基于SRAP分子标记的天麻遗传多样性研究

目的 利用SRAP分子标记技术对天麻种质资源进行遗传多样性研究,为天麻不同亲缘物种间的分类及其优良种质资源的筛选提供依据。方法 采集7个不同生态区域的天麻种质资源,包括红杆G.elata f.elata、乌杆G.elata f.glauca和绿杆G.elata f.viridis 3种变型和红乌杂交天麻,共24份样品。运用SRAP分子标记方法构建天麻种质的DNA指纹图谱,从分子水平检测其遗传多样性。结果 33对引物扩增出637条多态性条带,多态性百分率达73.16%。24份天麻种质样品间相似度分布于0.404 0~0.908 0,整个群体之间的相似程度差异较大。其中红天麻样品间的相似度在0.906 6~0.996 4,遗传差异较小;乌天麻、杂交天麻和绿天麻样品间的相似度分别在0.410 4~0.999 6、0.541 0~0.950 4和0.578 2,遗传差异较大。AMOVA分析结果显示,天麻变型内变异大于变型间变异,天麻各变型间有很大的遗传分化(FST=0.33,P<0.05)。另外,人工栽培对遗传分化有影响,但不显著。结论 SRAP分子标记方法得到的24份天麻样品多态性丰富,能有效地反映出天麻的遗传多样性。红杆天麻的遗传性状较为稳定,与其他变型间缺乏基因交流,遗传多样性匮乏;其他2个变型具有较高的遗传多样性。     

滇龙胆居群遗传多样性和遗传结构分析

目的 揭示不同分布区滇龙胆Gentiana rigescens的遗传多样性与遗传结构。方法 基于GBS(genotyping-by-sequencing)简化基因组(reduced-representation genome sequencing,RRGS)技术对采自云南、四川和贵州的19个居群147株滇龙胆进行测序;利用样本SNPs数据集结合聚类树分析、主成分分析、遗传结构分析、Mantel检验等方法,从基因组水平研究滇龙胆居群的遗传多样性与遗传结构;结果 聚类树分析、主成分分析及遗传结构分析显示,不同分布区采集的样品有明显的基因型差异;依据样品地理来源,19个居群大致可分为横断山区(分布于滇西北和川西南的居群)及云贵高原(分布于滇西、滇中、滇东南及贵州的居群)2个亚群。通过观测观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)、多态信息含量(polymorphic information,PIC)、Shannon多样性指数(shannon’s diversity index,I)、Nei’s多样性指...     

"鄂天麻二号"品种的栽培技术

天麻Gastrodia elata B1有四个变型：原变型(红天麻)G elata f elata、绿天麻G．elata f，viridis、乌天麻G．elata f．glanca和黄天麻G．elata f．flavida目前我国的商品天麻大部分是红天麻，少部分为乌天麻。天麻的球茎作为补脑、镇静、安眠的良药，迄今已有两千年历史。但进行人工栽培、变野生为家栽，迄今才48年。我们在天麻无性繁殖、有性繁殖的基础上进行杂交育种，在我国首次培育并审(认)定天麻杂交品种一鄂天麻二号，即红天麻与乌天麻杂交品种。     

广西地不容SSR标记开发及遗传多样性研究

目的基于广西地不容转录组序列开发SSR引物,并用于该物种自然居群遗传多样性的研究。方法从广西地不容转录组测序获得的unigene序列中挖掘SSR位点,采用Oligo 7.0软件设计引物,通过电泳法筛选得到多态性高的SSR引物用于遗传多样性研究。结果从广西地不容转录组20 637条unigene序列中,搜索到6 833个SSR位点,出现频率为33.11%。基于转录组序列设计50对引物,筛选得到10对多态性高的引物。10对引物在5个居群63个样本中共扩增得到83个条带,有效条带百分率为100%,多态性信息量(PIC)为0.6889。在物种水平和居群水平上,Nei基因多样性指数(H)分别为0.725 2和0.613 4,Shannon多样性指数(I)分别为1.576 6和1.220 3,观察杂合度(Ho)分别为0.584 5和0.558 4,期望杂合度(He)分别为0.731 2和0.643 5。居群的遗传分化系数(Fst)为0.146 5,基因流(Nm)为1.456 9。UPGMA聚类分析表明,5个居群可分为3支系。结论开发的SSR标记适用于广西地不容的遗传多样性分析。广西地不容在物种和居群水平上均具较高的遗传多样性,遗传分化主要存在于居群内部。     

