CTLA4Ig表达质粒的基因枪转染皮肤及细胞的实验研究

目的 利用基因枪技术提高CTLA4Ig的cDNA的转染效率。方法 设基因枪局部转染组，注射器局部注射组和肌肉注射组，并构建pCTLA4Ig-IRES2-EGFP表达载体，将质粒注射入皮肤，观察三种方法转移CTLA4Ig目的DNA的存留时间。同时，体外培养ECV，293细胞，用基因枪或逆转录病毒载体转染上述质粒，观察质粒的转染及表达情况。结果 基因枪转移基因至细胞，皮肤的效率明显好于其他方法，但对细胞，基因枪的初始压力不能太高，否则，细胞容易死亡。结论 基因枪转染CTLA4Ig质粒效率较高。     

CH50多肽对IFN-γ基因转染癌细胞体内生长及免疫刺激作用的影响

探讨重组FN多肽CH50对IFN-γ基因转染癌细胞体内生长及免疫刺激作用的影响。将小鼠IFN-γ基因转染黑色素瘤B16/Fl细胞,测定其表达产物与CH50协同刺激巨噬细胞产生NO的作用、转染细胞接种小鼠并注射CH50时对脾细胞的免疫刺激作用及瘤细胞的体内生长特性。结果表明,转染细胞表达产物可与CH50协同作用刺激巨噬细胞产生NO。转染细胞表达IFN-γ水平较低,仍可在体内形成肿瘤,注射CH50能够抑制其形成肿瘤。基因转染细胞和CH50能够促进脾细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。研究表明,CH50不仅可以提高肿瘤疫苗的安全性,也可以提高肿瘤疫苗刺激机体免疫系统的作用。并提示,表达CH50和IFN-γ双因子的肿瘤疫苗可为提高肿瘤疫苗治疗肿瘤的效果开辟新的途径。     

不同方式递送质粒DNA诱导体内表达效果的实验研究

目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb／c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶（1uc3蛋白的重组质粒（pGL-3-CMV）或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部（2μg质粒DNA／4．5Mpa／枪）。于质粒注入后24～144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法。     

电穿孔技术对DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫效果的影响

目的探讨应用电穿孔技术对DNA 疫苗pVAX-tG250FcGB 免疫效果的影响。方法构建肾癌DNA 疫苗pVAXtG250FcGB,
通过体内电穿孔技术或普通肌肉注射途径,将DNA疫苗导入到BALB/c小鼠体内,探讨电穿孔免疫途径诱导抗原
特异性免疫应答的效果。结果电穿孔技术或普通肌肉注射均能在小鼠体内诱导出抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应
答,电穿孔技术的免疫效果明显优于普通肌肉注射途径。结论电穿孔技术介导的DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫具有较强
的诱导免疫应答的能力,是研究DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫效果的一种有效途径。
     

真皮内显微注射对比肌肉内注射疫苗预防流感的Meta分析

目的评价真皮内显微注射对比肌肉内注射疫苗预防流感的临床疗效和安全性。方法计算机检索Cochrane图书馆（2009年第2期）、Pubmed、EMBASE,同时检索CBM、CNKI、VIP和万方数据库,检索时间截止2009年4月,收集真皮内显微注射对比肌肉内注射疫苗预防流感效果的随机对照试验,按Cochrane协作网推荐的方法进行系统评价。结果共纳入7个随机对照试验,5032例患者。Meta分析结果显示,采用真皮内显微注射3μg流感疫苗时可获得与肌肉内注射15μg流感疫苗相近的预防效果,但将真皮内显微注射流感疫苗剂量增加到6μg和9μg时,其预防效果并未随剂量的增加而提高。结论真皮内显微注射3μg流感疫苗可以引发比较满意的免疫应答,获得较好的预防效果,在流感大流行期间以及疫苗供应不足的情况下,是一种较好的接种策略。     

