呼吸道病毒检测方法的研究进展

呼吸道病毒是一组能够通过呼吸道感染引起呼吸系统及其他系统疾病的病毒.常见的呼吸道病毒有正粘病毒科的流感病毒,副粘病毒科的副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒,以及冠状病毒科的冠状病毒,披膜病毒科的风疹病毒和腺病毒科的腺病毒等.近年来新的致病性病毒不断地被发现,如人类偏肺病毒、人博卡病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等.对于呼吸道病毒来讲,同一种病毒可引起多种临床症状,不同的病毒可引起同一种临床症状,给临床诊断和治疗造成很大的困难,所以这类病毒的检测确诊对于采取有效的预防和治疗措施极为重要.     

TTV酶联免疫方法的建立及其初步应用

目的 建立检测TTV的酶免疫技术,了解不同型肝炎患者血清中抗－TTV抗体的分布情况,并结合TTV DNA的检测分析两者的关系。方法 以原核表达的TTV ORF1蛋白为抗原建立检测抗－TTV的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法,采用该方法检测不同肝炎患者中抗－TTV抗体;在套式聚合酶链反应（PCR）方法检测血清标本中TTV DNA。结果 所建立的检测TTV的ELISA方法具有较好的特异性,不同别肝炎患者中抗－TTV抗体阳性率分别为：甲型肝炎患者10.5%（4／38）,乙型肝炎患者12.5%（16／128）,丙型肝炎患者8.3%(7/84),丁型肝炎患者7.7%(30/93),健康人群1.3%(1/78)。统计学分析表明,非甲－庚型肝炎患者抗－TTV阳性率显著高于其他型肝炎患者（P＜0.01）,而正常人群则显著低于肝炎患者（P＜0.05）。抗－TTV阳性率与TTV DNA阳性率存在相关性（P＜0.05）。结论 在不同型肝炎患者中均可检出抗-TTV抗体,但以非甲－庚型肝炎患者阳性率高;TTV抗体可与基因同时存在于患者血清中,抗－TTV抗体可能类似抗－HCV, 是一传染性标志。     

微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立

登革病毒1～4型（dengue virus type 1-4，DV1-4）、流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）及黄热病病毒（yellow fever virus，YFV）均为黄病毒属的重要传染病病原，其流行季节及临床症状都极为相似，且暴发日益频繁，发展特异、敏感的快速诊断及鉴别诊断方法，对这类疾病的预防及控制具有重要意义。本研究在对其基因组序列系统分析的基础上，建立了快速检测及鉴别诊断上述病毒的微孔杂交（PCR-ELISA）方法。     

脊髓灰质炎病毒三类检测方法的灵敏度比较

目的 对三种脊髓灰质炎病毒检测方法的灵敏度进行比较.方法 将Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(TR株),从1×101倍系列稀释至1×107倍.选用三类方法对制备的脊灰病毒稀释液系列进行检测,比较不同检测方法的灵敏度,三类方法分别为:RD和L20B细胞分离脊灰病毒、肠道病毒通用引物EV1/EV2和脊灰病毒特异性引物UC11/U...     

阿瓦朗病毒和休斯病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立可以检测阿瓦朗病毒(Avalon virus,AVAV)和休斯病毒(Hughes virus,HUGV)两种内罗病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并进行初步的评价。方法收集、整理、比对、分析在公共数据库发布的两种病毒基因组核苷酸序列,确定检测靶标,设计特异性引物、探针,优化检测程序,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用体外转录技术制备的模拟样本、其他病毒感染标本、病毒株和正常人血标本比较评价所建方法的检测限、特异性、重复性特征。结果所建实时荧光定量RT-PCR检测方法可有效扩增检测AVAV和HUGA靶标RNA,检测限分别约为20拷贝/μl和70拷贝/μl,检测科萨努尔森林病毒、乙型流感病毒BV和BY型、甲型流感病毒H3N2、黄热病毒、乙型脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、发热伴血小板减少综合征、内罗毕羊病毒和塔西那病毒样本无非特异性扩增,两种内罗病毒相互间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数小于2%。结论本研究建立的检测AVAV和HUGV的实时荧光定量RT-PCR方法,可用于临床样本检测和媒介生物、宿主动物标本筛查,便于病原的快速识别和疾病诊断。     

