蛋白涂层支架携带质粒介导的一氧化氮 合酶基因预防冠状动脉球囊扩张后 再狭窄的实验研究

目的　为评价蛋白涂层金属支架携带质粒介导的诱导性一氧化氮合酶 (iNOS)基因局部转染血管壁 ,预防冠状动脉内血管成形术后再狭窄的效果。方法　金属支架涂层为胶联明胶制成。载体为去内毒素纯化pcDNA3。采用标准球囊导管技术 ,将吸附有质粒介导的人肝脏的iNOS基因(pcDNA3hepiNOS)涂层支架置入小型猪 (n =9)冠状动脉前降支中段 ,以相同方法置入单纯蛋白涂层支架做为对照组 (n =9) ,支架与血管直径之比为 1.1～ 1.3:1。结果　在支架置入后 7d ,RT PCR检测和免疫组织化学染色 ,证实在pcDNA3hepiNOS转染的血管段有iNOSmRNA的表达和iNOS蛋白生成 ,而远离器官则无基因的表达。 3个月时冠状动脉造影显示 :转染pcDNA3hepiNOS组 (n =5 )无再狭窄发生 ,而对照组均发生显著的再狭窄。组织病理学形态分析结果显示 :pcDNA3hepiNOS组新生内膜面积 (1.7± 0 .8)mm2 、平均百分狭窄面积 (2 6 .5± 7.5 ) %、平均管腔狭窄百分数 (4 1.2± 16 .5 ) % ,均较对照组小 ,对照组分别为 (2 .8± 0 .8)mm2 ,P <0 .0 5 ;(94.2± 14.3) % ,P <0 .0 0 1;(88.0± 16 .6 ) % ,P <0 .0 0 1;比较内膜面积 /中膜面积比值 (I/M)治疗组较对照组减少了 5 9.8%。结论　在小型猪模型使用蛋白涂层支架携带纯化质粒介导的iNOS基因可直接导入血管     

人脂联素重组腺病毒对内皮细胞增殖和一氧化氮合酶的影响

目的探讨人脂联素重组腺病毒(Ad-apM1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和总一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和结构型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响,为动脉粥样硬化的基因治疗奠定基础。方法将Ad-apM1感染HUVEC,观察细胞形态,绘制生长曲线,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HUVEC的增殖。双抗体夹心ELISA法检测培养上清中人脂联素的表达水平,比色法检测总NOS、iNOS、eNOS活力。结果重组腺病毒感染后的HUVEC和未受感染的HUVEC形态无明显改变,体外增殖能力也无显著差异。用感染复数(MOI)为50的人脂联素基因重组腺病毒感染HUVEC,24、48、72h后取上清检测脂联素浓度分别为(125±12)ng/ml、(160±14)ng/ml、(150±8)ng/ml。感染了Ad-apM1的HUVEC总NOS和eNOS的活力显著升高,而iNOS的活力显著降低。结论我们制备的重组腺病毒能有效感染HUVEC并分泌表达人脂联素,对HUVEC的形态和增殖无明显影响,可增强HUVEC总NOS和eNOS活性,抑制iNOS活性,为Ad-apM1用于干预动脉粥样硬化奠定基础。     

内皮型一氧化氮合酶基因体内转染对大鼠颈总动脉损伤后血管狭窄程度的影响

目的 将内皮型一氧化氮合酶基因转染至球囊损伤后的大鼠颈总动脉中，观察其对血管狭窄程度的影响。方法 将大鼠分为正常对照组、空白对照组、pcDNA3．1（-）组和内皮型一氧化氮合酶组。除正常对照组外均行颈总动脉内膜球囊损伤术，术中采用脂质体栽体FuGENE6分别介导真核表达栽体pcDNA3．1-内皮型一氧化氮合酶和pcDNA3，1（-）转染至损伤后的内皮型一氧化氮合酶组和pcDNA3．1（-）组大鼠血管中。于术后2用处死大鼠，以逆转录-聚合酶链反应法检测转染后体外培养的血管平滑肌细胞中内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达。并于术后1月和2月处死大鼠，检测颈总动脉血管狭窄的程度。结果 2周后转染pcDNA3．1-内皮型一氧化氮合酶基因的血管平滑肌细胞中可以检测出内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达，1月和2月后转染pcDNA3．1-内皮型一氧化氮合酶基因的颈总动脉狭窄程度明显小于空白对照组和pcDNA3．1（-）组（P〈0．01）。结论 内皮型一氧化氮合酶基因体内转染可以在血管平滑肌细胞中成功表达，且可以明显改善球囊损伤后颈总动脉狭窄的程度。     