基因枪介导人精子顶体膜相关蛋白32基因疫苗在小鼠骨骼肌中的表达

目的:观察pcDNA3.1( )-人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)基因疫苗经基因枪介导肌肉接种后在小鼠体内的表达.方法:BALB/c雌性小鼠6只,实验组鼠(4只)经后腿股内侧肌以基因枪多点注射重组质粒pcDNA3.1( )-hSAMP32 5μg,空载体对照组(1只)注射pcDNA3.1( )载体5 μg,空白对照组(1只)注射无菌生理盐水200μl.接种后第7 d取小鼠股内侧肌注射部位肌肉,RT-PCR和原位杂交法检测目的基因mRNA的表达,以自制抗血清进行免疫组织化学染色检测目的基因蛋白的表达.取小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎组织,PCR扩增,行基因疫苗的安全性检测.结果:RT-PCR和原位杂交检测结果显示实验组小鼠注射部位肌肉组织有目的基因及其蛋白的表达,对照组未见表达.实验组小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎的基因组DNA均未扩增出目的基因条带,说明外源性基因没有整合到宿主染色体.结论:该基因疫苗可在小鼠骨骼肌内有效、安全地表达.     

基因枪介导pVAX1-2PFcGB融合肿瘤抗原基因疫苗小鼠体内抑瘤活性研究

目的:探讨基因枪免疫pVAX1-2PFcGB融合肿瘤抗原基因疫苗对小鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:在基因枪介导下,向接种EMT6乳腺癌肿瘤细胞的Balb/c小鼠导入融合肿瘤抗原基因疫苗pVAX1-2PFcGB,通过观察计算免疫动物的成瘤时间、肿瘤体积、抑瘤率来评价该基因疫苗的抗肿瘤作用。结果:基因枪介导的pVAX1-2PFcGB融合肿瘤抗原基因疫苗能够明显推迟和抑制移植瘤的生长,显示出明显的抗肿瘤效果。结论:基因枪介导的DNA疫苗pVAX1-2PFcGB能够有效诱导机体的免疫应答,预防和抑制小鼠移植瘤的生长。     

轮状病毒DNA疫苗经不同途径接种诱导体内免疫应答研究

目的:通过研究不同途径接种轮状病毒DNA疫苗所诱导的体内免疫应答,寻找其适合的免疫途径.方法:轮状病毒基因疫苗pcDNA1/VP7经肌肉注射及鼻粘膜两种途径免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法对其诱导产生的体液免疫应答进行测定.结果:经肌肉注射及鼻粘膜两种途径接种轮状病毒DNA疫苗后,均在BALB/c小鼠体内诱导产生了病毒特异性IgG增高(P＜0.05),而病毒特异性IgA与对照组相比无显著性差异.结论:肌肉注射及鼻粘膜两种途径均能作为轮状病毒DNA疫苗的候选接种途径.     

DNA疫苗黏膜免疫的研究进展

DNA疫苗是一种控制感染性疾病的新制剂,目前大多数DNA疫苗是通过注射途径进行免疫,这种方法在黏膜上皮中很少产生免疫反应,而黏膜恰恰是病原体进行传播的主要部位。通过黏膜免疫能更有效地抵抗多种病原微生物感染。因此鉴于黏膜免疫的重要性,DNA疫苗黏膜免疫也越来越被人们所重视。本文主要对DNA疫苗黏膜免疫的研究进展作综述。     

阳离子脂质体介导IL-2基因治疗SCCⅦ移植瘤的初步研究

目的：探讨多价阳离子脂质体介导的白细胞介素2（IL－2）基因治疗头颈鳞癌的最佳比例和免疫机理。方法：利用SCCⅦ细胞株在C3H／HeJ小鼠口底建立头颈鳞癌荷瘤动物模型。用不同比例的脂质体与DNA混合物及裸DNA进行体内外转染，用ELISA方法检测其转染后IL－2基因的蛋白表达水平，用乳酸脱氢酶（LDH）法检测荷瘤小鼠脾脏的自然杀伤细胞（NK）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性。结果：最佳IL－2分泌水平在体外细胞株与体内瘤内转染时的脂质混合物比较不一致。与裸DNA和空载体相比，合适比例的脂质混合物转染可增强脾脏NK和CTL的杀伤活性。结论：脂质复合物在瘤内直接基因转染的良好效能取决于其合适的构成比例，体外细胞转染的最佳脂质混和物比例不能作为体内转染的参考；与裸DNA转染相比，多价阳离子脂质体适于作为头颈肿瘤进行直接瘤内基因治疗的非病毒载体。     

