p14ARF基因通过p53途径对肝癌细胞的生长的影响

目的　探讨 p14 ARF对含有野生型 p5 3(wtp5 3)的肝癌细胞生长的影响及其作用机制。方法　将含p14 ARF的基因转染到人肝癌细胞HepG2中 ,通过流式细胞仪及生长曲线观察其对HepG2细胞周期及细胞生长的影响。利用Western Blotting方法及 p2 1waf1启动子荧光素酶活性检测p14 ARF对HepG2细胞 p5 3蛋白表达的影响。 结果　转染p14 ARF基因的HepG2细胞的生长速度从第 3天开始较空载体 pcDNA 3组减慢 ,处在G0 G1期细胞数 ( 70 .6 6 % )与空载体组 ( 6 1.5 5 % )相比明显增加 ,转染 pcDNA3p14 ARF( 1.0 92 3± 0 .0 370 ) p2 1waf1启动子荧光素酶活性较空载体组( 0 .76 73± 0 .0 180 )明显升高 ( P <0 .0 5 )。Westernblotting结果表明 ,p5 3表达也明显增加。 结论p14 ARF基因通过上调HepG2细胞的 p5 3表达导致 p2 1waf1的表达升高使细胞阻滞于G0 G1期 ,从而抑制细胞的生长。     

原发性肝癌p14ARF基因CpG岛甲基化研究

目的探讨p14ARF基因启动子区CpG岛甲基化与原发性肝细胞肝癌发生、发展的关系。方法采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测42例原发性肝癌组织及癌旁组织中p14ARFmRNA的表达,同时用甲基化特异PCR（methylation-specific PCR,MSP）方法分析p14ARF基因启动子区域甲基化状况。结果42例肝癌组织有7例呈p14 mRNA的表达,表达率17%。癌旁正常组织均有p14表达。p14mRNA在原发性肝癌组织中明显表达缺失（χ^2=56.62,P〈0.05）;42例原发性肝癌组织中,有19例检测到p14基因启动子的甲基化,甲基化发生率45%。相应癌旁组织未发现甲基化。p14ARF基因在原发性肝癌呈现明显高甲基化（χ^2=22.04,P〈0.05）。在p14mRNA表达的7例肝癌组织中没有检测到p14基因启动子的甲基化,而在p14mRNA表达缺失的35例肝癌组织中。19例p14基因启动子呈现甲基化。肝癌组织中p14ARF基因启动子甲基化与p14mRNA表达缺失明显相关（χ^2=4.66,P〈0.05）。结论在原发性肝癌p14 mRNA明显表达缺失,原发性肝癌p14ARF基因启动子频繁甲基化可能是p14ARF失活的原因之一。     

胰腺癌PC-3细胞株外源性p14ARF抑癌基因表达与内源性p53表达水平的关系

目的　探讨外源性 p1 4ARF基因表达于胰腺癌PC 3细胞后与另一重要细胞周期调控蛋白 p53表达水平的相互关系。 方法　将含人 p1 4ARFcDNA的重组质粒通过脂质体介导转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,并筛选出阳性克隆 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblot法检测PC 3细胞转染前后p1 4ARF的mRNA及蛋白的表达 ,同时用Westernblot分析其内源性 p53蛋白表达水平的变化。噻唑蓝 (MTT)比色法测定PC 3细胞在转染前、后的生长曲线变化。结果　胰腺癌PC 3细胞中p1 4ARF基因缺失。外源性 p1 4ARF基因成功转染入PC 3细胞并获得 1 4× 1 0 3大小的p1 4蛋白表达 ,且内源性 p53蛋白表达水平在转染后明显增高。PC 3细胞在导入 p1 4ARF基因后第 1天及第 5天的生长抑制率分别为 2 2 %及 2 6 % ,两者差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论　p1 4ARF基因可上调胰腺癌PC 3细胞的内源性p53蛋白表达水平 ,从而发挥其细胞周期阻滞功能。     

p27在恶性肿瘤中的表达

完整的细胞周期包括间期和有丝分裂期（M期），间期包括G0、G1、S和G2期，细胞周期的调控在各个间期中以G1期最为重要，许多细胞内外的增殖调控物质主要作用于此。细胞周期得以运行的机制在于一系列细胞周期蛋白（cyclin）时相起伏的调控，相应的周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）依次激活，驱动细胞由G0、G1、S、G2期到M期。细胞周期是在cyclin-CDK-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKI）组成的立体调控网络精密控制下进行的。在生物体内，癌基因和抑癌基因功能相互协调，调控着细胞增殖、分化、凋亡等生命过程。     