内皮型一氧化氮合酶基因转移预防移植血管狭窄

探讨内皮型一氧化氮合酶基因转移防治移植静脉血管桥再狭窄的可行性。构建带有内皮型一氧化氮合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒载体和腺病毒空载体。采用山羊自体颈静脉作血管桥 ,在体外转染带有内皮型一氧化氮合酶基因的腺病毒载体 (实验组 )和腺病毒空载体 (对照组 ) ,然后旁路移植法端—侧吻合到颈动脉上。术后 30天 ,通过免疫组织化学染色 ,测定静脉桥3H TDR的掺入量和静脉桥内膜厚度及管腔狭窄面积百分比 ,观察内皮型一氧化氮合酶基因在静脉桥中的功能表达和静脉桥新生内膜的增生情况。结果发现 ,与对照组相比 ,转染后30天 ,实验组静脉桥中外源性内皮型一氧化氮合酶仍有功能表达 ,静脉桥3H TDR掺入量明显减少 (P <0 .0 1) ;静脉桥平均内膜增生厚度和管腔狭窄面积百分比明显低于对照组 (P <0 .0 1)。结果提示 ,内皮型一氧化氮合酶基因转移可以有效抑制移植血管新生内膜的增生 ,对预防移植血管狭窄有一定的作用。     

改进的明胶蛋白涂层支架用于小型猪冠状动脉转染一氧化氮合酶基因的可行性研究

目的为了判定明胶蛋白涂层支架携带质粒介导的一氧化氮合酶(iNOS)基因转染小型猪冠状动脉的可行性.方法将自行构建的pcDNA3.1/iNOS(L24553)质粒以浸泡(15～60min)及涂抹(60min)的方法携带在明胶蛋白涂层支架(由上海微创公司提供)上,采用标准球囊导管技术置入小型猪(n=5)冠状动脉前降支及右冠近中段,支架与置入处血管直径之比1.1～1.31.结果支架置入术后7天,在支架置入处血管段使用对人特异性引物完成的逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)反应表明有iNOS基因转染,免疫组织化学检测表明有iNOS蛋白生成.结论明胶蛋白涂层支架携带质粒介导的iNOS基因可有效转染小型猪冠状动脉成形部位.     

腺病毒介导的人p27kip1基因转染对球囊损伤后兔颈动脉新生内膜增生的抑制作用

目的 研究腺病毒介导的p27kip1基因及其蛋白产物高表达对球囊损伤后兔颈动脉新生内膜增生的抑制作用。方法 建立兔颈动脉球囊损伤模型,将LacZ重组腺病毒（AdLacZ）和人p27kipl重组腺病毒（Adhp27kipl）在体内分别转染损伤动脉节段,以Western　blot、x-gal染色、HE染色、兔疫组化及计算机图像处理方法观察转染动脉节段中外源性p27kipl蛋白表达及其对新生内膜增生的影响。结果 与AdLacZ转染组及未转染组比较,Adhp27kip1转染的动脉节段内p27kip1蛋白呈高表达,表达高峰在7～14 d,持续4周以上;转染4周后未转染组、AdLacZ转染组及Adhp27kip1转染组的新生内膜面积分别为1.106mm2、0.988mm2及0.278mm2;管腔狭窄率分别为87.07％、65.40％及32.14％。结论 外源性p27kip1基因及其蛋白产物在损伤动脉节段内高表达可显著抑制新生内膜增生及管腔狭窄。     

人内皮型一氧化氮合酶重组腺病毒在小鼠肺内表达

一氧化氮合酶（NOS）是合成一氧化氮（NO）的关键酶，主要包括3个亚型：神经型（nNOS）、诱导型（iNOS）、内皮型（eNOS）。eNOS主要分布于血管内皮，通过催化NO的生成而在调节血管壁张力及维持血管壁构型方面发挥重要作用。各种引起内皮功能受损的原因均可使NOS生成减少，导致NO生成不足，破坏体内内皮素1／一氧化氮（ET-1／NO）的平衡。本研究从人脐静脉血管内皮成功克隆出人eNOS（heNOS）eDNA全长基因的基础上，构建了复制能力缺陷型heNOS重组腺病毒转移载体，并对其功能和转移途径进行初步研究，旨在探讨从基因角度补充NOS以维持体内ET-1／NO平衡，治疗因NO不足而导致的血管损伤性疾病的可能性。     