马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速、敏感、特异的双重实时荧光定量PCR方法,可同时检测马尔堡病毒和埃博拉病毒.方法 通过序列比对挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列,分别设计引物及Taqman探针,两条探针分别标记FAM和Texas Red荧光报告基因,建立双重实时荧光定量PCR反应体系.结果 双重荧光定量PCR方法检测两种病毒阳性标准品的灵敏度分别为30.5拷贝/μl和28.6拷贝/μl,通过检测日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应,有较好的灵敏度和特异性.结论 建立了马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法,实现了两种病毒同时实时定量检测,在传染病防控领域有较好的应用前景.     

鉴别病毒受体方法的研究进展

病毒与易感细胞上的受体分子相结合 ,是病毒进入细胞的第一步 ,也是病毒嗜性的基础。这些受体分子介导的病理过程很可能与病毒的致病机制相关 ,鉴别病毒的受体对于了解其组织嗜性和病理机制 ,制定预防和治疗措施有着重要的意义。而且也为了解病毒与细胞的相互作用 ,病毒的感染周期等有趣的问题提供了最基础的切入点。本文谨就识别病毒蛋白受体的几种方法的研究进展综述如下。1　筛选易感细胞的ｃＤＮＡ文库鉴别受体蛋白这是一种既经典又在不断发展的方法。易感细胞的易感性来源于细胞内编码受体蛋白基因的表达 ,建立所有表达基因的ｃＤＮＡ…     

实时定量PCR检测马传染性贫血病毒载量方法的建立和应用

目的建立实时定量PCR检测血浆病毒载量的方法，对马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus，EIAV）强毒株攻毒马和疫苗免疫攻毒马血浆中病毒载量进行了跟踪检测，探讨病毒载量和临床疾病状态的相关性。方法以EIAV强毒株LN40序列为标准，在gag保守区设计1对引物和Taqman探针，用于实时定量PCR扩增，用含扩增目的基因的体外转录RNA作标准品，获得标准曲线，对扩增样品进行准确定量。强毒株LN40直接攻毒，或者疫苗株DLV免疫马6个月后用强毒株LN40进行攻毒，跟踪检测攻毒马及免疫攻毒马血浆中EIAV载量情况。结果反应在10^1～10^9copies／ml之间具有良好的线性关系，反应的检出下限为10copies／ml。强毒攻毒马出现发热并最终死亡，发热期间马血浆中EIAV载量与体温呈正相关，载量最高达10^7copies／ml。免疫攻毒马未出现发热，其血浆EIAV载量的总体水平低于强毒攻毒马，攻毒后3个月低至10copies／ml以下。结论成功建立了实时定量PCR检测血浆EIAV载量的方法，并证实了用实时荧光定量PER检测EIAV病毒载量的方法来监测动物感染状态具有可行性，为EIAV致病机制研究和弱毒疫苗免疫保护机制的研究提供良好的技术平台。     

