蛋白激酶CK2β小干扰RNA促进小鼠受精卵早期发育

目的：利用特异性小发夹RNA(siRNA)寡核苷酸片段,研究蛋白激酶CK2调节亚基CK2β对小鼠受精卵早期发育的影响,阐明调控小鼠受精卵早期发育的机制。方法：超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,分别显微注射TE缓冲液、scramble siRNA和CK2β siRNA,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测CK2β siRNA的干涉效能;相差显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定M期促进因子（MPF）活性。结果：与TE缓冲液和scramble siRNA组比较,CK2β siRNA组CK2β的mRNA水平和蛋白表达显著降低（P<0.0）,MPF的活性明显升高（P<0.01）,在人绒毛膜促性腺激素(hCG) 注射后28.5 h达到高峰;受精卵第一次有丝分裂加速,CK2β siRNA组在hCG注射后28.5 h大多数受精卵已经分裂为2-细胞期胚胎;hCG注射后32.0 h卵裂率为89.5%,与TE缓冲液和scramble siRNA组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论： CK2βsiRNA　通过提前激活MPF活性,进而促进小鼠1-细胞期受精卵的发育。     

14-3-3蛋白调节1-细胞期小鼠受精卵有丝分裂

 [摘要]目的：研究14-3-3蛋白在1-细胞期小鼠受精卵有丝分裂中的作用。方法：RT-PCR技术鉴定小鼠受精卵14-3-3蛋白亚型。采用显微注射方法将14-3-3siRNA注射入小鼠受精卵G1期,观察受精卵的卵裂率、形态学变化及MPF活性。结果：小鼠受精卵中的14-3-3蛋白亚型是14-3-3ε。小鼠受精卵注射pSUPER-14-3-3εsiRNA后,与对照组相比,卵裂率下降,有丝分裂延迟,有更多的受精卵发生形态异常,MPF活性最高值显著下降。结论：14-3-3蛋白在调节小鼠受精卵有丝分裂中发挥重要作用。     

双丁酰环腺苷酸通过蛋白激酶Wee1B调控小鼠1-细胞期受精卵的发育研究

目的 探讨蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)激活剂双丁酰环腺苷酸(dual dibutyryl cyclic AMP,dbc AMP)调控蛋白激酶Wee1B蛋白对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,为进一步研究母源性因子Wee1B在早期胚胎发育过程中的作用提供理论基础。方法将2 mmol/L dbc AMP作用于小鼠1-细胞期受精卵1 h,并显微注射Wee1Bm RNAs,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Wee1B-WT/KD注射组、Wee1B-S15A/D注射组,继续在M16培养基中培养。相差显微镜下观察小鼠受精卵的形态变化和卵裂情况,放射自显影测定各期细胞有丝分裂促进因子(MPF)活性,Western blotting方法检测Wee1B蛋白的表达、CDC2-p Tyr15和Wee1B-p Ser15的磷酸化水平。结果小鼠受精卵在有dbc AMP存在时,G_1、S、G_2和M各细胞周期均检测到磷酸化的Wee1B表达,非磷酸化条带在G_2期和M期才能检测到;各组受精卵卵裂出现时间延迟,卵裂率显著降低;h CG注射后35 h内,MPF活性一直处于低水平,CDC2-p Tyr15磷酸化状态和MPF活性变化趋势相一致。结论dbc AMP激活PKA后,PKA磷酸化Wee1B蛋白的S15位点,Wee1B活性增加,阻滞受精卵分裂,本研究提示Wee1B蛋白的S15位点可能是PKA作用的生理靶点,可以更好地认识早期胚胎发育的分子事件。     

TOR抑制剂对小鼠受精卵卵裂以及MPF活性的影响

目的 观察哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)抑制剂对小鼠受精卵第一次卵裂及第一次有丝分裂中MPF活性的影响.方法 在小鼠受精卵中加入雷帕霉素后,显微镜观察卵细胞分裂情况,计算卵裂率;用液闪计数仪测定各组分别加入雷帕霉素和渥曼青霉素后的MPF活性;用免疫电泳方法 检测加入雷帕霉素后cyclin B的表达.结果 加入mTOR抑制剂后,卵裂率下降,MPF活性在小鼠受精卵第一次分裂中未见升高,卵细胞中cyclin B的表达下降.结论 mTOR抑制剂可抑制小鼠受精卵第一次卵裂,同时抑制小鼠受精卵第一次分裂时MPF活性的升高.     