三叶青种质资源遗传多样性的SSR荧光标记分析

目的研究三叶青64个种质的遗传多样性和亲缘关系。方法利用SSR荧光标记对其进行PCR扩增,利用POPGENE32软件分析三叶青64个种质的遗传多样性和亲缘关系,利用UPGMA法构建其亲缘关系树状图,利用NTSYS软件构建其主成分分析二维图和三维散点图。结果从14对引物中筛选出8对条带清晰、重复性好的引物,对64份供试材料的基因组DNA进行扩增。8个SSR标记的观察等位基因数(Na)变化范围为3～13,均值为7.875 0;有效等位基因数(Ne)变化范围为1.424 9～6.087 4,均值3.605 2;Shannon信息指数(I)变化范围为0.689 5～2.082 4,均值1.424 0;观测杂合度(Ho)变化范围为0.206 3～0.734 4,均值0.524 7;期望杂合度(He)变化范围为0.300 6～0.842 4,均值0.658 4;Nei’s基因多样性(H)0.298 2～0.835 7,均值0.653 2;多态信息含量(PIC)变化范围为0.288 0～0.817 5,均值0.614 5,遗传相似系数变化范围为0.115 4～0.954 5,遗传距离变化范围为0.000 0～3.218 1,说明64份三叶青种质亲缘关系较远,遗传分化程度较大。在遗传距离1.018 9处,64份三叶青种质可分为5大组。结论地理差异与种质遗传差异无必然联系。三叶青种质资源具有丰富的遗传多样性,SSR荧光标记分析结果可为三叶青种质资源的利用和品种选育提供一定的参考。     

基于SSR分子标记的滇重楼遗传多样性研究

目的研究滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis自然居群的遗传多样性,为滇重楼资源的保护和合理利用提供数据。方法采用SSR分子标记对滇重楼5个不同居群共115份样品进行遗传多样性分析。结果筛选出8对可用SSR引物,多态位点百分率(PPB)为100%,多态信息量(PIC)为0.745 6。在居群水平和物种水平上,观测等位基因数(N_a)分别为8.425 0和17.750 0,有效等位基因数(N_e)分别为4.960 9和7.500 7,观测杂合度(H_o)分别为0.295 5和0.294 8,期望杂合度(H_e)分别为0.654 8和0.774 4,Shannon’s信息指数(I)分别为1.520 1和2.038 6。遗传分化系数(F_(st))为0.172 8,基因流(N_m)为1.196 6。利用UPGMA聚类分析,将5个居群分为2类。结论滇重楼遗传多样性水平较高,居群内和居群间具有一定的遗传分化。对保护和发展滇重楼资源提出若干措施,为滇重楼的保护和科学可持续利用提供参考。     

