人宫颈癌组织环加氧酶2mRNA剪接异构体的表达

背景宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发生、发展与环加氧酶2密切相关.目的探讨人宫颈癌组织中是否存在环加氧酶2选择性剪接异构体的表达及其可能意义.设计非随机对照实验.单位重庆医科大学生物化学与分子药理学重点实验室,重庆医科大学附属第一医院妇产科.对象选择13例重庆医科大学附属第一医院妇产科2002-03/2002-04宫颈癌住院患者的癌组织及正常组织.方法设计一对全新引物,并采用反转录聚合酶链反应技术,从宫颈癌组织中分离环加氧酶2 mRNA,然后对电泳条带进行克隆、测序和分析.主要观察指标①观察癌组织与正常组织反转录聚合酶链反应琼脂糖电泳结果.②分析癌组织与正常组织电泳条带测序结果.结果①正常宫颈组织未发现环加氧酶2目的条带(252 bp),而宫颈癌组织则出现两条条带,除环加氧酶2目的条带外,还有一新的电泳带(534 bp),经克隆和测序证实,该新条带除目的条带的环加氧酶2 DNA的第7、8外显子序列外,还包含第7、8外显子间的内含子序列,即保留的内含子(282 bp).②根据阅读框推测,在保留的内含子第48～50碱基出现终止密码.结论发现宫颈癌组织中存在环加氧酶2基因的选择性剪接异构体(Genbank accession numberBU493602),其所编码蛋白可能较已报道的环加氧酶2酶蛋白小.     

人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒的构建及鉴定

背景：生长分化因子5是一种刺激肌腱、韧带塑型，增强愈合反应有效的生长因子，在活性组织工程肌腱构建中有重要作用。目的：构建人重组pcDNA6．2／生长分化因子5质粒，为转染基质干细胞向肌腱诱导分化实验奠定基础。设计、时间及地点：细胞基因工程体外实验，于2007-08／12在哈尔滨医科大学遗传学教研室和分子生物学教研室完成。材料：根据Genbank（NM000557）中人生长分化因子5的序列化学合成一对引物，从人胎儿软骨组织提取总RNA。方法：通过反转录聚合酶链反应得到人生长分化因子5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pcDNA6-2并转化入JM109菌株，提取重组质粒，PCR鉴定、酶切鉴定并测序。主要观察指标：反转录聚合酶链反应检测结果，PCR及Sal I和BamH I双酶切鉴定结果，重组质粒测序与Genbank中序列比较结果。结果：电泳显示，反转录-聚合酶链反应产物为一长约380bp的带，阳性克隆质粒经PCR电泳及双酶切均出现约380bp的片段。测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：成功构建出人重组DcDNA6．2／生长分化因子5质粒，为组织工程化肌腱过程中种子细胞的制备提供转染质粒。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的：克隆大鼠神经营养因子4全长基因，构建真核细胞表达质粒。 方法：实验于2004—06／2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠，用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板，应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中，构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。 结果：提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带，聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带，测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致（M86742），说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。 结论：正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定

目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450。方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成。提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因。并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定。BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450。结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因。重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1461bp的酶切产物。测序的结果用ClustalW在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源。阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带。对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1461bp和5900bp两条特异性条带。结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础。     

冠状动脉粥样硬化性心脏病新致病基因MEF2A第7外显子突变的检测

目的：检测中国冠状动脉粥样硬化性心脏病患者MEF2A基因第7外显子是否存在新突变位点。 方法：从1995-03／1996—08在武汉同济医院和武汉协和医院对来自湖北、黑龙江、河南、湖南等省的怀疑冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者156例进行临床调查。利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析结合变性高效液相色谱分析对所有对象的MEF2A基因第7外显子进行筛查，然后选取变性高效液相色谱分析图谱的峰型出现双或多峰者以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析图谱条带数目或位置与对照有差异者的片段进行DNA直接测序，测序结果与正常序列对照确定是否存在突变。 结果：参与实验的患者156例全部进入结果分析。①MEF2A基因第7外显子区域有4例患者变性高效液相色谱分析图谱呈双峰或多峰，结果疑为异常。②有7例患者的单链构象多态性分析电泳出现异常条带。即泳动比正常多出．条带或移动速度与对照有差异，表明这7例可能出现MEF2A基因突变。③所有异常标本的DNA直接测序结果与正常序列对照未发现第7外显子区域基因突变。 结论：冠状动脉粥样硬化性心脏病患者在MEF2A基因第7外显子未发现新的突变。变性高效液相色谱分析和聚合酶链反应-单链构象多态性结果与DNA测序结果并非平行关系，单链构象多态性分析同样存在假阳性。     