重组一氧化氮合酶基因在心血管系统的转染和表达

一氧化氮 (NO)功能异常在许多心血管系统疾病的发病中起重要作用 ,用转基因方法转移重组一氧化氮合酶(NOS)基因 ,重建内源性 NO功能 ,是心血管系统治疗的新策略 ,本文就重组 NOS转基因在心血管系统的研究进展作一综述。     

银杏叶提取物对培养的人脐静脉内皮细胞结构型一氧化氮合酶的影响

目的 :观察银杏叶提取物 （EGB）对培养的人脐静脉内皮细胞结构型一氧化氮合酶 （ec NOS）活性的影响 ,并探讨 EGB防治 PTCA后再狭窄的意义。方法 :分别用 10 ,5 0 ,10 0 g· L- 1的 EGB作用于体外培养人脐静脉内皮细胞（HU VEC） ,行 ABC免疫酶染色 ,图像分析法观察 EGB对 NOS表达的影响。结果 :与对照组比较 ,各实验组 ec-NOS表达增强 （P<0 .0 5 ）。结论 :EGB增强了培养的内皮细胞的 c NOS表达。     

苯妥英钠对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响

目的研究苯妥英钠促进创伤修复的特殊药理学作用在大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜修复过程中的影响。方法采用大鼠颈总动脉内膜球囊损伤模型,术后大鼠分为苯妥英钠组和损伤组。术后28天处死大鼠,取双侧颈总动脉,石蜡包埋、切片后进行血管病理学染色分析。结果术后28天,苯妥英钠组内膜面积(0.154±0.018mm2比0.204±0.054mm2,P<0.01)、内膜/中膜面积比(1.70±0.08比2.26±0.46,P<0.01)、再狭窄率(59.5%±3.2%比75.9%±13.3%,P<0.01)均小于损伤组,管腔面积(0.106±0.024mm2比0.063±0.034mm2,P<0.01)大于损伤组;内膜细胞密度(72.18±20.08/cm2比84.85±10.77/cm2,P<0.05)、增殖细胞核抗原阳性细胞数(9.89±7.63个/200倍视野比23.03±13.95个/200倍视野,P<0.01)和α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞数(30.91±20.05/200倍视野比61.81±16.57个/200倍视野,P<0.01)均小于损伤组;新生内膜中有少量胶原组织增生,但组间血管胶原面积和密度均无统计学差异(P>0.05)。结论大鼠颈总动脉球囊损伤后28天,苯妥英钠可以抑制损伤血管内膜增生过程中的细胞增生,促进细胞外基质合成,对血管损伤后内膜增生和管腔狭窄具有抑制作用。     

Inactivity of nitric oxide synthase gene in the atherosclerotic human carotid artery

Objective Nitric oxide (NO) inhibits thrombus formation, vascular contraction, and smooth muscle cell proliferation. We investigated whether NO release is enhanced after endothelial NO synthase (eNOS) gene transfer in atherosclerotic human carotid artery ex vivo. Methods and Results Western blotting and immunohistochemistry revealed that transduction enhanced eNOS expression; however, neither nitrite production nor NO release measured by porphyrinic microsensor was altered. In contrast, transduction enhanced NO production in non-atherosclerotic rat aorta and human internal mammary artery. In transduced carotid artery, calcium-dependent eNOS activity was minimal and did not differ from control conditions. Vascular tetrahydrobiopterin concentrations did not differ between the experimental groups.Treatment of transduced carotid artery with FAD, FMN, NADPH, L-arginine, and either sepiapterin or tetrahydrobiopterin did not alter NO release. Superoxide formation was similar in transduced carotid artery and control. Treatment of transduced carotid artery with superoxide dismutase (SOD), PEG-SOD, PEG-catalase did not affect NO release. Conclusions eNOS transduction in atherosclerotic human carotid artery results in high expression without any measurable activity of the recombinant protein. The defect in the atherosclerotic vessels is neither caused by cofactor deficiency nor enhanced NO breakdown. Since angioplasty is performed in atherosclerotic arteries,eNOS gene therapy is unlikely to provide clinical benefit.     

