早期贴壁分离并机械刮除纯化法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系

①目的探讨早期（60-80分钟）贴壁分离法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系，对细胞贴壁分离的时机以及传代后的形态变化的影响。②方法采用早期贴壁分离方法及机械刮除纯化法纯化问充质细胞，并用钙钴法染色检测细胞的ALP表达情况、使用成骨诱导荆诱导间充质细胞。用茜素红染色观察矿化结节的形成。③结果第一代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性；经条件培养基定向培养5天的细胞呈集落生长，并形成钙结节，茜素红染色阳性。④结论采用早期贴壁分离法可以短期内得到大量较纯的免间充质干细胞。在诱导剂作用下可成功分化成为成骨细胞，是培养骨组织工程用途的种子细胞的理想方法。     

骨髓间充质干细胞建立的成骨细胞培养模型的研究

目的：为骨折骨缺损治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型,观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养状态下的生长情况,对其向成骨细胞分化及分化能力进行研究.方法：采用全骨髓密度梯度离心法联合差速贴壁法从兔股骨骨髓中提取、分离、纯化BMSCs,取第3代BMSCs细胞分为两组进行培养,A组：为用含有诱导剂的低糖DMEM培养基的诱导培养组;B组：为常规培养组.倒置显微镜及HE染色观察记录各代次细胞形态等特征;CD44,CD90检测细胞表形,通过碱性磷酸酶（ALP）染色及标准化钙结节计数,鉴定细胞成骨活性.结果：兔骨髓间充质干细胞生长状态良好,培养7 d后各组细胞形态趋于一致,多呈长梭形,培养2 wk后对两组细胞进行ALP染色,可见A组细胞质内ALP染色阳性反应明显,B组染色显色弱.21 d时A组细胞茜素红染色后钙化结节数量多且较大,B组有少量钙结节形成,但较小.A组标准化钙结节计数显著高于B组差异具有显著统计学意义（P〈0.05）.结论：通过密度梯度离心法联合差速贴壁法所获得的BMSCs在常规培养或诱导培养时均可表现出成骨潜能,但诱导培养组的BMSCs的ALP活性更强,成骨能力更确切,可为骨组织工程远期实验研究提供理想的细胞模型.     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

骨髓间充质干细胞培养条件的改良及其定向分化

目的：探讨建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs）快速、有效的体外分离纯化方法。方法全骨髓离心贴壁法分离大鼠BMSCs;分别采用同种异体血清培养基（同种异体血清组）、胎牛血清培养基（胎牛血清组）、无血清培养基（无血清组）培养BMSCs,传代后换用胎牛血清培养;12、24、48、72 h和5 d首次换液;绘制P3代BM-SCs生长曲线;免疫荧光鉴定BMSCs CD44和vimentin的表达;诱导BMSCs的骨向、内皮向分化;茜素红检测钙结节表达;免疫荧光鉴定血管内皮样细胞CD31和vWF的表达。结果（1）同种异体血清组及胎牛血清组细胞形态均一,生长速率相似。（2）P3代BMSCs生长曲线显示：同种异体血清组与胎牛血清组倍增速率相似,均快于无血清组。（3）P3代BMSCs免疫荧光染色显示：同种异体血清组与胎牛血清组CD44、vimentin表达均高于无血清组。（4）成骨诱导14 d后,茜素红染色可见大量橘红色钙化结节形成。（5）内皮诱导14 d后,内皮样细胞表面标志物CD31、vWF阳性。结论改良培养条件后所获得的骨髓细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点。     

猕猴骨髓间充质干细胞采集、分离培养及生物学特性研究

[目的]体外分离培养猕猴骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生长增殖特性及其向成骨细胞的诱导分化能力。[方法]采用全骨髓贴壁法纯化猕猴骨髓源BMSCs,观察猕猴BMSCs的生长情况并运用MTT法绘制其生长曲线;对其进行流式细胞技术分析,鉴定BMSCs的生物学特性;在体外应用成骨诱导培养液(含0.1umol·L-1地塞米松、10mmol·L-1β-甘油磷酸钠、10%FBS、50umol·L-1抗坏血酸钠、维生素C 50mg·L-1)定向诱导分化,对分化后的细胞进行ALP、Von Kossa染色以鉴定其向成骨诱导的潜能。[结果]猕猴BMSCs的生长曲线如下:细胞在开始培养时有2d左右的相对静止期,3~6d增殖迅速,呈对数生长,7d后进入平台期,细胞增殖明显减缓。流式细胞仪检测结果显示:CD44和CD105的表达率分别为98.20%和95.01%,均呈强阳性,而CD34和CD45的表达率分别为1.38%和3.30%,呈阴性。未进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs,ALP染色呈阴性,未出现红色颗粒,且不随时间而改变;进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs,ALP染色呈阳性,第7d细胞中央出现散在分布的红色颗粒,并且随着诱导时间延长而增多颜色也逐渐加深,第14d镜下红色颗粒较前增多,且颜色也较前加深,其结果表明BMSCs在定向诱导分化为成骨细胞及骨细胞。未进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs,Von Kossa染色呈阴性,且不随时间而改变;进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs在第7d Von Kossa染色后镜下出现黑色沉积样结节,呈散在分布、大小不一,提示有钙样基质产生,第14d Von Kossa染色后镜下出现明显增大的黑色结节样物质,且数量增多、颜色加深。[结论]通过全骨髓贴壁分离法可以获得纯度较高的猕猴骨髓源BMSCs,体外培养具有较强的增殖能力,在成骨细胞诱导剂培养基里可以诱导其向成骨细胞方向分化,具有良好的成骨分化潜能,是组织工程骨中理想的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物,并进行成脂、成骨分化诱导。结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。生长曲线呈S形,细胞周期显示86.02%P3代细胞为G0/G1期,保持活跃的扩增能力。BMSCs高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。成脂诱导21 d后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。     

