降钙素基因相关肽对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用研究

目的 探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用及其潜在机制。方法1）构建细胞氧化损伤模型,将实验分为4组,H₂O₂组使用含不同浓度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5 mol·L^-1）H₂O₂的培养液,CGRP+H₂O₂组使用含不同浓度（10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10 mol·L^-1）CGRP的培养液预处理后再加入含10^-4 mol·L^-1 H₂O₂的培养液,对照组为常规培养液,空白组不接种细胞。培养12、24、36、48 h后,CCK-8法检测细胞增殖活性,筛选最佳建模浓度和CGRP对成骨细胞氧化损伤的最佳保护浓度。2）采用含10^-4 mol·L^-1 H₂O₂（H₂O₂组）、10^-8 mol·L^-1 CGRP（CGRP组）的培养液和10^-8 mol·L^-1 CGRP+10^-4 mol·L^-1 H₂O₂培养液（CGRP+H₂O₂组）、常规培养液（对照组）培养成骨细胞,测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性、活性氧（ROS）的含量以及炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。结果 1）在10^-4 mol·L^-1 H²O²时细胞增殖开始出现抑制（P<0.01）,并呈浓度和时间依赖性;10^-8 mol·L^-1 CGRP预处理后细胞增殖活性最高,与只加入10^-4 mol·L^-1 H₂O₂有统计学差异（P<0.01）。2）与H²O²组相比,CGRP+H₂O₂组SOD活性升高（P<0.01）,TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P<0.05）,ROS含量降低（P<0.01）。结论 H₂O₂会对MC3T3-E1成骨细胞造成氧化损伤,CGRP对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤具有保护作用。     

淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究

目的：研究传统中药淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷(icariin,ICA)对小鼠颅顶前成骨细胞(preosteoblasts in mice calvarium,MC3T3-E1)的细胞活性及成骨分化的影响。方法：筛选出ICA的最佳干预浓度，将MC3T3-E1细胞分为空白对照组及不同浓度的实验组，实验组以含10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L的ICA完全培养液分别处理MC3T3-E1细胞。分别于培养2、4、6 d后用CCK8试剂盒检测MC3T3-E1细胞增殖能力；于培养3、6、9 d后用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测其ALP活性；根据检测结果，分别用完全培养液、成骨诱导液、含10^-7 mol/L的ICA完全培养液处理MC3T3-E1细胞21 d后，再分别作茜素红染色。结果：与空白对照组相比，药物处理组明显抑制了MC3T3-E1细胞的增殖，但促进了MC3T3-E1细胞的ALP活性；而不同浓度的I...     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型的建立及Ano5基因表达的研究

目的 建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型,探讨Ano5基因表达与成骨细胞形成的关系,了解其对成骨分化的影响.方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞贴壁培养,加入条件培养基,分别培养至0d、3d、7d、14d、21d.倒置显微镜下观察细胞形态,通过碱性磷酸酶活力测定和茜素红染色,鉴定成骨细胞.利用REALTIME-PCR检测Ocn、Colα1、Opg/Rankl、Osterix和Runx2等成骨相关因子的基因表达水平,同时检测Ano5基因在成骨细胞形成过程中的表达趋势.结果 体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14倒置光学显微镜下观察细胞形态呈梭形.成骨细胞碱性磷酸酶活力逐渐增高.成骨诱导培养至14d和21d,茜素红染色可见细胞表面出现矿化结节.成骨相关因子基因表达均逐渐增高,至21d达到高峰.Ano5基因从诱导分化的第3d开始表达,随后表达量逐渐增高,至14d达到高峰,21d表达量下降.结论 在MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导分化为成骨细胞过程中,Ano5基因表达量逐渐升高,至14d达到高峰,21d开始表达量具有下降趋势.     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

不同浓度无机磷对MC3 T3-E1细胞系成骨及破骨相关基因表达的影响

目的：探讨不同浓度的无机磷液对体外培养MC3T3-E1细胞的成骨和破骨相关基因mRNA表达的影响。方法：体外常规培养MC3T3-E1细胞。根据所用培养液外加无机磷浓度的不同,将实验细胞分为4组：0 mM组（对照组）、1 mM组、3 mM组和5 mM组。每组设3个复孔,培养48 h后收取细胞标本,通过Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞成骨和破骨相关基因mRNA的表达。结果：与对照组相比,成骨相关基因ALP、BSP、OC及OSXmR-NA的表达在1 mM组和3 mM组增加,而在5 mM组则减少,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;成骨抑制基因SOST及破骨相关基因CTSK、TRAPmRNA的表达,在1 mM 组、3 mM 组和5 mM 组都增加,差异具有统计学意义（ P ＜0.05）。结论：高浓度（5 mM）的无机磷环境对MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达起显著抑制作用,对破骨相关基因表达起显著增强作用,提示高浓度无机磷抑制MC3T3-E1细胞的成骨活性。     