大鼠主动脉球囊拉伤后一氧化氮合酶表达的变化

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阿托伐他汀对冠心病患者血清一氧化氮及一氧化氮合酶含量的影响

目的　观察阿托伐他汀对冠心病患者血清一氧化氮 (NO)及一氧化氮合酶 (NOS)含量水平的影响。方法　对用阿托伐他汀治疗的 79例冠心病患者依据是否合并高胆固醇血症分为两组 ,对其治疗前后血清 NO及 NOS含量水平进行对比分析。结果　不论是否合并高胆固醇血症的冠心病 ,阿托伐他汀均可升高其血清 NO及 NOS水平。结论　阿托伐他汀可通过调脂治疗抑制脂质的过氧化反应 ,保护血管内皮功能 ,但其保护内皮功能的作用不受患者是否存在高脂血症的影响 ,改善内皮功能 ,对冠心病的防治具有重要意义。     

内皮细胞型一氧化氮合酶基因多态性与糖尿病肾病的相关性研究

目的：探讨内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS)基因第7外显子894G→T点突变,及其第4内含子的1个27bp的插入／缺失（a/b)多态性,与2型糖尿病肾病（DN）之间的关系。方法：894G→T点突变采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）技术,27bp的a/b多态性采用聚合酶链反应结合4％琼脂糖凝胶电泳分离技术。比较各组间的等位基因频率与基因型频率。结果：（1）早期糖尿病肾病组（DN^ 组）T等位基因及TG基因型频率显著高于糖尿病非肾病患者（DN^-组,P＜0．05）。（2）DN^ 组a等位基因及ab基因型频率显著高于DN^-组（P＜0．05）。（3）DN^ 组的TGab基因型频率亦显著高于DN^-组（P＜0．05）。（4）糖基化血红蛋白（GHbA1c),收缩压（SBP）,总胆固醇（TC）,eNOS基因第7外显子894G→T基因点突变及第4内含子a/b多态性均属糖尿病肾病的独立危险因素。结论：糖尿病患者eNOS基因第7外显子T等位基因及第4内含子a等位基因与DN^ 的发生密切相关,两种等位基因同时存在者,DN^ 发病风险更高。     

冠心病与血管紧张素转换酶和内皮型一氧化氮合酶基因多态性及交互作用的临床研究

目的联合对冠心病患者血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因G894T多态性进行分析,探讨基因多态性与冠心病的关系和交互作用及遗传学机制在冠心病发病及预后中的临床意义。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）分析技术检测236例冠心病患者及190例正常人ACE和eNOS两种基因多态性。同时测定血脂、血糖、体重指数（BMI）、左室射血分数（LVEF）和血压。结果冠心病组ACE基因DD型频率[36％（86／236）]显著高于对照组[19％（36／190）,P〈0．01],Ⅱ型频率[27％（64／236）]显著低于对照组[49％（93／190）,P〈0．05]。冠心病组DD型甘油三酯（TG）[（2．2±1．7）mmol／L]显著高于Ⅱ型TG[（1．6±0．8）mmol／L和ID型TG[（1．7±0．9）mmol／L,均P〈0．05],DD型高密度脂蛋白胆固醇[HDL—C（1．2±0．4）mmol／L]显著低于Ⅱ型HDL—C[（1．3±0．3）mmol／L,P〈0．05],DD型血糖[（6．2±1．7）mmol／L]和BMI[（25．7±2．8）kg／m^2]显著高于ID型[血糖：（5．6±1．3）mmol／L,BMI：（24．8±3．1）kg／m^2。,P〈0．05],DD型LVEF（56％±14％）显著低于Ⅱ型LVEF（62％±15％）和ID型LVEF（61％±14％）,均P〈0．05。收缩压、舒张压、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL—C）、糖尿病组与非糖尿病组、急性冠状动脉综合征组与非急性冠状动脉综合征组、单支病变组与多支病变组在ACE和eNOS基因不同基因型之间差异均无统计学意义。冠心病组eNOS基因GT型频率[28％（67／236）]显著高于对照组[17％（32／190）,P〈0．01],GG型频率与对照组比较,差异无统计学意义。TG、HDL—C、血糖、BMI和LVEF在eNOS基因不同基因型之间差异均无统计学意义（均P〉0．05）。携带DD型患冠心病的概率是携带Ⅱ型的1．74倍（P〈0．01）,携带GT型患冠心病的概率是携带GG型的1．73倍（P〈0．05）。两种基因对患冠心病的交互作用显示为如同时携带Ⅱ型和GG型,患冠心病的概率是37．9％,而同时携带DD型和GT型患冠心病的概率是77．8％。结论ACE基因多态性和eNOS基因多态性与冠心病及某些危险因素显著相关,同时携带DD型和GT型两种易患基因型时,患冠心病的概率明显增加,具有显著的遗传倾向。     