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入10-6mol/L淫羊藿苷培养基,对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性,组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果:体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成,而对照组未见钙化结节形成。结论:淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。     

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响

目的研究不同血清培养基对脂肪干细胞分离培养的影响.方法用4种不同类型的血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CD90、CD133、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14 d进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性.结果（1）新生牛血清组可见贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,无重叠现象;胎牛血清组均可见大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在;（2）新生牛血清组梭形贴壁细胞免疫荧光检测可见CD90为阳性,CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;胎牛血清组多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CD133组部分为阳性,CD90为阴性;（3）新生牛血清组贴壁细胞多数呈碱性磷酸酶阳性;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶阳性;（4）新生牛血清组均可见大量红色钙结节影;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞红色钙结节影.结论（1）新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞;（2）胎牛血清组培养含有大量的血管内皮细胞.     

人羊水源性间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 体外分离培养人羊水间充质干细胞(HAFMSCs),观察生物学特性,并鉴定其多向分化能力.方法 采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察细胞增殖能力.FACS检测表面抗原CD29,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,HLA-ABC,HLA-DR等的表达.RT-PCR法分析细胞中OCT-4,Nanog mRNA水平的表达.用成脂、成骨、内皮细胞培养基对HAFMSCs进行诱导,并分别采用油红O,Yon Kossa染色及细胞免疫荧光染色检测其分化能力.结果 羊水细胞于2-3d开始贴壁,10-15d形成细胞集落.传至第3代HAFMSCs呈旋涡状排列,生长曲线呈S形.FACS检测显示CD29,CD44,CD73,CD90,HLA-ABC表达阳性,CD34,CD45,HLA-DR表达阴性,RT-PCR法检测显示HAFMSCs中OCT-4、Nanog mRNA的表达阳性.成脂、成骨诱导21d后油红O、Von Kossa染色阳性,成内皮细胞诱导4周后细胞免疫荧光染色检测vWF抗体表达阳性.结论 成功分离培养出HAFMSCs,细胞具有干细胞特征,具有多向分化潜能.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的 优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行研究。方法 取新生新西兰大耳白兔骨髓5．0mL,采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化,观察细胞形态、超微结构和表面标志物的表达,从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。结果 经密度梯度离心、贴壁筛选并结合传代所得到的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强,生长旺盛;而第8、10代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞。结论 分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性．第3、5代细胞很纯且其增殖能力强,适用于做以后的研究。     

骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨大鼠骨髓间充质干细胞 ( rat mesenchymal stem cells,r MSCs)体外诱导分化成神经元的能力。方法 :用 0 .2 5、0 .5、1 .0 mmol· L-1IBMX诱导传代的 r MSCs,待细胞分化后进行形态学观察 ,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定。结果 :0 .5 mmol· L-1IBMX诱导细胞效果最好 ,2 d即可见有神经元样细胞出现 ,6d神经元样细胞占细胞总数的 ( 2 3.2± 2 .3) %,NSE染色阳性。未分化细胞表达 nestin,诱导 3d,阳性细胞增多 ,6d减少。结论 :体外 r MSC能扩增、传代 ,并被诱导分化成神经元样细胞     

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓基质细胞体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成年大鼠胫骨干骨髓基质细胞进行培养，保留附壁细胞传代，观察在培养液中添加诱导剂5－氮胞苷条件下骨髓基质细胞的生长和分化。结果 在形态上，大鼠骨基质细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5－氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后4周转化率接近30％。结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是自体心肌细胞一种良好的供体来源。     

体外培养3月龄和12月龄大鼠骨髓基质细胞增殖分化能力比较

目的 对比研究3月龄与12月龄大鼠骨髓基质细胞（rMSCs)增殖能力和成骨、成脂肪分化能力。方法 体外培养3月龄，12月龄大鼠骨髓基质细胞，用血球计数板描绘生长曲线比较增殖能力；培养液中分别加成骨，成脂肪诱导剂，在不同时间行细胞化学染色，观察两组细胞成骨与成脂肪能力的变化。结果 12月龄rMSCs第4代（P4）及第9代（P9）较3月龄rMSCs同代细胞生长数量均下降，12月龄rMSCsP9较P4生长数量下降，3月龄rMSCsP4、P9之间生长数量无显著差异。成骨诱导1周后，12月龄rMSCs对照与诱导组碱性磷酸酶（ALP）表达阳性率均低于3月龄rMSCs的同组，细胞，成骨诱导12天后，3月龄rMSCs先天12月龄rMSCs组有钙化形成。成脂肪诱导第二天12月龄rMSCs先于3月龄rMSCs有脂滴生成，结论 12月龄rMSCs生长能力和成骨能力较3月龄rMSCs降低，成脂肪能力较3月龄rMSCs增高。     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