mTOR抑制剂对小鼠受精卵卵裂以及MPF活性的影响

目的观察哺乳动物雷帕霉素靶（mTOR）抑制剂对小鼠受精卵第一次卵裂及第一次有丝分裂中MPF活性的影响。方法在小鼠受精卵中加入雷帕霉素后,显微镜观察卵细胞分裂情况,计算卵裂率;用液闪计数仪测定各组分别加入雷帕霉素和渥曼青霉素后的MPF活性;用免疫电泳方法检测加入雷帕霉素后cyclin B的表达。结果加入mTOR抑制剂后,卵裂率下降,MPF活性在小鼠受精卵第一次分裂中未见升高,卵细胞中cyclin B的表达下降。结论mTOR抑制剂可抑制小鼠受精卵第一次卵裂,同时抑制小鼠受精卵第一次分裂时MPF活性的升高。     

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的：利用特异性发夹结构Wee1B shRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法：超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1B shRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果：与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1B shRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1B mRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1B shRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33 h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25% 和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1B shRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

小鼠受精卵早期发育过程中PlK1表达和活性变化及其与MPF关系的研究

目的：研究在小鼠受精卵早期发育过程中，哺乳动物Polo-like激酶（PlK1）的表述和活性变化及其与有丝分裂促进因子（MPF）活性变化的关系。方法 以一细胞期小鼠受精卵为材料，用Western Blotting方法检测PlKl蛋白含量；用液闪计数分析仪分别测定PlKl和MPF的cpm值来表示各自激酶活性。结果 小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中PlKl的含量没有显著变化，而PlK1活性在M期达到最高峰，在M期退出时迅速下降。加入MPC抑制剂后MPF和PlK1活性均未在M期出现峰值。结论 PlK1的活性是随着细胞周期的进程而变化的；PlK1在小鼠受精卵早期发育过程中可能参与了MPF的自我催化活化环。     

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的:利用特异性发夹结构Wee1BshRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1BshRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果:与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1BshRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1BmRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1BshRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25%和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1BshRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中MPF蛋白水平的检测

目的::检测小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中M期促进因子(MPF)蛋白水平,探讨MPF在早1-细胞期受精卵中的变化.方法:利用超排卵及反复冻融裂解细胞的方法,对卵母细胞和受精卵细胞中MPF的催化亚基Cdc2、调节亚基周期素B进行Western印迹分析.结果:在500个MⅡ卵母细胞和受精卵细胞样品中,可以清楚看到各有一条粉紫色的特异免疫印迹带显示Cdc2,根据凝胶成像及分析系统的Gelworks应用软件分析,得到的强度的相对值分别是100%和约80%.用700个卵细胞进行观察时可以看到MⅡ卵母细胞显示有2条免疫印迹带显示细胞周期素B,其中一条为60～63 kDa,是周期素B;另一条则位于周期素B的下方,约40～45 kDa,且色调偏淡.而受精卵细胞样品在相应的部位则未能见到特异的免疫印迹带.结论:小鼠早1-细胞期受精卵(G1期)中的Cdc2蛋白水平仍保持在相对的较高水平;而细胞周期素B的量显著减少,难以检测.     

小鼠受精卵早期发育过程中PDE活性变化、及其与MPF关系的研究

目的 研究在小鼠受精卵早期发育过程中,磷酸二酯酶(PDE)的活性变化及与有丝分裂促进因子(MPF)活性变化相比较,初步探讨哺乳动物受精卵早期发育的细胞周期调控机制.方法 以小鼠受精卵为材料,通过离子交换方法,检测PDE和MPF的活性.结果 受精卵早期发育过程中PDE和MPF活性随细胞周期变化而波动,G2期PDE活性升高而MPF在M期活性升高.结论 PDE参与了小鼠受精卵的早期发育并且作用时间早于MPF.     

创伤后T细胞功能受抑与信号转导变化的关系

目的 研究创作小鼠Ｔ细胞功能受抑与信号转导变化之间的关系。方法 将Ｂａｌｂ／ｃ小鼠６０只,随机分为正常对照、伤后１、２、４、７、１０天共６组（每组１０只）,制备小鼠闭合性创伤模型,以尼龙毛纤维分离脾细胞中的Ｔ细胞,测定Ｔ细胞功能,并探讨其与细胞内信号转导变化之间的关系．结果 创伤小鼠活化Ｔ细胞白细胞介素２（ＩＬ－２）ｍＲＮＡ及ＩＬ－２受体α（ＩＬ－２Ｒα）ｍＲＮＡ水平降低,ＩＬ－２生成、ＩＬ－２Ｒ     

吗啡依赖小鼠脑组织cAMP系统的变化及腺苷酸环化酶磷酸化 …

观察吗啡依赖小鼠脑组织腺苷酸环化酶（ＡＣ）／ｃＡＭＰ信号系统的变化、ＡＣ活性的磷酸化调节及蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）抑制剂对吗啡依赖形成的影响。方法采用放射免疫和酶学方法。结果（１）吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质ＡＣ活性、ｃＡＭＰ含量及可溶相蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）活性明显增加,小脑未见此变化;每日给吗啡前１５ｍｉｎ脑室注射ＰＫＡ抑制剂的小鼠纹状体、海马及大脑皮质ＡＣ活性明显低于吗啡依赖小鼠。（２）纳洛     