栀子全基因组SSR标记开发及遗传多样性分析

目的 揭示栀子基因组的SSR分布规律,开发SSR标记引物,探究不同栀子居群间的遗传差异。方法 利用MISA软件对栀子全基因组序列进行SSR位点搜索分析,Primer 3.0软件设计SSR引物,然后对引物进行有效性和多态性检测,并利用筛选到的多态性引物对6个居群的57份栀子材料开展遗传多样性分析。结果 栀子基因组共鉴定到232 880个SSR位点,每2.3 kb有1个SSR位点,其中83.02%的SSR位点分布于基因间区域,外显子区域SSR位点最少,单核苷酸为栀子的优势重复基序,占总SSR的64.60%。从设计的SSR引物中挑选80对进行PCR扩增,85%的引物能够扩增成功。利用筛选出的9对高多态性SSR引物,对6个栀子居群进行遗传多样性分析,共检测到64条扩增条带,其中多态性条带62条,居群总遗传多样性(Ht)为0.246,居群内遗传多样性(Hs)为0.210,Nei’s基因分化系数(Gst)为0.146,基因流(Nm)为2.923。聚类分析结果显示,地理位置相邻的重庆、贵州、四川居群聚为一类,福建、浙江、江西居群聚为另一类。结论 基于全基因组序列开发栀子SSR标记是一种高效的途径,可...     

贵州天麻遗传多态性的ISSR初步分析

目的：构建贵州天麻ISSR指纹图谱，分析彼此间的遗传关系。方法：采用ISSR分子标记技术对贵州省境内的23个野生和栽培天麻居群的样品进行了初步研究，从24个ISSR引物中筛选出4个有效引物，在供试的23个样品中共检测到32个位点，其中29个表现出多态性，占总带数的90．63％，平均每个引物扩增的DNA带数为8条。天麻的多态位点百分率（PPB）在80％和100％之间。用NTSYSpc，vet．2．02软件进行UFGMA聚类分析。结果：23个居群的相似性系数在0．13—1．00之间，同一变型的天麻样品并不严格聚为一类，不同变型天麻样品之间的遗传变异较大。结论：地理分布和生长环境的差异以及人为的选择是导致天麻形成丰富的遗传多态性的一个重要的原因。     

基于SSR荧光标记的不同品种（系）当归遗传关系分析及分子身份证构建

目的 利用荧光SSR分子标记对甘肃省11个当归Angelicasinensis品种（系）194份当归样品进行遗传多样性和遗传结构分析,并构建其分子身份证,为当归新品种（系）选育提供科学依据。方法 采用课题组前期筛选出10对SSR荧光引物对供试材料进行PCR扩增,利用Popgen软件进行遗传参数的计算,利用Structure软件进行群体结构分析,利用NTSYS软件构建各居群的Nei’s遗传距离UPGMA聚类图,利用GenALEx软件进行分子方差分析;对扩增带型进行数字加字母编码,构建当归分子身份证。结果 10对SSR荧光引物共获得观测等位位点57个,平均每对引物5.7个,当归群体的观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和Nei期望杂合度（Nei）分别为0.341 4、0.407 0和0.385 5;Structure分析将194份当归样品分成5个类群;当归品种（系）居群间的分化系数FST为0.147 7;分子方差分析显示居群内的变异百分比达到78%;最终利用10对SSR荧光引物,构建了10位字符的分子身份证,可以区分11个当归品种（系）。结论 栽培当归在物种水平上遗传多样性较高,各品种（...     

短葶山麦冬遗传多样性SRAP标记研究

目的对短葶山麦冬进行遗传多样性分析。方法利用SRAP分子标记技术对47份短葶山麦冬材料进行遗传多样性分析。结果 15对引物共扩增出323条多态性带,平均多态位点百分率为88.47%。平均引物多态信息量(PIC)为0.90。Nei’s基因多样性指数(H)为0.197 7,Shannon’s信息指数(I)为0.319 0。遗传分化系数(Gst)为0.252 8。UPGMA聚类表明遗传相似系数为0.59～0.99。结论短葶山麦冬遗传多样性水平较高,遗传变异主要在居群内。     