p14ARF上调p53基因可增强5-FU对胰腺癌的治疗作用

我们的研究将p14ARF导入p53缺失的PC-3细胞后，探讨转染后的PC-3细胞对5-FU敏感性的增强作用。     

Cyclin G在胃癌组织中对p53-鼠双微基因2的负反馈调节作用

目的 探讨Cyelin G在胃癌组织中对p53-鼠双微基因2（Mdm2）负反馈调节循环中的作用及可能的相互关系。方法 应用免疫组织化学SP法检测48例胃癌及相应癌旁组织Cyclin G、Mdm2和p53的表达情况。结果 Cyclin G高表达于胃癌细胞核。Cyelin G，Mdm2和p53阳性率分别为64．6％、47．9％、29．1％，显著高于相应的癌旁组织（P〈0．05），Cydin G与Mdm2呈高相关性（Kappa=0．506），与p53呈低相关性（Kappa=-0．364），并且和胃癌组织学分类和Borrmann分型无关（P〉0．05）。结论 胃癌组织中Cyclin G、Mdm2和p53的异常表达可能与胃癌的发生与发展有关。Cyclin G通过Mdm2调节p53及其通路，可以作为胃癌基因治疗的靶点。     

p53/p21通路与细胞周期阻滞在急性肾损伤中的研究进展

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是住院患者最常见的急危重症之一,可导致肾功能急剧下降。DNA损伤存在于AKI早期,细胞对DNA损伤的主要反应之一是细胞周期阻滞,其中肿瘤蛋白p53在此过程中发挥重要作用。本文旨在综述AKI过程中细胞周期阻滞和p53/p21信号通路的作用,明确细胞周期阻滞的内在保护作用以及进一步了解p53/p21信号通路和细胞周期阻滞的机制和功能,将有助于制定治疗AKI的策略。     

p53对HepG2细胞AMPKβ1基因表达的影响

目的研究p53对HepG2细胞AMPKβ1基因表达的影响,探讨p53通路对细胞生长的调控机制。方法体外培养HepG2细胞,利用依托泊苷（VP-16）对细胞DNA损伤作用引起细胞内p53蛋白的变化,以未处理细胞作对照。采用WesternBlot定量检测细胞内p53蛋白量和半定量RT-PCR检测AMPKβ1 mRNA相对表达量。结果在VP-16处理6h、12h、24h后,细胞内p53蛋白水平显著高于对照组（P〈0．05）,同时AMPKβ1mRNA相对表达量亦显著高于对照组（P〈0．05）。结论细胞内p53蛋白的升高与AMPKβ1mRNA的表达增强呈现一致,AMPKβ1可能是抑癌基因p53影响细胞生长的下游调控基因。     

腺病毒介导p53基因联合肿瘤坏死因子对H22腹水瘤的协同作用

目的评价p53腺病毒注射液（AD-p53）与肿瘤坏死因子（TNF）联合腹腔给药对H22腹水瘤模型的协同抑制作用。方法建立H22腹水瘤的昆明小鼠模型，48h后以AD-p53、TNF、生理盐水等腹腔注射，治疗周期为1周，治疗后测量腹围、体重，计量腹水，计数瘤细胞数，以流式细胞分析检测瘤细胞凋亡、死亡比例及细胞周期。结果AD-p53腹腔给药1周，出现瘤细胞G0／G1期阻滞；其和TNF联用后，未生成腹水的小鼠增多；在生成腹水的小鼠，腹水量和瘤细胞数均较单用时明显减少。结论AD-p53可阻滞瘤细胞周期，抑制增殖，联合TNF腹腔给药，在抑制腹水瘤时具有协同作用。     