“壳-芯”结构电纺纤维膜对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响

［摘要］　目的　研究载有骨形态发生蛋白(BMP-2)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)“壳芯结构”静电纺丝纤维膜(PP-B)对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响。方法　通过同轴静电纺丝的方法制备PLGA/PCL-BMP-2纤维膜(PP-B),以不含BMP-2的PLGA/PCL电纺纤维膜(PP)为对照组。通过透射电子显微镜观察PP-B膜的“壳-芯”结构;用ELISA法检测BMP-2的体外释放行为;收集PP-B膜的浸出液培养细胞,用碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测其释放的BMP-2对MC3T3-E1细胞的影响;将MC3T3-E1细胞接种到纤维膜上,通过CCK-8法检测1d、3d、5d、7d的增殖情况;以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其7d的活性;用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞接种7d时成骨指标Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达。结果　透射电镜结果表明,同轴静电纺丝法制备的PP-B静电纺丝可形成连续均一的“壳-芯”结构;ELISA结果显示,PP-B膜可以实现BMP-2的持续释放;ALP活性检测结果证实本实验条件下制备的负载BMP-2的同轴静电纺丝支架能保持生长因子的部分活性。CCK-8结果显示PP-B膜和PP膜上的MC3T3-E1细胞在1、3、5、7d都持续增殖;ALP活性检测及染色结果显示PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的ALP活性高于PP膜(P<0.05);实时荧光定量逆转录PCR结果显示接种在PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的相关成骨基因Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达高于PP膜(P<0.05)。结论　本实验制备的PP-B膜能促进MC3T3-E1细胞在体外的早期成骨分化。     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

辐射对体外培养MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化的影响

目的 观察60Co γ射线对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化能力的影响。方法 MC3T3-E1细胞接种24 h后进行60Co γ射线照射,单次照射剂量分别为0、4、8 Gy。辐射后第 1、3、5、7天,采用噻唑蓝比色法检测细胞的增殖能力;辐射后第12天,用黏胶纤维红染色法检测细胞的胶原分泌情况;第16天,用实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞成骨相关基因mRNA的表达;第28天,采用茜素红染色及定量分析检测细胞基质的矿化能力。结果 与对照组（0 Gy）相比,4、8 Gy剂量的射线可以明显降低MC3T3-E1细胞的增殖,并下调其Osterix和骨钙素基因的表达;8 Gy剂量的射线可以明显抑制细胞的胶原分泌和基质矿化能力。结论 60Co γ射线可以降低MC3T3-E1细胞的增殖、胶原分泌及基质矿化能力,并下调其成骨相关基因表达,且随辐射剂量增加,其作用增强。     

釉基质蛋白诱导MC3T3-E1细胞成骨分化过程中微小核糖核酸的表达

目的 探讨微小核糖核酸(micro ribonucleicacid,miRNA)是否参与到釉基质蛋白(EnamelMatrix Derivative,EMD)诱导的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞成骨分化的过程,并对发生显著变化的miRNA进行分析.方法 将MC3T3-E1用含EMD(刺激组)/不含EMD(对照组)的培养液培养0天、7天和14天,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,实时聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分析成骨分化标记物ALP、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙素(osteocalcin,OC)的信使RNA(mRNA)水平的表达变化.利用基因芯片技术分析miRNA的相对表达.结果 0天、7天、14天的ALP染色结果显示随着培养时间的增加,两组ALP活性均逐渐增强,EMD刺激组ALP活性增强较对照组更为明显.RT-PCR结果表明,与对照组相比,ALP、BSP、OC的mRNA表达量均显著增加,ALP与OC均于14天时表达量达到峰值,BSP则于7天时处于峰值表达,EMD刺激组MC3T3-E1成骨活性更强;各期11个miRNA表达上调,28个miRNA表达下调,其中miR-335-5p,miR-503已被证实可参与促进骨形成,而miR-30家族(miR-30a,-30b,-30c和-30d)则被证实参与抑制成骨.结论 miRNA参与EMD诱导的MC3T3-E1细胞的成骨分化过程,这一发现可以为了解EMD促进成骨分化的机理及临床应用提供指导.     

