新型树突状细胞疫苗的构建及功能的初步鉴定

目的:构建可同时实现沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激和肿瘤相关抗原负载的新型树突状细胞(DC)疫苗。方法:构建沉默SOCS1并共表达HMGB1及肿瘤相关抗原NY-ESO-1的质粒(p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1)。体外诱导单核细胞分化为DC,将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞。同时设立未转染组、shNC/GFP转染组和p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组。PCR和Western blot验证基因及蛋白表达后,酶联免疫吸附(ELISA)法检测DC细胞分泌的肿瘤坏子因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-12、IL-1及IL-6的变化。结果:经测序证实所构建质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒结构正确。成功将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞,并在基因和蛋白水平验证NY-ESO-1的正确表达,HMGB1可在胞浆内表达。SOCS1 shRNA质粒shS可沉默SOCS1表达。p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组DCTNF-α、IL-12、IL-1及IL-6分泌量较未转染组和shNC/GFP转染组升高(P<0.05)。结论:成功构建可同时实现沉默SOCS1、HMGB1刺激和肿瘤相关抗原负载的新型DC疫苗。     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达重组鼠白细胞介素(IL)-2蛋白。方法:用Flag标记鼠IL-2并加入真核细胞启动子CMV,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒,收获重组杆状病毒,将构建病毒转导BHK细胞培养,用Western blot检测IL-2蛋白。结果:通过杆状病毒表达系统,在BHK细胞成功表达重组的鼠IL-2蛋白。结论:重组杆状病毒在真核细胞中成功表达重组鼠IL-2蛋白。     

肌肉注射卵白蛋白/白细胞介素18融合DNA可有效诱导抗原特异性Th1型免疫应答

Th1型细胞可选择性分泌白细胞介素 2( IL- 2 )、γ干扰素 ( IFN- γ)和 β肿瘤坏死因子( TNF- β) ,调节以补体结合和调理抗体 (如Ig G2 a同种型抗体 )产生为特征的细胞介导免疫。作者构建了一种携带卵白蛋白 ( OVA)和 IL - 1 8( IFN-γ诱导因子 ) c DNA融合基因的哺乳动物细胞表达质粒 p OVA/IL- 1 8,并在 C57BL/6小鼠中研究了其是否能有效诱导抗原特异性 Th1型免疫应答。　　作者首先对含 SV4 0复制起点并表达免疫球蛋白基因的哺乳动物细胞表达质粒进行修饰 ,以去除其中绝大部分免疫球蛋白编码区及新霉素抗性基因 ,随后分别…     

重组CEA和IL-2抗肿瘤基因疫苗的构建及其抗肿瘤作用研究

目的成功构建重细CEA、CEA／IL-2抗肿瘤基因疫苗,并检测其激活的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。方法将CEA、CEA／IL-2基因导入真核表达质粒pcDNA3．1,并转染入DC细胞,通过转染DC细胞活化淋巴细胞,将活化的淋巴细胞与人CEA＋肝癌细胞共培养,检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果重组CEA、CEA／IL-2组均检测出较强的抗肿瘤效应,且重组CEA／IL-2组与重组CEA组差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论联合CEA／IL-2基因疫苗具有抗肿瘤作用,且其抗肿瘤作用明显优于单基因CEA基因疫苗,证实了重组肿瘤基因疫苗对肿瘤细胞的杀伤作用。     

白细胞介素-35慢病毒表达载体的构建及稳转A549细胞系的建立北大核心CSCD

目的构建过表达白细胞介素(IL)-35的慢病毒载体,包装慢病毒并感染肺癌细胞A549建立过表达IL-35的A549稳定细胞株,为研究IL-35在肺癌发生发展中的作用奠定基础。方法根据基因序列及所用载体序列设计用于无缝克隆的引物序列,用聚合酶链式反应(PCR)扩增IL-35基因,EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切PCR产物及载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro,经载体重组、转化、PCR鉴定和测序鉴定等获得重组质粒。将筛选出的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒浓缩液并检测其滴度。病毒浓缩液感染A549细胞,用Real-time PCR和Western blot方法检测稳转细胞系中IL-35的表达。结果测序结果与预期完全符合,成功构建过表达载体IL-35-pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro。pCDH-GFP组及pCDH-IL-35-GFP组的慢病毒滴度分别为5.1×10~8和1.03×10~9TU·mL^(-1)。Western blot和real-time PCR显示,A549-IL35组的EBI3及P35蛋白相对表达量分别为0.27±0.05和0.75±0.02,A549-pGFP组的EBI3及P35蛋白相对表达量分别为0.06±0.01和0.24±0.01,A549-IL35组的EBI3及P35 mRNA的相对表达量分别为444.75±37.31和309.78±53.92,A549-pGFP组的EBI3及P35 mRNA相对表达量分别为1.03±0.05和1.04±0.03,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论成功构建了过表达IL-35的慢病毒载体和过表达IL-35的A549稳定细胞株。     