Landsteiner-Wiener血型系统测序分型技术的建立

目的 建立Landsteiner-Wiener血型系统的测序分型技术.方法 (1)随机采集45名非血缘关系无偿志愿捐献者外周血样,用EDTA抗凝.(2)从外周抗凝血样中提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术.反转录产生LW基因的cDNA(包括3个外显子),采用ABI PrismTM 3100 DNA测序仪对RT-PCR产物中LW基因的第1外显子进行测序.(3)提取基因组DNA,采用一对引物扩增LW基因的第1外显子、第1内含子和第2外显子,全长1224 bp,对第1外显子PCR产物直接进行DNA测序分析.结果 45例捐血者的样本,分别经RT-PCR产物测序和PCR产物直接测序,均取得了成功,LW基因第1外显子多态性位置第308碱基均为腺嘌呤.结论 本研究在国内率先建立了LW血型基因的分子测序方法,可为进一步研究中国人群LW血型基因多态性提供有效方法.     

Borna病病毒与慢性粒细胞白血病：病例对照

目的：检测人类慢性粒细胞白血病中Boma病病毒的感染率情况，分析Boma病病毒与慢性粒细胞白血病是否存在相关性。 方法：选取2004-01／2005-06重庆医科大学附属第一医院血液科收治的符合细胞形态学、免疫学及遗传学分型诊断标准的30例慢性粒细胞白血病确诊患者，另以30例健康自愿献血者作为正常对照。慢性粒细胞白血病患者和正常对照人群均取10mL外周枸橼酸二钠抗凝血，采用Ficoll-conray液分离出外周血单个核细胞，提取RNA，随后采用紫外分光光度计测A260,A280值，计算RNA浓度。采用琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测，建立Boma病病毒P24阳性定量标准曲线。随机抽取一浓度质粒聚合酶链反应扩增产物进行克隆测序。采用荧光定量套式反转录聚合酶链反应检测RNA中Boma病病毒P24基因片段。 结果：①5个梯度阳性模板定量扩增后均呈典型的S形，起始模板浓度与循环阈值相关系数达0．99969，具有良好的线性关系。质粒PCR产物克隆测序结果与美国国立卫生研究院基因列数据库中调出Boma病病毒的第二开放阅读框（ORFII）区P24序列一致，确定扩增成功。②4份样本电泳后可见28s，18s两条清晰的条带和稍欠清晰的5s条带。A260/A280值分别为1．825，1．946，1．833，1．895，均在1．8以上。RNA浓度分别为0．584，0．872，0．416，0．524mg／L。RNA的提取质量达到聚合酶链反应要求。③电泳条带清晰，反转录及第1轮聚合酶链反应扩增成功。④第2轮聚合酶链反应阳性模板扩增荧光呈典型的S形，说明定量聚合酶链反应扩增成功，起始模板浓度与循环阈值相关系数达0．99以上，具有良好的线性关系。慢性粒细胞白血病患者Boma病病毒P24基因片段与正常对照者的阳性率均为0％，无差异。 结论：本实验不支持Boma病病毒与慢性粒细胞白血病的发生具有相关性。     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的：构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒，为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法：实验于2005—06／2006—03在解放军第三О二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP—C1-hTERT，筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果：①聚合酶链反应扩增目的基因：电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3．5kb处有特异性目的条带，绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建和鉴定结果：双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果：荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论：①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建成功，为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法，并为建立永生化人肝细胞系奠定基础．     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

冠状动脉粥样硬化性心脏病新致病基因MEF2A第7外显子突变的检测

目的:检测中国冠状动脉粥样硬化性心脏病患者MEF2A基因第7外显子是否存在新突变位点。方法:从1995-03/1996-08在武汉同济医院和武汉协和医院对来自湖北、黑龙江、河南、湖南等省的怀疑冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者156例进行临床调查。利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析结合变性高效液相色谱分析对所有对象的MEF2A基因第7外显子进行筛查,然后选取变性高效液相色谱分析图谱的峰型出现双或多峰者以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析图谱条带数目或位置与对照有差异者的片段进行DNA直接测序,测序结果与正常序列对照确定是否存在突变。结果:参与实验的患者156例全部进入结果分析。①MEF2A基因第7外显子区域有4例患者变性高效液相色谱分析图谱呈双峰或多峰,结果疑为异常。②有7例患者的单链构象多态性分析电泳出现异常条带,即泳动比正常多出条带或移动速度与对照有差异,表明这7例可能出现MEF2A基因突变。③所有异常标本的DNA直接测序结果与正常序列对照未发现第7外显子区域基因突变。结论:冠状动脉粥样硬化性心脏病患者在MEF2A基因第7外显子未发现新的突变,变性高效液相色谱分析和聚合酶链反应-单链构象多态性结果与DNA测序结果并非平行关系,单链构象多态性分析同样存在假阳性。