日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-Sj26(Sj32)-Sj23免疫效果的观察

为了观察血吸虫病多价DNA疫苗的保护力,将小鼠分成5组空白对照组、空质粒对照组、单价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj23组、多价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj26-Sj23和pBK-CMV-Sj32-Sj23组.大量提取各组质粒DNA后,各组于0、3、5周在BALB/c小鼠股四头肌注射相应质粒DNA,9周用血吸虫尾蚴攻击感染,15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率.结果显示与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性差异(P<0.01);与单价pBK-CMV-Sj23组比较,多价DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性差异.提示血吸虫多价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗.     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

乙肝表面抗原核酸疫苗的构建及其与宿主染色体整合的可能性分析

目的：构建乙肝表面抗原DNA疫苗，并探讨其在实验动物体内整合到宿主细胞基因组上的可能性。方法：采用PCR法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pVAX载体，并以此为修选疫苗免疫（BALB/c）小鼠，在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA，用PCR检测DNA整合情况。结果：构建了乙肝核酸疫苗pVAX-HBsAg。免疫接种该疫苗第3周时在小鼠肌肉、肝脏、脾脏、胸腺均有不同量的游离质粒存在；第6周除在股四头肌可检测到外，其余组织中均为阴性；第12、18周时检测所有组织中均为阴性。结论：构建的pVAX-HBsAg DNA疫苗在小鼠体内无染色体整合。     

基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及免疫效果研究

目的 构建pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒,并检测其免疫效果.方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法提取急性单核细胞白血病相关抗原基因MLAA-34和热休克蛋白(HSP) 70基因,设计特异性重叠引物,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增MLAA34-HSP70融合基因,构建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70.将核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤作用及小鼠脾细胞悬液中白细胞介素(IL)-2、IL-4和γ干扰素(IFN-γ)水平.结果 扩增出MLAA34-HSP70融合基因2 956 bp,成功构建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70,经鉴定与预期结果一致;脾淋巴细胞杀伤活性结果显示,核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70对U937细胞的杀伤效率明显高于其他实验组及对照组(P＜0.01);核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70组细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明显高于其他实验组及对照组(P＜0.01).结论 成功构建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗,该核酸疫苗能诱发强烈的体液免疫,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答,对MLAA34阳性细胞具有特异性杀伤作用.     

人类免疫缺陷病毒DNA疫苗黏膜免疫小鼠免疫力研究

目的以人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)疫苗免疫BALB/c(H-2d)小鼠为模型,探讨有效活化黏膜与系统免疫力的策略。方法将6~8周龄BALB/c小鼠随机分为6组,每组3只;利用DNA疫苗加或不加疫苗佐剂滴鼻途径进行黏膜引导免疫,利用重组痘苗天坛株疫苗进行系统加强的策略以提高机体免疫反应。DNA疫苗免疫时间是0、14、28d,剂量每只小鼠10μg/次;重组痘苗病毒加强免疫时间是第42天,剂量每只小鼠1×107PFU/次。初次免疫后第56天处死小鼠。ELISPOT和胞内染色测定T淋巴细胞免疫反应;ELISA法测血清特异的IgG和鼻咽部、肺部灌洗液特异的IgA。结果单独DNA疫苗黏膜免疫后只活化微弱的系统T细胞免疫(2±1)斑点形成细胞(spotformingcells,SFC/106个细胞),黏膜共同施用霍乱毒素可提高相应的系统T细胞免疫力(14±11SFC/106个细胞),重组痘苗天坛株疫苗系统加强后,分泌γ-干扰素(IFN-γ)的特异性T淋巴细胞升高4·5倍(61±35SFC/106个细胞);胞内染色可获得1·8%±1·4%HIV-1Gag特异性CD8+T细胞免疫反应,同时,血清中特异性IgG抗体与肺部灌洗液的特异性IgA抗体水平在痘苗天坛株疫苗系统加强后分别提高2倍吸光度(A)值:1·5±0·3和2·5倍(A值:1·8±0·8)。结论黏膜进行引导免疫并辅以系统加强的免疫策略可诱发有效的黏膜、系统体液免疫反应和T淋巴细胞免疫。     

Enhancement of DNA vaccine-induced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer

Background Although DNA vaccine is considered as the next generation of vaccine, most DNA vaccine candidates are still suffering from the relatively weak immunogenicity despite the increased dosage of plasmid DNA administered. In order to enhance the immune responses elicited by a codon-optimized HIV gag DNA vaccine, a modified plasmid vector pDRVI1.0 and a booster immunization with replicating Tiantan vaccinia （RTV） strain expressing the same gene were employed. Methods Vector pDRVI1.0 was constructed through inserting the 72-bp element from the SV40 enhancer, which was reported promoting nuclear transport of plasmid DNA, to the upstream of cytomegalovirus enhancer/promoter region of the plasmid vector pVR1012. Gene expression levels from expression plasmids based on pDRVI1.0 and pVR1012 were tested. Humoral and cellular immune responses induced by DNA vaccine alone or DNA prime-RTV boost regimen were determined in mice. Results It was shown that the 72-bp element significantly enhanced the gene expression level in non-dividing cells. gag-specific humoral and cellular immune responses induced by DNA vaccination were both significantly improved, while the Thl/Th2 balance was not obviously affected by the 72-bp element. RTV boosting further significantly enhanced DNA vaccine-palmed antibody and T cell responses in a Thl-biased manner. Conclusions The 72-bp SV40 enhancer element should be included in the DNA vaccine vector and RTV strain is a very efficient live vector for boosting immunization.     

弓形虫复合基因疫苗研究进展

弓形虫疫苗包括全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、DNA 疫苗、基因工程疫苗,现阶段研究较多的是后两种,由原来的单一疫苗向复合疫苗发展,复合疫苗有多种联合方式：表面抗原联合、表面抗原与分泌抗原联合、其他类型抗原联合,疫苗免疫效力低下的缺点可采用有效免疫方式或使用佐剂提高效果。     

FQ2在日本血吸虫DNA疫苗诱导免疫机制的研究

目的 探讨佐剂FQ2与日本血吸虫DNA26Kda疫苗共同作用下小鼠的免疫状态。方法 选取4～6周龄BALB/C小鼠52只，分成生理盐水组、FQ2组（A）、Sj26GST组（B）和FQ2＋Sj26GST组（C）等4组，于第0、2、6周各免疫1次，接种后4周以日本血吸虫尾蚴攻击感染，感染后6W剖杀小鼠，分析脾脏T淋巴细胞CD4^＋和CD8^＋细胞率，测定血清中特异性IgG水平。结果 B组和C组均可诱导CD8^＋淋巴细胞的增殖。C组升高更为显著，CD4^＋/CD8^＋比率倒置，也均可于4周后诱导小鼠产生高滴度的IgG抗体，二组间差异无显著（P〉0．05）。结论 FQ2对Sj26GST DNA疫苗有明显的增效作用，推测增效作用主要由细胞免疫所介导。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

CEA串连表位-HSP70融合基因疫苗诱导小鼠的表位特异性免疫应答

目的：观察癌胚抗原(CEA)串联表位-HSP70融合基因疫苗诱导的免疫应答，为开发新型肿瘤特异性基因疫苗奠定基础。方法：在已经构建含有变异热休克蛋白(HSP)序列的基础上，插入重组CEA串联表位的编码片段获得CEA串联表位-HSP融合基因疫苗。3次肌肉注射免疫Balb/c小鼠，设立注射生理盐水的阴性对照组、注射氢氧化铝佐剂混悬CEA串联表位的阳性对照组及注射pCITriCEA_625-667-mtHSP70的实验组。FCM分析脾脏T细胞亚群；体外培养脾细胞，ELISA检测培养上清中干扰素γ(IFNγ)的相对含量；同时测定小鼠血清CEA特异性抗体的滴度。结果：阴性对照组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为55.1%±6.1%和30.2%±4.1%；实验组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为78.7%±9.2%和48.9%±4.7%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。其体外特异性抗原肽诱导的IFNγ分泌处于本底水平，可视为生理性参数，体外非特异性和特异性的IFNγ分泌分别增加3和6倍(P<0.01)。血清中CEA表位特异性抗体滴度阴性对照组为0，阳性对照组＜1∶500,而融合基因疫苗免疫组达到1∶4 000。结论：CEA串联表位-HSP融合基因疫苗在体内诱导以激发辅助性T细胞为特征的免疫应答。