EB病毒潜伏膜蛋白对鼻咽上皮细胞生物学表型的影响

EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种全球性分布、人群感染率颇高的具有致瘤潜能的DNA疱疹病毒,90％以上的人群建立了EBV终生潜伏状态感染。目前的研究发现其致瘤谱越来越广,除与传染性单核细胞增多症相关外,还与某些恶性淋巴瘤（Burkitt淋巴瘤,霍奇金病,某些T、B细胞源性非霍奇金淋巴瘤如血管中心性淋巴瘤、间变性大细胞性淋巴瘤、Lennert淋巴瘤、器官移植后及免疫缺陷者淋巴瘤等）、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、喉癌、宫颈癌等恶性肿瘤相关。     

TGF-β1参与调控LMP1介导信号转导通路的研究

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和EB病毒(EBV)潜伏期膜蛋白1(LMP1)在EBV相关胃癌发生中的作用及其机制。方法设计合成靶向LMP1的siRNA649转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,并与TGF-β1联合作用,RT-PCR检测LMP1沉默和TGF-β1作用对LMP1介导的信号转导通路相关因子转录表达的影响。结果与细胞对照和脂质体对照比较,siRNA649、siRNA649+TGF-β1分别作用GT38细胞系后,基质金属蛋白酶9(MMP9)、生存素(Survivin)和细胞黏附分子1(ICAM-1)表达降低,而细胞周期依赖性激酶4(CDK4)表达升高,差异均有显著性(F=10.48～26.23,P<0.05);siRNA649+TGF-β1联合作用后表皮生长因子受体(EGFR)表达水平显著高于对照组(F=9.47,P<0.05),而siRNA649组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。TGF-β1作用EBV阳性细胞系(GT38和SNU719)和EBV阴性细胞系(SGC7901和HGC-27),与对照组相比GT38细胞中ICAM-1表达显著降低,差异有显著性(F=30.36,P<0.05),其他细胞中ICAM-1的表达差异无显著性(P>0.05);4种细胞系TGF-β1作用前后MMP9、Survivin、CDK4和EGFRmRNA转录表达差异均无显著意义(P>0.05)。结论 LMP1可以调控MMP9、Survivin和CDK4表达,LMP1与TGF-β1相互作用可调控ICAM-1和EGFR的转录表达。     

EB病毒潜伏性膜蛋白1转化NP69细胞的蛋白表达分析

目的探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1（LMP1）转化鼻咽上皮细胞NP69的表达蛋白。方法采用比较蛋白质组学方法,鉴定NP69-pLNSX与NP69-LMP1细胞系中的差异表达蛋白,分析LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白。结果鉴定了LMP1在NP69细胞中参与调节有22个蛋白（表达上调的蛋白9个,下调的13个）。结论LMP1在NP69细胞中可能通过调节Vimentin和Keratin 19等蛋白的表达而起转化作用。     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响

目的 探讨化学合成小干涉RNA(siRNA)对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性胃上皮(GT38)细胞LMP1编码基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖和凋亡的影响.方法 化学合成靶向LMP1 mRNA不同位点的3对siRNA,分别转染GT38细胞,选择干扰效果最佳的siRNA进行实验研究,行RT-PCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析.结果 RT-PCR结果显示,3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达,以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果最强.Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡.流式细胞分析显示,siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA649的靶细胞Bcl-2的表达水平降低.结论 靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达,进而可能通过抑制Bcl-2的表达诱导靶细胞凋亡.GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞.     

EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒(EBV)LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽.方法 利用亲和层析柱加酶切的方法 纯化CTAR23蛋白,并用其筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力.通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果.ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果 显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS.结论 噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础.     

应用RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰,在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中,选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,并了解LMP1抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法,将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞,通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90%以上。LMP1基因抑制后,C611细胞增殖速度下降33%;流式细胞检测显示,C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论本研究证明,全新的人工诱导RNA干扰技术,能够有效抑制LMP1基因的表达,并降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。     

应用PNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的 探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰，在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中，选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达，并了解LMPl抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法，将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞，通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后，鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90％以上。LMP1基因抑制后，C611细胞增殖速度下降33％；流式细胞检测显示，C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论 本研究证明，全新的人工诱导．RNA干扰技术，能够有效抑制LMP1基因的表达，并降低鼻咽癌细胞的增殖能力。为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

抑制泛素羧基末端水解酶L1对小鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨泛素羧基末端水解酶L1在小鼠心肌纤维化发生发展中可能的分子机制.方法 雄性小鼠(每组6只)皮下植入缓释泵持续灌注血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ),并给小鼠腹腔注射UCHL1特异性抑制剂LDN57444.14 d后检测小鼠心脏功能变化,天狼猩红染色方法检测小鼠心肌纤维化程度.分离纯化小鼠心肌成纤维细胞,随机分为3组:...     