5-氮-2-脱氧胞苷调控p53-baX凋亡通路DNA甲基化对胆管癌细胞生长的影响

目的 探讨甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(DAC或5-aza-dc)对胆管癌细胞QBC939生长的影响及其机制.方法 应用噻唑蓝(MTT)比色法检测DAC在不同浓度(0.1、0.5、1.0、5.0、25.0、100.0μmol/L)及不同时间(24、48、72 h)下对胆管癌细胞QBC939存活率的影响,透射电镜观察细胞形态学改变,流式细胞仪观察细胞生长周期及凋亡率的变化;甲基化聚合酶链反应检测DAC作用前后p53-bax凋亡通路DNA甲基化变化.结果 DAC对QBC939细胞生长的抑制有浓度和时间依赖性,其半数抑制率(IC50)为72h 5μmol/L;经DAC作用后电镜下胆管癌细胞凋亡增加;胆管癌细胞凋亡发生率由DAC处理前的4.31%上升至处理后的43.04%;DAC作用前p53-bax凋亡通路中p14、DAPK抑癌基因甲基化,DAC作用后p14、DAPK抑癌基因脱甲基化.结论 DAC对胆管癌QBC939细胞的生长具有抑制作用,这一抑制作用是由于DAC脱甲基化造成的,DAC对胆管癌QBC939细胞p53-bax线粒体凋亡通路DNA甲基化的影响使细胞凋亡功能得以恢复.     

外源野生型p53基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长的作用

目的观察外源野生型p53(wtp53)基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长的抑制作用。方法用脂质体介导的转染技术,将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入GBC—SD细胞。用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)证实外源p53基因的整合与表达;用细胞计数和克隆形成实验反映细胞增殖状况;用流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果转化细胞系中存在外源p53基因的整合与表达。稳定转染wtp53基因的GBC-SD-wtp53细胞,体外生长速率明显减慢;克隆形成率仅为3．2％,显著低于对照组GBC-SD-mutp53(28％)和亲本GBC-SD细胞 (29％,P<0．01);G0／G1期、S期、G2／M期比例(％)分别为(66．12±4．2、32．87±2．15、1．01± 0．37),与对照组(46．20±5．1、30．78±2．92、23．02±1．87)及亲本细胞(41．25±3．2、40．03±2．09、 18．72±1．05)相比,G0／G1期细胞比例明显增加,G2／M期细胞比例显著减少(P<0．01)。结论外源野生型p53基因的表达能有效抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体外生长。     

肝缺血再灌注细胞凋亡现象及Fas蛋白、PCNA 、p53、bcl-2 mRNA表达

目的：探讨肝缺血再灌注肝细胞凋亡发生的时空分布、基因表达特点及意义。方法：在观察SD大鼠（n=40）肝缺血0,30,45,60min再灌注3,6,24h存活率及病理形态基础上,重点观察大鼠（n=100)全肝血流阻断30min再灌注0,0.5,1,3,6,12,24,48,72,96h凋亡细胞分布（原位末端标记术,TUNEL）,G0-G1期细胞、凋亡细胞、增殖细胞指数分布（流式细胞术）,肝细胞显微及超微结构（光镜、电镜技术）,Fas蛋白、PCNA蛋白（免疫组化）及p53、bcl-2基因mRNA表达（原位杂交）。结果：缺血30min组多见细胞凋亡,细胞应答反应主要为三期：①急性期：再灌注0.5h Fas蛋白首先在血管周围高表达;②亚急期（3-24h):TUNEL阳性细胞在血管周围高分布,并向周围扩展;病理形态可见严重变性、细胞皱缩、细胞增殖三种变化;G1期细胞数大量减少,凋亡峰逐渐升高,12h后出现增殖峰,相关基因表达增强;③恢复早期（24-96h)：G1期细胞指数回升,凋亡峰和增殖峰持续并缓慢下降;相关基因表达陆续减弱。结论：肝缺血30min再灌注期机体可能通过下述基因调控途径影响细胞损伤应答反应：①Fas死亡基因与bcl-2存活基因的双重调控;②细胞凋亡与增殖双重调控;③经p53基因实现的细胞周期调控。     

肝门部胆管癌中乙肝、丙肝病毒感染与p53异常表达的关系及意义

目的 探讨乙肝病毒，丙肝病毒感染在肝门部胆管癌发病中的作用及与p53异常表达的关系。方法 采用免疫组织化学方法对68例石蜡包埋肝门部胆管癌标本中的HBV－X，HCV－C和p53蛋白进行检测，并结合临床资料进行分析。结果 68例肝门部胆管癌中乙肝病毒X蛋白阳性率为8．8％（6／68），丙肝病毒C蛋白阳性率为35％（24／68），两者均阳性1例（1．5％）；p53蛋白阳性率为45．6％（31／68）。乙肝，丙肝病毒感染的肝门部胆管癌在分化和浸润程度，淋巴结转移，根治程度与非病毒感染的肝门部胆管癌有明显差异，p53与乙肝病毒X，丙肝病毒C蛋白表达呈显著的正相关（P＜0．001）。结论 乙肝，丙肝病毒感染与肝门部胆管癌发生有关。乙肝，丙肝病毒感染的肝门部胆管癌恶性程度高，可能有较差的预后。HBV－X，HCV－C蛋白可能在HBV，HCV感染肝门部胆管癌的病因中起重要作用，p53蛋白在肝门部胆管癌中的异常表达与HBV，HCV感染有关。     