氟对大鼠脑组织中一氧化氮合成酶活性的影响

目的为研究氟对神经系统的作用机理。方法利用化学发光分析技术测定大鼠脑组织中的一氧化氮合成酶的活性。结果氟暴露大鼠脑组织中ＮＯＳ活性明显高于对照组，直接在ＮＯＳ反应液中加入氟化钠，ＮＯＳ活性亦增加，而且这种增强作用能被一氧化氮合成酶的抑制剂Ｌ－硝基精氨酸所阻断。结论无论在体内还是体外，氟能使一氧化氮合成酶的活性增高。     

大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响

目的　探讨腺病毒载体介导的大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法　应用带有绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体将大鼠AT2R基因转移至颈动脉球囊损伤模型中,2 1d后取材,应用免疫组织化学方法检测AT2R在动脉壁中的表达,图像分析观察其对新生内膜形成的影响。结果　在体大鼠颈动脉腺病毒载体的转染率达4 0 % ,AT2R基因在血管壁的新生内膜、中膜、外膜稳定表达,转染AT2R基因的球囊损伤后颈动脉与绿色荧光蛋白基因对照组相比,血管新生内膜 中膜面积比降低了4 8%。结论　AT2R基因转染可抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成,对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用。     

反义血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ_B基因转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响

目的　探讨腺病毒载体介导的大鼠反义血管紧张素Ⅱ受体ⅠB(AT1B)RNA转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法　利用重组腺病毒载体将大鼠反义AT1B RNA转移至大鼠颈动脉球囊损伤模型中 ,2 1天后观察其对新生内膜形成的影响。结果　用腺病毒载体转导大鼠反义AT1BRNA至大鼠球囊损伤的颈动脉 ,与对照组相比 ,2 1天后损伤血管新生内膜 /中层面积比降低了 4 7%(P <0 0 0 1)。结论　反义AT1BRNA对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用。     

基因芯片技术分析内皮型一氧化氮合酶基因多态性与冠心病的关系

目的探讨内皮型一氧化氮合酶（eNOS）Glu298Asp基冈多态性与冠心病的关系。方法以89例冠心病患者为病例组（男性62例,女性27例）,均行冠状动脉造影确诊,对照组78例（男性44例,女性34例）均行冠状动脉造影排除冠心病,运用基因芯片技术方法检测eNOS Glu298 Asp基因的多态性,对比分析冠心病组及对照组eNOS Glu298 Asp基因型及等位基因的差异。结果eNOS Glu298 Asp基因型分布冠心病组与对照组比较差异无统计学意义（P=0．495）,D等位基因频率冠心病组（10．11％）与对照组（10．27％）相比差异无统计学意义（P=0．965）。结论eNOS Glu298 Asp基因变异与冠心病的发病可能无相关性。     

沙利度胺对大鼠颈动脉损伤后新生内膜形成的影响

目的：观察沙利度胺局部给药对大鼠颈动脉损伤后新生内膜形成和血管再狭窄的影响,并探讨其可能机制。方法：48只SD大鼠随机分成假手术组（A组）、单纯手术组（B组）和沙利度胺组（C组）,A组仅分离和结扎右颈外动脉,B组和C组行右颈总动脉血管成形术,C组在损伤血管局部给予沙利度胺。在术后7d和14d分别测定血清中血管内皮生长因子（VEGF）和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平、观察血管内膜损伤后形态学变化、用免疫组织化学法观察组织VEGF和巨噬细胞表达水平。结果：在血管损伤后14d,B组VEGF和TNF-α水平明显高于A组和C组（P〈0．01）,B组管腔面积明显缩小（P〈0．01）,而新生内膜面积明显增加（P〈0．01）,同时B组血管内膜VEGF和巨噬细胞的表达亦较A组和B组增加（P〈0．01）。结论：沙利度胺局部给药可抑制血管损伤后新生内膜形成和血管再狭窄的发生。