吗啡依赖小鼠脑组织cAMP系统的变化及腺苷酸环化酶磷酸化调节

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CDC14B在小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期的动态表达及其定位

目的：检测小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期中细胞分裂周期蛋白14B（CDC14B）的表达水平及其定位,初步阐明CDC14B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制。方法：通过超排卵技术分别收集小鼠1-细胞期受精卵,采用RT-PCR和Western blotting法检测小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA和蛋白表达水平;采用细胞免疫荧光法观察小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B和β微管蛋白（β-tubulin）的共定位情况。结果：与G₁期比较,小鼠S、G₂和M期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。间接免疫荧光实验,CDC14B（红色荧光）和β-tubulin（绿色荧光）在G₁期和S期共定位于小鼠受精卵皮质;在G₂早期,CDC14B和β-tubulin共定位于皮质和细胞质;在G₂晚期,部分CDC14B入核;在M期,CDC14B和β-tubulin共定位于纺锤体。结论：CDC14B在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中动态表达,CDC14B存在核浆纺锤体转位,CDC14B的定位变化可能调控纺锤体的功能。     

PKA信号通路参与高糖介导的THP-1细胞G6PD活性改变及呼吸爆发功能障碍

目的观察高糖环境下THP-1细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性及呼吸爆发功能改变及其可能信号通路。方法利用蛋白激酶A(PKA)特异性抑制剂PKI和PKA激动剂Forskolin预处理不同浓度葡萄糖培养的THP-1细胞,检测不同处理组的G6PD活性、腺苷酸环化酶(cAMP)含量、ROS产量及磷酸化p47phox的表达变化。结果与正常对照组相比,高糖组及PKA激动组的G6PD活性、ROS产量及磷酸化p47phox的表达减少,cAMP含量明显增加(P<0.01)。PKA抑制组的G6PD活性、cAMP含量及磷酸化p47phox的表达未见明显变化,与正常对照组相比无明显差异(P>0.01)。结论高糖通过激活cAMP-PKA信号通路来抑制G6PD活性,从而影响THP-1细胞的NADPH氧化酶(NOX)的激活,引起呼吸爆发功能障碍,为糖尿病患者白细胞功能低下,抗感染能力降低的可能机制之一。     

转染LKB1基因乳腺癌细胞与胚胎发育信号通路及cAMP/PKA通路的关系

 目的 探讨抑癌基因LKB1与胚胎发育(Sonic Hedgehog,SHH)信号通路、cAMP/PKA信号通路之间的相互关系。方法 抑癌基因LKB1转染人乳腺癌细胞MDA MB 231,分MDA MB 231组(231组)和转染LKB1基因的MDA MB 231(LKB1组)两组,每组分别采用0、 5×10-6、1×10-5、2×10-5mol/L等4种浓度的SHH信号通路抑制剂环靶明(cyclopamine)作用于细胞,各小组细胞分别用RT PCR法和Western blot法检测SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA表达水平和蛋白表达水平,用cAMP、PKA试剂盒检测cAMP、PKA数值水平。 结果 LKB1组的细胞通过不同剂量环靶明抑制后,SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA和蛋白表达水平相应较231组明显抑制,且与环靶明剂量呈正相关,抑制效果在环靶明浓度为10×10-6mol/L时最明显,继续增加环靶明浓度到20×10-6mol/L,抑制效果保持不变。231组和LKB1组中细胞的PKA和cAMP数值均随环靶明浓度增加而增高,至10×10-6mol/L时达到最高,继续增加环靶明浓度到20×10-6mol/L,两组中的PKA和cAMP数值保持不变。在相同环靶明浓度下,LKB1组中PKA和cAMP数值高于231组中相应数值。结论 抑癌基因LKB1协同环靶明抑制乳腺癌MDA MB 231细胞的SHH信号通路的同时亦协同增加cAMP/PKA信号通路的表达,且在环靶明浓度为10×10-6mol/L时效果最明显;推测存在LKB1 SHH cAMP/PKA通路。     

缩泉丸对自然衰老大鼠逼尿肌AC-cAMP通路的影响

[目的]观察自然衰老大鼠膀胱逼尿肌中腺苷酸环化酶(AC)、环磷酸腺苷(cAMP)及蛋白激酶A(PKA)的浓度变化及PKA蛋白表达,探讨缩泉丸“缩尿”的作用机理.[方法]选用老年大鼠(20月龄)50只,分为模型组,金匮肾气丸组,缩泉丸高、中、低剂量组,每组10只;青年大鼠(3月龄)10只作为空白组.采用酶联免疫吸附( E...