西南不同产区3种天麻变型主要化学成分含量比较

目的对西南不同产区3种天麻变型的主要化学成分含量进行比较和主成分分析,为进一步开发利用天麻资源和评价药材质量提供理论依据。方法采用苯酚-浓硫酸法测定天麻多糖含量,茚三酮显色法测定游离氨基酸含量,Folin-Ciocaileu比色法测定总多酚含量,HPLC法测定天麻中天麻素、对羟基苯甲醇含量,并利用主成分分析法对天麻药材质量进行评价。结果不同产区天麻资源材料的主要化学成分含量差异较大。变异系数以天麻多糖含量最小,为18.025%,对羟基苯甲醇含量的变异系数最高,达48.978%。其中,四川北川的乌天麻游离氨基酸、总多酚和天麻素含量均最高,分别为2.873%、0.805%和0.862%,与其他产区样品间差异均达极显著水平;贵州大方的绿天麻多糖含量最高,为29.225%,显著高于北川的乌天麻,并极显著高于其余天麻;对羟基苯甲醇含量最高的为云南昭通的乌天麻,其次为四川广元的红天麻,两者间差异不显著。结论天麻中各成分在地区或变型间差异不显著,从主要化学成分角度分析,四川北川的乌天麻药材质量最好。     

天麻新品系“略麻-1号”选育及质量评价

目的 针对天麻栽培品种退化和新品种匮乏问题，选育综合性状较为优良的天麻品系“略麻-1号”。方法 采用系统育种方式，培育了红天麻“略麻-1号”（ZYXP-2020-006），并对其进行田间测评。结果 与对照品种安徽红天麻相比，“略麻-1号”花茎颜色为橙红色，属红天麻，花茎高且粗；花序多且轴长；果实红褐色且长、宽适中，鲜质量大、数量多；种茎短粗呈子弹状，黄白色，无蜜环菌缠绕，无退化现象；箭麻呈扁平状或长筒状，黄白色，环纹清晰明显；天麻素和对羟基苯甲醇总质量分数为0.42%，比对照品种高35.48%；总产量比对照品种高101.97%。结论 “略麻-1号”繁殖能力强、产量高、品质好，具有显著且稳定的生产优势。     

基于Group-Lasso天麻品质形成关键因子的分析

目的 为提高人工种植天麻的质量,基于Group-Lasso变量筛选构建随机森林回归模型分析影响天麻品质形成的关键因子。方法 基于Group-Lasso法,对2007—2022年天麻质量研究文献中天麻素含量及产地环境变量等数据进行变量筛选,并在筛选出的变量基础上建立随机森林回归模型及计算变量重要性得分。结果 最终选择了产区、生长状况、种质类型、产地气候类型、产地土壤类型、最热月均温、产地年降水量、产地年日照时数和无霜期9个变量,基于被选变量与天麻素含量建立随机森林回归模型,模型的均方误差（mean square error,MSE）和平均绝对百分误差（mean absolute percentage error,MAPE）分别为0.103 2和14.08%,特征重要性排序显示天麻素含量的最大影响因素是产地年降水量,其次是产地土壤类型、无霜期和产地年日照时数。结论 随机森林回归模型有相对较低的误差和较高的预估精度,更适合用于对天麻种植环境的分析和天麻素含量的估算,为人工种植天麻提供参考。     

天麻改善小鼠睡眠作用及其机制研究

目的探讨天麻对小鼠睡眠的促进作用及其对中枢多巴胺(DA)系统的影响,并进一步研究天麻有效成分天麻素通过影响DA通路发挥作用的机制。方法小鼠随机分为对照组、天麻组、橄榄油组、天麻-橄榄油组及阳性对照艾司唑仑组,每组10只,分别ig给予生理盐水、天麻、橄榄油、天麻-橄榄油和艾司唑仑,连续给药20 d。各组小鼠分别在第7、20天给药30～40 min后ip最大阈下剂量戊巴比妥钠(35 mg/kg),测定睡眠发生率;分别在第8天及第21天ip最小阈上剂量戊巴比妥钠(50mg/kg),检测小鼠睡眠潜伏期和睡眠时长;采用ELISA法测定天麻对小鼠脑组织DA水平的影响;采用q RT-PCR法检测天麻对DA受体各亚型表达的影响;构建DA受体D1、D2诱导表达稳定细胞株,Westernblotting法检测ERK通路相关蛋白的表达水平。结果与对照组比较,天麻给药20 d后小鼠睡眠潜伏期显著缩短,睡眠发生率提高,睡眠时长延长,中枢DA水平显著提高,DA受体各亚型的表达水平显著上调。同时,天麻中有效成分天麻素可激活DA受体D2而不是D1介导的信号通路。结论天麻可能通过上调中枢DA系统活性进而调控睡眠,天麻中有效成分天麻素可能通过D2介导的信号通路发挥作用。     