含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

IL-1β基因多态性影响乙型肝炎疫苗免疫接种

细胞因子白细胞介素 1 β( IL- 1 β)的单核苷酸多态性 ( SNP)在个体间的乙型肝炎疫苗免疫应答多样性中起重要作用。IL- 1 β等位基因 ( + 3953)与疫苗免疫效果有关。　　在 92名抗 - HBs阴性志愿者中 ,用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性技术进行基因分型。 IL - 1β( + 3953)等位基因 1 .1型占54%,1 .2型占 4 0 %,2 .2型占 5.4 %。按 0、1、6月程序接种 2 0 μg重组乙型肝炎疫苗Engerix- B,于不同时间采血检测。用微粒酶免疫法 ( MEIA)测抗 - HBs,首次接种后 35天( T35)可检测到抗体 ,各基因型组的抗体滴度随时间的推移均有显…     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒载体的构建及表达

目的 研究携带人细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)4-Ig融合基因的非增殖腺病毒载体的生物学特性.方法 构建含人CTLA4-Ig的非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig,与非增殖腺病毒骨架质粒pAdEasy共转化大肠杆菌DH5α,在细菌内同源重组,获得重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-hCTLA4-Ig,转染293细胞,经过包装、扩增、纯化后,获得携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒.体外感染人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞,72 h后检测其外分泌性表达.结果 获得携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒,滴度为6×1013空斑形成单位/毫升(pfu/ml);在其感染的人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞培养上清液中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4-Ig的表达.结论 制备的重组非增殖腺病毒在体外能有效感染人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞,受感染细胞能表达、分泌可溶性蛋白CTLA4-Ig.     

以减毒沙门菌将重组细胞因子导向免疫系统的新免疫疗法

作者用减毒沙门菌作为编码白细胞介素4 ( IL - 4)和 IL - 1 8的原核表达质粒传递系统 ,并评估其在不同实验模型中调节免疫应答的能力。　　作者首先将鼠 IL- 4和 IL- 1 8基因的编码序列克隆于由巨细胞病毒 ( CMV)启动子控制的 VR1 0 1 2质粒 ,然后将这些构建体电穿孔入伤寒杆菌 CVD90 8- htr A株和鼠伤寒杆菌 SL 32 6 1株。此外 ,将 3X FL AG序列插入 IL- 1 8序列的 N端构建成 IL- 1 8修饰质粒 ,并将此质粒电穿孔入 CVD90 8- htr A( VR1 0 1 2 - FLAG- IL 1 8)。小鼠鼻腔免疫CVD90 8- htr A( VR1 0 1 2 - FLAG- IL1 8…     

携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.     

用自身复制型RNA疫苗治疗癌症

裸核酸疫苗曾被认为可用于癌症的治疗 ,但其临床效果尚未证实。本文作者通过使用西门利克森林病毒 RNA复制酶的编码基因与模型抗原结合 ,使其能自身复制 ,从而增强核酸疫苗的免疫原性。　　作者选用β- gal作为模型抗原构建了Rep- L ac Z RNA,并设立 Rep缺失 Lac Z、空Rep Lac ZRNA作为对照。试验结果显示 ,与对照相比此疫苗具有许多优点。 Rep- L ac ZRNA转染 BHK2 1细胞后 ,能产生大量 β-gal;即时定量逆转录酶 -聚合酶链反应显示 ,转染后 1 0小时 ,其 RNA量与细胞 1 8sr RNA相同 ,证明它确实得到了扩增 ;用此RNA免疫小鼠 …     

牛痘病毒和表达异源基因的牛痘病毒重组株的抗原特性

用牛痘病毒(VV)作为载体表达HBsAg等病毒抗原已证明是可行的。但是,要用VV来生产新一代疫苗,必需研究外源性基因的插入和表达对VV原有的各种特性的影响。为此,作者比较了VV原始株和VV重组株的免疫学、理化学和形态学特性。在VV原始株LIVP的基因内插入HBsAg基因,组成SHV LG-TK-重组株,表现为TK阴性。在该株中再插入1型单纯疱疹病毒(HSV)TK基因,组成SHV LG-TK~+株,恢复了TK阳性表型。经电镜观察,SDS-PAGE     

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体表达载体的制备

目的构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体。方法首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（sTRAIL）基因的穿梭质粒腺相关病毒穿梭质粒-可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（pAAV-sTRAIL），将穿梭质粒转染入HEK293细胞（人胚肾细胞系）中，采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆rAAV-sTRAIL；PCR法鉴定阳性rAAV-sTRAIL；氯化铯密度梯度离心法纯化rAAV-sTRAIL；紫外分光光度仪测定rAAV-sTRAIL颗粒数及纯度，噬斑分析法测定rAAV-sTRAIL感染滴度；Western免疫印迹检测rAAV-sTRAIL在HEK293细胞中的表达情况。结果成功构建了rAAV-sTRAIL，制备的病毒纯度好、滴度高，且在HEK293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL，为研究TRAIL抗肿瘤细胞效应及临床应用提供先进的载体系统。     