HCV核心基因转染的胆管癌细胞中p53的表达及意义

目的：探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理。方法：通过分子克隆技术构建HCV－C基因重组质粒（PBK－HCVc)，经酶切鉴定后，将其转染到胆管癌细胞（QBC939）中，经G418选择培养，免疫细胞学，Western blotting鉴定其表达，透射电镜观察细胞形态学改变。并用免疫细胞学检测p53的表达。结果：构建的PBK－HCVc质粒在QBC939细胞中有稳定表达，透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒，病毒颗粒直径50－80nm，有外膜结构。HCV核心基因转染后QBC939细胞的p53表达比转染前明显增多（P＜0．01）。结论：本实验为进一步探讨丙肝病毒感染与肝门部胆管癌中的致癌机理提供了理想的细胞株模型，HCV核心基因可诱发p53突变，可能与丙肝病毒感染的胆管细胞癌变有关。     

p53 ser249突变对小鼠EF细胞周期和凋亡的影响

目的 研究p53 249编码子突变对小鼠EF细胞p53功能和信号传导的影响.方法 利用基因打靶技术在小鼠ES细胞p53基因249编码子中引入点突变.使编码子249由Arg变成Ser,根据同源重组规律采用PCR或Southern方法筛选带有p53 249突变的阳性ES细胞,并通过测序确定该ES细胞的p53 249编码子已经由Arg变成Ser,然后将含突变而不含筛选标记的ES细胞微注射到从Hprt-/-小鼠收集的囊胚中,将注射过的囊胚植入假孕的雌性小鼠子宫,到第14天取小鼠胚胎EF细胞,用含HAT的培养液[DMEM含10%FCS,glutamine,antibiotics,50 mM mecaptoethanol,和HAT(0.016 mg of hypoxanthine/ml,0.01 mM aminopterin,0.0048 mg of thymidine/ml)]筛选出从ES细胞分化而成的MEF细胞,经测序证实该细胞含有249 Arg到Ser的突变后,该细胞用于研究.利用细胞流式仪检测该突变对MEF细胞周期及凋亡的影响,并利用Western检测相关蛋白的表达.结果 (1)用UV处理EF细胞后,含p53 249编码子突变的EF细胞凋亡百分数,较含野生型p53的EF细胞凋亡百分数明显减少(P＜0.05).(2)用UV处理EF细胞后,含p53 249编码子突变的EF细胞对UV诱导的G1/G0细胞周期阻滞作用减弱.(3)用UV处理细胞后,含p53 249编码子突变EF细胞的p53的表达,与含野生型p53 EF细胞p53的表达没有差别,但含p53 249编码子突变EF细胞的BAX和p21的表达,较含野生型p53 EF细胞的BAX和P21的表达减少.结论 p53 249编码子突变可以减弱p53在uV诱导MEF细胞周期阻滞和凋亡过程中的作用,但对p53的表达没有影响.     

脊髓性肌萎缩症中运动神经元生存蛋白缺失抑制p53泛素化降解致其积累的研究

目的 探究脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）中p53积累的分子机制。方法 构建运动神经元生存基因（Survival motor neuron，Smn）敲低的稳转小鼠运动神经元细胞系NSC34，采用蛋白质印迹和荧光定量PCR检测蛋白和基因的变化；用蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide，CHX）抑制蛋白合成，蛋白质印迹检测p53蛋白降解情况，采用免疫共沉淀检测p53与MDM2结合情况；采用免疫荧光检测小鼠脊髓组织运动神经元数量，运用流式细胞仪分析细胞周期的分布。结果 在Smn敲低的NSC34细胞中，p53蛋白水平显著增加，但是其基因水平未发生明显变化；当蛋白合成被抑制后，SMN缺失会抑制p53蛋白降解，p53积累后会调控下游MDM2表达显著增加，但是其与p53结合却显著减少；p-p53（Ser18）和acetyl-p53（K382）水平显著升高，K382乙酰化位点会影响p53泛素化结合，导致其泛素化被抑制；最终p53积累导致NSC34细胞和SMA小鼠脊髓组织中细胞周期阻滞和凋亡增加。结论 SMN蛋白缺失通过抑制p53泛素化降解途径导致其积累，进而引起细胞周期阻滞和凋亡。     