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1启动子的突变

 【目的】 检测EB病毒潜伏膜蛋白1 (LMP1) 远端启动子L1-TR在鼻咽癌(NPC)组织中的突变情况并探讨突变对启动子活性的影响。【方法】 用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增出B95.8细胞和新鲜鼻咽癌组织细胞中EB病毒(EBV)的L1-TR片段,并测序比较其核苷酸序列的差异。构建含原型和突变型L1-TR启动子的荧光素酶报告质粒并分别转染HaCat细胞、B95.8细胞和C666-1细胞,比较两种启动子的活性。【结果】 和B95.8原型比较,鼻咽癌组织中的EB病毒L1-TR启动子区域有多处缺失。插入和点突变,且启动子活性明显降低(P < 0.05)。【结论】 鼻咽癌组织中LMP1启动子 L1-TR的活性与B95.8原型相比明显降低,这在EB病毒的免疫逃避机制中可能有一定的意义。     

EB病毒LMP1基因和蛋白在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达及与预后的关系

目的从蛋白和DNA两个水平初步检测成都地区结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中LMP1的表达,并探讨与预后的关系。方法应用免疫组化和PCR技术检测67例结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤LMPl的表达,并应用Kaplan—Meier曲线分别比较LMP1蛋白和LMP1DNA阳性表达组与阴性表达组的生存率。结果LMP1蛋白阳性表达10例(14．93％),LMP1DNA阳性表达56例(83．58％),LMP1总检出率83．58％。LMP1蛋白(P=0．678)和LMP1DNA(P=0．943)表达均与预后无明显关系。结论LMP1与成都地区结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤关系密切;结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中LMP1蛋白水平和DNA水平表达不一致;LMP1的表达与预后无明显关系。     

埃泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白2A特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导研究

目的：利用含埃泼斯坦-巴尔病毒(Epstein—Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒(rVV—LMP2A)感染的人树突状细胞(DC)体外诱导EBV—LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法：rVV—LMP2A感染的DC分别在培养第1、8天刺激相同MHC背景的人外周血单个核细胞(PBMC)，在IL-2作用下体外诱导EBV特异性CTL。培养第15天乳酸脱氢酶法检测CTL的特异性杀伤活性。结果：诱导的CTL对rVV—LMP2A感染的靶细胞在效靶比为5：1、10：1和15：1时，特异性杀伤率分别为63．5％、65．5％和67．9％。结论：rVV—LMP2A感染的DC刺激相同MHC背景的PBMC可诱导出较高杀伤活性的EBV特异性CTL。     

EB病毒潜伏膜蛋白1的研究进展

EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)是EB病毒编码的一种主要蛋白,它能通过其C末端的3个功能结构域CTAR1、CTAR2及CTAR3启动一系列信号途径,包括核因子κB、PI3K-Akt/PAB、MAPK及JAKs/STATs,从而调节其宿主细胞的生长、增殖、分化、凋亡等多种细胞生物学功能,本文就这方面的研究进展及其自身调节的机制综述如下。     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。     

Recombinant Vaccinia Virus is an Effective and Non—perturbing Vector for Human Dendritic Cells Transfected with Epstein—Barr Virus Latent Membrane Protein 2A

Objective To study the effects of dendritic cells(DC) transfected with recombinant vaccinia virus encoding Epstein-Barr virus(EBV) latent membrane protein 2A(LMP2A) gene,and to provide evidence for further investigation on the therapeutic uaccines against EBV-associated malignancies.Methods Mature DC were transfected with EVB-LMP2A recombinant vaccinia virus(rVV-LMP2A).Before and after the transfection,the expression of surface antigens on mature DC including CD1a,CD83,CD40,CD80,HLA-DR was measured by fluorescence activated cell sorter(FACS) and the function of DC to stimulate allogeneic T cells proliferation was measured by mixed leukocyte reactions(MLR).Results LMP2A protein was highly expressed (66.1%) in DC after the transfection of rVV-LMP2A.No significant changes in the primary surface antigens expression and in the MLR were detected during the transfection.Transfected DC still had strong potential in stimulating the proliferation of allogeneic T cells.Conclusion Recombinant vaccinia virus was an effective and non-perturbing vector to mediate the transfection of LMP2A into DC.The functions of mature DC were not affected significantly by the transfection of Vac-LMP2A.This study could provide evidence for the further immunotherapy of EBV-associated malignancies,e.g.nasopharyngeal carcinoma(NPC).     

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的：探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对DC的表型和功能的影响，以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性，方法：用EBV－LMP2A基因重组痘苗病毒（Vac-LMP2A)转染成熟的DC，流式细胞术（FACS）检测转染前后DC表面分子CD1a,CD83,CD40,CD80,HLA-DR变化，3H－TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果：转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达，Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响，转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体TI林巴细胞增殖的能力。结论：痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体，Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响，是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。     

原发性鼻腔非霍奇金淋巴瘤缺失型潜伏膜蛋白1表达及其与预后的关系

目的比较原发性鼻腔非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphomas,NHL)和慢性鼻-鼻窦炎中Epstein-Bar(EB)病毒缺失型潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因的表达,探讨原发性鼻腔非霍奇金淋巴瘤LMP1缺失型与预后的关系。方法采用免疫组织化学方法检测55例原发性鼻腔NHL和25例慢性鼻-鼻窦炎LMP1,采用聚合酶链式反应(polymersechain reaction,PCR)检测LMP1基因,结合随访资料分析LMP1缺失型鼻腔NHL与预后的关系。结果鼻腔NHL中免疫组化LMP1蛋白阳性率为29/55(53%),LMP1基因阳性率为33/55(60%),其中缺失型LMP1基因者26/33(78.8%);慢性鼻-鼻窦炎中LMP1基因阳性率为14/25(56%),其中缺失型LMP1基因者5/14(35.7%)。鼻腔NHL患者和慢性鼻—鼻窦炎患者缺失型LMP1基因的表达差异有统计学意义(P<0.05)。LMP1基因阳性的鼻腔NHL患者5年总生存率为52.4%,其中LMP1缺失型和LMP1野生型鼻腔NHL的5年生存率分别为36.0%和85.7%,二者生存曲线差异有统计学意义,P值为0.04(log-rank检验)。结论提示缺失型LMP1在原发性鼻腔NHL的发病和病情进展中可能起重要作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

[目的]探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为.[方法]将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclinD1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况.[结果]Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclinD1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达.流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G2/M期进展.MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加.[结论]HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclinD1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关.