野三七转录组中SSR位点信息分析及其多态性研究

目的 分析野三七Panax vietnamensis var. fuscidiscus（PVF）转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列（SSR）引物,以期为野三七分子标记辅助育种提供有力工具。方法 利用MISA工具筛选了野三七转录组测序获得的126 758条unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer3设计SSR引物,并随机选择30对SSR引物对13株不同来源的野三七进行多态性扩增分析。结果 在野三七的转录组中,共搜索到21 320个SSRs,分布于17 780条unigenes,SSR位点出现频率为16.82%。SSRs位点中二核苷酸重复是主要类型,占总SSRs的52.52%;其次是三核苷酸重复基序（28.08%）。SSRs所包含的重复基元中,二核苷酸重复基元AG/CT和AT/AT是优势重复基元类型,占总SSRs的46.25%。利用Primer3共设计出39 336对SSR引物。随机选择30对引物进行PCR扩增,其中29对（96.67%）扩增出清晰、可重复的条带,15对（50.00%）扩增条带表现出多态性。利用UPGMA作图,将13个材料分为2类。结论 野三七转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

免疫亲和柱净化UPLC-MS-MS测定天麻药材中黄曲霉毒素的含量

目的：研究建立了免疫亲和柱净化UPLC-MS-MS测定天麻药材中黄曲霉毒素B₁,B₂,G₁,G₂的含量测定方法。方法：采用甲醇溶液超声提取、玻璃纤维滤纸滤过、黄曲霉毒素亲和免疫柱净化的方法对天麻药材样品进行处理,以超高液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（UPLC-MS-MS）对黄曲霉毒素B₁,B₂,G₁,G₂含量进行研究并测定。结果：被测定的4种黄曲霉毒素分别在选定的范围内线性关系良好,精密度、重复性、准确度均良好,利用标准参考物质对本方法的验证结果良好,采用所建立的方法对30批不同产地天麻药材中黄曲霉毒素B₁,B₂,G₁,G₂含量进行了测定,结果均未检出。结论：该方法科学、可行、方便、快速,适用于对天麻药材中黄曲霉毒素B₁,B₂,G₁,G₂进行含量测定。     

蜜环菌与天麻共生分子机制的转录组分析

目的以蜜环菌和昭通乌天麻营养繁殖茎为实验材料,通过转录组测序比较分析,初步揭示蜜环菌天麻共生的分子机制。方法采用Trizol Reagent(Invitrogen)提取营养繁殖茎样品中的RNA,建立测序文库并进行测序。结果蜜环菌与天麻共生时有38 838条序列得到注释,在FDR(False Discovery Rate)0.05和log2|FC|1筛选条件下,共有23 333条基因发生显著差异表达,其中1 595条基因呈上调表达,21 738条呈下调表达。基于转录组数据分析结果,与胞外酶纤维素酶、木聚糖酶、漆酶以及多聚半乳糖醛酸酶相关的Unigene分别有21、6、39和6个,集中差异表达基因分别有9、3、23和4个,除1个纤维素酶基因上调表达外,其他均呈下调表达;与抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶有关的Unigene基因分别有13、7和17个,其中差异表达的基因分别有6、7和7个,都呈下调表达。此外,q RT-PCR分析验证了这些基因呈下调表达。结论蜜环菌侵染天麻与其共生的过程中,蜜环菌的生命活动减弱,同时未受到天麻胁迫作用。这为进一步研究天麻蜜环菌共生分子机制提供了大量有价值的基因资源。     