抗人癌胚抗原(CEA)口服DNA疫苗能阻止Lewis肺癌在CEA转基因小鼠体内生长和扩散

本文旨在验证编码人癌胚抗原 ( CEA)全基因的 DNA疫苗在免疫 CEA转基因小鼠后 ,能诱导主要组织相容性复合体 ( MHC) 类抗原限制性 CD8+T细胞介导的肿瘤保护性免疫 ,该免疫能阻止 L ewis肺癌的生长和在肺部的转移 ,更重要的是 ,该疫苗的抗肿瘤作用能通过加强注射重组抗体 -细胞因子融合蛋白将白细胞介素 2 ( IL- 2 )导向肿瘤微环境而显著增强。　　作者构建了两种疫苗。一种是 p W- CEA疫苗 ,它能表达 CEA全基因 ;另一种是 p ER-CEA疫苗 ,它缺失了内源性前导序列和羧基末端的锚定序列 ,不具备表达 CEA的功能 ,为 p W- CEA疫苗…     

携带人生存素基因短发夹RNA表达载体重组腺病毒的构建及其生物学作用

目的构建携带人生存素(survivin)基因短发夹RNA(shRNA)表达载体的重组腺病毒。方法构建并筛选重组质粒pShuttles-urvivin,将其与腺病毒骨架质粒共转染HEK-293细胞,经同源重组产生腺病毒;PCR鉴定并测定病毒滴度;β-半乳糖染色检测病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的感染效率;流式细胞术、RT-PCR和W estern免疫印迹法检测其生物学功能。结果经PCR鉴定重组腺病毒构建成功;48 h后感染率达75%以上;腺病毒感染MCF-7细胞后48 h,生存素mRNA和蛋白的表达均受到抑制;腺病毒感染MCF-7细胞后,细胞分裂受阻于G2/M期,在48和72 h有凋亡峰出现。结论成功构建人生存素基因shRNA表达载体的重组腺病毒。     

重组痘苗病毒诱导的抗口蹄疫病毒的保护性免疫力

本文报道利用空斑形成分离重组痘苗病毒的方法来构建表达口蹄疫病毒 ( FMDV)C3Arg85株四种结构蛋白前体的重组痘苗病毒 ,并将其作为活疫苗 ,在小鼠中进行试验。　　将从质粒 p UC1 9- P1中获得的 FMD-VC3Arg85株 P1基因插入 p RB2 1质粒的Sma I位点构成重组质粒 p RB2 1 - P1或p RB2 1 ,再将其转染痘苗病毒 v RB2 1感染的CV- 1细胞构成重组痘苗病毒 v RB1 2 - P2 1和v RB1 2 - P1。以 6 0～ 90日龄雌性 Balb/c小鼠和新生小鼠为试验动物 ,分别腹腔注入 1 0 7空斑形成单位 ( PFU)的 v RB1 2 - P2 1、1 0 7PFU的 v RB1 2 - …     

人白细胞介素-24治疗人宫颈癌荷瘤裸鼠的实验研究

目的探讨人白细胞介素(hIL)-24基因重组质粒对人宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其作用机制。方法建立荷宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤模型,15只裸鼠随机分为3组:白细胞介素(IL)-24重组质粒组,空质粒组,磷酸盐缓冲液(PBS)组,根据肿瘤体积的生长情况绘制肿瘤生长曲线;处死裸鼠后切取瘤体并称质量,计算肿瘤抑制率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果体内实验表明,IL-24重组质粒能够抑制肿瘤的生长,IL-24重组质粒组移植瘤的体积明显小于空质粒组和PBS组(P<0.05),空质粒组和PBS组移植瘤体积则差异无统计学意义(P>0.05)。IL-24重组质粒组抑瘤效果显著,其抑瘤率为56.5%,差异有统计学意义(P<0.05),空质粒组抑瘤率为1.3%,差异无统计学意义(P>0.05)。经流式细胞术检测,与空质粒组和PBS组比较,IL-24重组质粒组G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少,G2/M期细胞减少(P<0.05),细胞被阻滞在G0/G1期,空质粒组和PBS组则差异无统计学意义(P>0.05)。结论于荷瘤裸鼠的瘤内注射IL-24重组质粒可抑制肿瘤生长,提示IL-24具有明显的体内抗肿瘤作用。     

能增强抗原特异性免疫应答的新局部接种法

DNA疫苗局部接种于皮肤是一种有用的接种方法 ,但其诱导的免疫应答水平较低。为了克服这一难题 ,作者采用了一种新的局部接种技术 ,即先用快速作用粘合剂去除小鼠皮肤角质细胞 ,然后再将表达细胞因子〔白细胞介素 1 2 ( IL- 1 2 )和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ( GM- CSF)〕的质粒 ( p IL- 1 2和p GM- CSF)和 1型人类免疫缺陷病毒 ( HIV-1 ) DNA质粒 ( p CMV1 6 0 B/pc REV)涂于皮肤进行局部接种。　　作者分别在 0、7和 1 4天将 1 0～ 1 0 0 μgDNA表达质粒涂于去除角质层的雌性BALB/c小鼠皮肤 ,于末次加强后 7天和 3个月…