p53重组腺病毒联合顺铂或三氧化二砷对人膀胱癌EJ细胞的作用

目的：探讨p53重组腺病毒（Ad-p53）与顺铂（CDDP）或三氧化二砷（As2O3）联合应用提高膀胱癌疗效的可能性及其机制。方法：将Ad-p53[100感染强度（MOI）]与CDDP（0．5mg/L)或As2O3(2.0μmol/L）联合应用，通过细胞生长抑制实验、克隆形成实验、细胞周期分析、免疫组织化学分析以及裸鼠皮下移植瘤模型，观察其对膀胱癌EJ细胞的作用及机制。结果：与单独应用相比，Ad-p53与低剂量的CDDP或As2O3联合可明显抑制EJ细胞体外生长，诱导EJ细胞凋亡，EJ细胞G2／M期阻滞更明显；裸鼠体内肿瘤发生时间延迟，4周后肿瘤体积与单独应用时相比，差异有显著性（P＜0．05）。结论：基因治疗与化疗联合应用，可进一步提高膀胱癌的疗效。     

3′-脱氧腺苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和p53表达的影响

目的 观察3′-脱氧腺苷对MDA-MB-231细胞生长、细胞周期、凋亡和p53表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法观察3′-脱氧腺苷对体外培养MDA-MB-231细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测3′-脱氧腺苷作用于MDA-MB-231细胞48 h后细胞凋亡率和细胞周期变化;免疫组织化学方法检测MDA-MB-231细胞p53蛋白表达的变化.结果 MDA-MB-231细胞经3′-脱氧腺苷作用后,生长明显抑制,呈剂量和时间依赖性,以80 mg/L时作用最强;不同浓度(2、20、40、80、160mg/L)的3′-脱氧腺苷作用48h后,细胞凋亡率明显升高,其中在40 mg/L( 11.23±0.98)组、80 mg/L (15.21 ±2.0l)和160 mg/L( 13.27±2.26)与对照组(3.25±0.12)比较差异有统计学意义(P＜0.05).G0/G1期细胞比例逐渐升高,同时S期、G2/M期细胞比例相应减少(P＜0.05);免疫组织化学染色结果表明,随着3′-脱氧腺苷浓度的增加,MDA-MB-231细胞p53蛋白表达水平逐渐降低.结论 3′-脱氧腺苷对MDA-MB-231细胞具有明显的生长抑制和促凋亡作用,这种作用可能是通过下调p53蛋白表达以及阻滞细胞周期而实现.     

端粒酶启动子调控p53基因表达对T24细胞的影响

目的 探讨端粒酶催化亚基（hTERT）启动子调控p53基因在膀胱肿瘤细胞T24中表达对细胞的影响。方法 将成功构建的phTERT-p53载体，瞬时转染膀胱肿瘤T24细胞；应用流式细胞仪观察细胞凋亡率变化，透射电镜下观察细胞凋亡形态学改变。结果 hTERT启动子调控p53基因表达使细胞凋亡率明显升高[24、48h凋亡率：实验组15．42％、36．57％；转染绿色荧光蛋白基因（GFP）组5．16％、8．19％；阴性对照组4．49％、7．18％]，电镜下观察到典型凋亡改变。凋亡指数达25％。结论 hTERT启动子能够激活phTERT-p53载体表达p53，使肿瘤细胞凋亡增加。     

H2O2诱导肝细胞凋亡时p53、bcl—2 mRNA的表达及其意义

目的 探讨H2O2诱导人类正常肝细胞系（L02细胞）凋亡时p53、bcl-2 mRNA表达的意义及丹参有效成分Rxa对其表达的影响。方法 以正常L02细胞为对照（L组）,以10μmol/L H2O2诱导L02细胞凋亡为细胞模型（LH组）,观察Rxa处理（LaH组,Rxa 2mmol/L）对p53、bcl-2 mRNA表达（原位杂交结合图像分析处理）的影响。结果 LH组2－6h p53 mRNA表达随凋亡细胞指数增高而增强,6－8h表达下降;bcl-2 mRNA表达弱。相比较LaH组各时限检测点p53 mRNA表达均低于LH组,bcl-2 mRNA表达较强（P＜0．01）。结论 Rxa可通过p53的细胞周期调控、DNA损伤修复作用和bcl-2的抗凋亡作用减轻L02细胞过氧化损伤。