Davallialactone Reduces Inflammation and Repairs Dentinogenesis on Glucose Oxidase–induced Stress in Dental Pulp Cells

IntroductionThe chronic nature of diabetes mellitus (DM) raises the risk of oral complication diseases. In general, DM causes oxidative stress to organs. This study aimed to evaluate the cellular change of dental pulp cells against glucose oxidative stress by glucose oxidase with a high glucose state. The purpose of this study was to test the antioxidant character of davallialactone and to reduce the pathogenesis of dental pulp cells against glucose oxidative stress.MethodsThe glucose oxidase with a high glucose concentration was tested for hydroxy peroxide (H₂O₂) production, cellular toxicity, reactive oxygen species (ROS) formation, induction of inflammatory molecules and disturbance of dentin mineralization in human dental pulp cells. The anti-oxidant effect of Davallilactone was investigated to restore dental pulp cells' vitality and dentin mineralization via reduction of H₂O₂ production, cellular toxicity, ROS formation and inflammatory molecules.ResultsThe treatment of glucose oxidase with a high glucose concentration increased H₂O₂ production, cellular toxicity, and inflammatory molecules and disturbed dentin mineralization by reducing pulp cell activity. However, davallialactone reduced H₂O₂ production, cellular toxicity, ROS formation, inflammatory molecules, and dentin mineralization disturbances even with a long-term glucose oxidative stress state.ConclusionsThe results of this study imply that the development of oral complications is related to the irreversible damage of dental pulp cells by DM-induced oxidative stress. Davallialactone, a natural antioxidant, may be useful to treat complicated oral disease, representing an improvement for pulp vital therapy.     

Nano-hydroxyapatite mineralized silk fibroin porous scaffold for tooth extraction site preservation

ObjectiveTo fabricate a novel nano-hydroxyapatite mineralized silk fibroin (MSF) scaffold in order to diminish the resorption of alveolar ridge and accelerate new bone formation within tooth sockets. Also, to investigate the biocompatibility and osteogenic ability of the MSF in vitro, and the effect of site preservation of the MSF graft in post-extractive sockets in vivo.MethodsSEM, EDX, FTIR and XRD were used to analyze the mineral crystals deposited on the silk fibroin (SF) surface. Pre-osteoblasts (MC3T3-E1) were seeded on SF and MSF scaffolds. Cell viability, distribution and differentiation were examined using a live-dead assay, histological analysis and Alizarin Red S staining. Furthermore, prepared grafts (SF or MSF scaffold) were implanted into the maxillary right first molar sockets of Sprague Dawley rats for 6 weeks and newly formed bone tissue was analyzed by micro-CT and histological examination.ResultsThe SEM, EDX, FTIR and XRD analysis demonstrated that granulate nano-hydroxyapatite (nHA) crystals were uniformly distributed on the SF scaffold. In addition, the MSF hydrophilicity measured by water contact angle and swelling ratio was superior to plain SF scaffold. The effect of nHA inorganic crystals on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells indicated the MSF scaffolds improved osteogenesis. Furthermore, MSF grafts induced more bone formation and reduced the height of alveolar bone resorption after tooth extraction.SignificanceThe MSF scaffold partially simulated the structure and composition of natural bone matrix. It induced osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells in vitro, and also promoted new bone regeneration in tooth extraction sockets in vivo, indicating it is a biomaterial with great potential for tooth extraction site preservation.     

白藜芦醇通过SOCS-1蛋白抑制牙髓卟啉单胞菌脂多糖诱导的氧化应激反应

目的 探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对小鼠成骨细胞MC3T3-E1氧化应激（oxidative stress,OS）损伤的保护作用及作用机制。方法 RES及LPS刺激细胞后,荧光显微镜及流式细胞术检测细胞内活性氧水平;Western 免疫印迹法检测细胞内细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling-1,SOCS-1）蛋白表达水平。建立SOCS-1瞬时转染细胞系,利用荧光显微镜及流式细胞术分别观察转染后的细胞内活性氧水平。采用SPSS22.0软件包对数据进行统计学分析。结果 LPS组与空白组相比,细胞内氧化应激程度显著提高,LPS+RES组氧化应激程度显著低于LPS组（P<0.05）。10 mg/L P.e-LPS刺激30 min后,细胞内SOCS-1开始升高。SOCS-1转染后,LPS+RES组细胞内氧化应激程度显著高于未转染细胞内氧化应激水平（P<0.05）。结论 白藜芦醇通过调节SOCS-1蛋白,减轻LPS引起的小鼠成骨细胞氧化应激水平,从而发挥保护作用。