茎海绵体组织,免疫组化法检测其雄激素受体的表达,再分别采用酶消化法培养平滑肌细胞和贴壁法培养成纤维细胞,用四氮唑蓝(MTT)还原法观察对照组及睾酮10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L浓度组对海绵体组织细胞增殖的影响。结果:雄激素受体在大鼠阴茎海绵体组织表达,10-5mol/L睾酮刺激可促进大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞和成纤维细胞增殖,MTT还原法测定分别为68100±2200和70200±1300(P<0.05);10-4mol/L睾酮刺激可抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增殖,MTT法测定A值为分别55000±1400和59100±1500(P<0.01);其他组作用不显著。结论:大鼠阴茎海绵体组织存在雄激素受体,睾酮可经雄激素受体途径对阴茎海绵体组织细胞增殖的产生影响,不同浓度睾酮可促进或抑制海绵体平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

大鼠颈椎病实验模型的设计与建立

目的：建立一种理想的颈椎病实验模型。方法：３０只大鼠随机分为实验模型组与对照组,每组１５只。实验模型组借助手术方法直接切除大鼠颈背部伸肌群,对照组行伪手术。造模术后２月、４月、６月选择实验模型组、对照组大鼠各５只,取其颈椎（Ｃ３～７）作组织形态学观察,并相互比较。结果：实验模型组大鼠颈椎间盘退变较对照组明显加快、加重,出现与人类颈椎病相类似的病理改变。结论：颈部肌肉软组织即动力平衡因素在颈椎病发病机理中意义重大。     

pTNM分期预测肝癌肝移植疗效的临床研究

目的 评价pTNM分期对肝癌肝移植疗效的预测价值。方法 对1993年4月至2003年1月我科59例采用肝移植治疗的肝癌患者的临床资料进行回顾性分析，按pTNM分期原则进行临床分期，比较各期间肝癌肝移植的疗效。结果 pTNM分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa和Ⅳa期的肝癌肝移植术后1年生存率分别为66．67％、66．67％、40．91％和31．75％，2年生存率分别为66．67％、66．67％、21．29％和31．75％，各期间术后累计生存率无统计学差异。结论 pTNM分期并不适用于肝癌肝移植的术前分期。