基于转录组测序初步揭示天麻生长代谢的分子机制

目的以箭麻(天麻Gastrodia elata的一个生长阶段)和共生天麻(白麻与蜜环菌共生的天麻)为实验材料,通过转录组测序分析初步揭示箭麻和共生天麻生长代谢特征。方法采用Trizol Reagent(Invitrogen)提取天麻样品中的RNA,建立测序文库并利用Illumina Hiseq^TM2000进行测序,通过与基因数据库比对分析注释和发现差异表达基因。结果箭麻与共生天麻间共获得72244条序列,其中有26312条得到注释。在False Discovery Rate(FDR)<0.05和|log2FC|>1筛选条件下,共有12498条基因发生显著差异表达,其中9000条基因表达上调,3498条表达下调。京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能富集分析表明,差异基因显著富集在20个代谢途径中,其中包含氮代谢,碳代谢和能量代谢等途径。差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)注释到蛋白相邻类的聚簇(cluster of Orthologous Groupsof proteins,KOG)的25个分类中,其中差异表达基因与生长代谢过程相关过程能量的产生和转化(energy production and conversion,C)、碳水化合物转运与代谢(carbohydrate transport and metabolism,G)、次生代谢产物的合成、转运和代谢(secondary metabolites biosynthesis,transport and metabolism,Q)类别获得2218个注释结果。基于转录组数据,分析了生长代谢过程中相关基因差异表达水平,发现有利于碳、氮、能量等物质积累的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,ASNS)、蔗糖合成酶(sucrose synthase,Su Sy)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSS)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase,PDH),苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH),异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)基因呈上调表达,除分解ATP的ATP酶(adenosine-triphosphatase,ATPase)上调外,分解氮、碳物质的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、精氨酸酶(arginase,Argase)和淀粉酶(amylase,AMS)基因呈下调表达。q RT-PCR分析结果表明这些基因表达水平与转录组表达情况基本一致。相比较于箭麻,共生天麻生长代谢中物质积累比较旺盛。结论共生天麻通过消解侵入的蜜环菌合成有机营养物质和能量,有利于其从蜜环菌和周围环境吸收营养物质供箭麻生长需要,为进一步研究天麻不同发育阶段代谢特征奠定基础,并为天麻栽培提供理论指导。     

云南草果种质资源的遗传多样性及亲缘关系的SSR分析

目的评价云南草果居群的遗传多样性及亲缘关系。方法运用7对微卫星引物对24个草果居群进行分析;首先应用GenALEx计算遗传多样性参数,并进行PCoA和AMOVA分析;采用NTsys软件绘制居群聚类图;最后利用Structure软件计算出最佳的K值。结果 24个草果居群的Shannon多样性指数(H)的平均值为0.49,期望杂合度(He)的平均值为0.32;遗传分化系数(Fst)为0.090,基因流(Nm)为2.930。24个草果居群的遗传分化有81%存在于居群内,仅有19%存在于居群间;黄花草果23个居群的遗传一致度(I)为0.631 8～0.982 4,遗传距离(D)的范围为0.017 7～0.459 2,而白花草果居群(MG5)与其他23个黄花草果居群一致度均较小,为0.3697～0.6090;而居群聚类分析,在遗传距离0.49处,明显地把白花草果与黄花草果分开;Structure聚类得出K=4时,209份黄花草果资源可被分为4个类群。结论云南黄花草果居群的遗传多样性水平平均偏高;遗传变异主要存在于居群内,而非居群间。根据基因型,黄花草果和白花草果被明显地划分成2类,遗传距离很远;而黄花草果大致被分为4个类群。