体外培养3月龄和12月龄大鼠骨髓基质细胞增殖分化能力比较

目的　对比研究 3月龄与 12月龄大鼠骨髓基质细胞 (r MSCs)增殖能力和成骨、成脂肪分化能力。方法　体外培养 3月龄、12月龄大鼠骨髓基质细胞 ,用血球计数板描绘生长曲线比较增殖能力 ;培养液中分别加成骨、成脂肪诱导剂 ,在不同时间行细胞化学染色 ,观察两组细胞成骨与成脂肪能力的变化。结果　 12月龄r MSCs第 4代 (P4)及第 9代 (P9)较 3月龄 r MSCs同代细胞生长数量均下降。 12月龄 r MSCs P9较 P4生长数量下降。 3月龄 r MSCs P4、P9之间生长数量无显著差异。成骨诱导 1周后 ,12月龄 r MSCs对照与诱导组碱性磷酸酶(AL P)表达阳性率均低于 3月龄 r MSCs的同组细胞。成骨诱导 12天后 ,3月龄 r MSCs先于 12月龄 r MSCs组有钙化形成。成脂肪诱导第二天 12月龄 r MSCs先于 3月龄 r MSCs有脂滴生成。结论　 12月龄 r MSCs生长能力和成骨能力较 3月龄 r MSCs降低 ,成脂肪能力较 3月龄 r MSCs增高     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其向视网膜神经样细胞诱导分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外培养和扩增及其向视网膜神经细胞诱导分化的可能性。方法取SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养。培养视网膜神经细胞,收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液。将培养的rMSCs先经神经选择诱导后再换用条件分化液诱导,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的rMSCs生长较好并扩增迅速,经2种分化液诱导后可先分化为神经先祖细胞,继而分化为视网膜神经样细胞。分别应用nestin、NeuN、GFAP、Thy1.1行免疫荧光检测,细胞呈阳性反应。结论rMSCs能于体外培养存活和扩增,并且在一定条件下可被诱导分化为视网膜神经样细胞,体外自制分化条件及模拟眼内环境行骨髓间充质干细胞的诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

In vitro Culture of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats and Differentiation into Retinal Neural-like Cells

In order to study the in vitro culture and expansion of bone marrow mesenchymal stem cells in rats(rMSCs) and the possibility of rMSCs differentiation into retinal neural cells,the bone marrow-derived cells in SD rats were isolated and cultured in vitro.The retinal neural cells in SD rats were cultured and the supernatants were collected to prepare conditioned medium.The cultured rMSCs were induced to differentiate by two steps.Immunofluorescence method and anti-nestin,anti-NeuN,anti-GFAP and anti-Thy1.1 antibodies were used to identify the cells derived from the rMSCs.The results showed that the in vitro cultured rMSCs grew well and expanded quickly.After induction with two conditioned media,rMSCs was induced to differentiate into neural progenitor cells,then into retinal neural-like cells which were positive for nestin,NeuN,GFAP and Thy1.1 detected by fluorescence method.The findings suggested that rMSCs could be culture and expanded in vitro,and induced to differentiate into retinal neural-like cells.     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的　研究大鼠骨髓基质细胞 (r MSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法　使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松 (Dex) 10 - 8mol/ L、β-甘油磷酸钠 (β- GP) 10 mm ol/ L,抗坏血酸 (AA) 5 0 μg/ ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果　形态学观察表明 ,r MSCs贴壁细胞呈集落生长 ,有成纤维细胞样外观。利用 MTT法和流式细胞术 (FCM)测定增殖的结果表明 ,传代次数增加 ,r MSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖 ,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨 ,在诱导 3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示 ,非诱导条件下 MSCs的碱性磷酸酶 (AL P)水平会随传代而升高。传 3代 r MSCs的 AL P的表达较弱 ,诱导一周后 AL P的表达明显升高 ,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞 (OB)的 AL P表达。结论　本实验表明所培养的 r MSCs仍处于低分化水平 ,具有骨祖细胞的特性。     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的 研究大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法 使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松（Dex)10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠（β-GP）10mmol/L,抗坏血酸（AA）50μg/ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明,rMSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,利用MTT法和流式细胞术（FCM）测定增殖的结果表明,传代次数增加,rMSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨、在诱导3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示,非诱导条件下MSCs的碱性磷酸酶（ALP）水平会随传代而升高,传3代rMSCs的ALP的表达较弱,诱导一周后ALP的表达明显升高,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞（OB）的ALP表达。结论 本实验表明所培养的rMSCs仍处于低分化水平,具有骨祖细胞的特性。