人冠状病毒HKU1血清学检测方法的建立及其初步应用

目的 表达HCoV-HKU1的壳蛋白（N蛋白）及棘突蛋白（S蛋白）,建立检测血清中相应抗体的方法.方法 使用原核表达系统表达纯化HCoV-HKU1的N蛋白,转膜制条建立基于蛋白印迹的N抗体检测方法.构建HCoV-HKU1 S蛋白的真核表达质粒,转染细胞后,用间接免疫荧光（IFA）建立S抗体检测方法.利用已建立的N抗体和S抗体检测方法,检测了100份正常成人血清.结果 经Western Blot检测,S和N蛋白表达正确;利用已建立的血清学检测方法分析100份正常成人血清,其中HCoV-HKU1 S抗体的阳性率为47%,N抗体的阳性率为48哂,S抗体和N抗体均阳性的占总数的21%,双抗体均阴性的占总数的22%.S抗体和N抗体共同检测可获得74%的阳性检出率.结论 所建立的方法可用于HCoV-HKU1血清学分析,共同检测HCoV-HKU1 S抗体和N抗体可获得较好的检测结果.在正常成年中HCoV-HKU1抗体阳性检出率较高.     

氯霉素乙酰基转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立氯霉素乙酰基转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT)双抗体夹心ELISA的实验室检测方法。方法 从质粒pBLCAT6经PCR扩增CAT基因序列，插入到原核表达质粒pGEX-2T中，在大肠埃希菌DH5α中诱导表达；以纯化的融合蛋白GST-CAT为抗原免疫实验用兔，得到的CAT抗血清进行生物素标记，并在此基础上利用生物素链和亲和素放大系统建立双抗体夹心ELISA法，构建不同YY1结合位点突变的HPV16LCRCAT报道质粒，体外瞬时转染真核细胞，提取胞质蛋白，以建立的方法进行CAT表达检测。结果 SDS-PAGE显示表达的GST-CAT融合蛋白相对分子质量约为54000；制备的CAT抗血清可有效地识别原核及哺乳动物细胞表达的CAT蛋白；在不同启动子及调节序列的控制下，利用建立的CAT检测技术证明在瞬时转染的细胞中可诱导2-8倍的CAT表达增强。结论 建立的双抗体夹心ELISA方法可敏感地反映上游序列的启动子活性，以及启动子调节序列变化对启动子活性的影响，使CAT作为报道基因的研究更为简单化。     

反转录PCR和免疫学方法检测丙型肝炎病毒感染的比较

本文应用反转录多聚酶链反应(cPCR)和酶联联免疫吸附试验(ELISA)方法检测18例经多次输血并有肝功能改变的急性白血病患者血清中丙型肝炎病毒基因(HCV RNA)和抗丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV).HCV RNA 阳性率77.8%;抗-HCV 阳性率66.1%;单项或两项阳性者16例,联合判定 HCV 感染率88.9%。cPCR 检出 HCV RNA 时间早于抗-HCV 阳转时间,而且敏感性高于后者,是一种早期、灵敏及特异的 HCV 感染诊断方法。同时检测 HCV RNA 和抗—HCV,两项互补判定可望提高 IICV 感染的诊断率。     

病毒核酸定量测定方法及其存在的问题

随着科学技术的不断进步，人们不但能够对病毒核酸进行定性检测，如今发展到还能够定量检测病毒核酸分子，有关定量测定病毒核酸的方法已有学者作过总结和介绍，但病毒核酸定量测定过程中存在的问题，却很少有人总结报道，本文根据作者在实际工作中发现的问题和参考国外有关文献，着重在这方面进行总结，但为了更好的说明这个问题，首先对定量测定病毒核酸的方法作一简要介绍。     

乙型肝炎病毒前S2抗原／抗体检测方法的改进及其应用

通过改进乙型肝炎病毒表面前Ｓ２抗原（Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｇ）、前Ｓ２抗体（Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ）的检测方法,对１２８份正常人标本Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ进行测定,确定了Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ抑制率的阳性界值。用改进后的方法检测不同人群中的Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｇ及Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ,发现在慢性乙型肝炎患者中Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｇ比ＨＢｅＡｇ／Ａｂ系统更能反映机体的ＨＢＶＤＮＡ复制水平（Ｐ＜０．０１）,而Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ的检出则与急性乙型肝炎的预后密切相关,同时,Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ也可作为评价含有Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｇ的乙肝疫苗主动免疫效果的指标。     

辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立

目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法。方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBRGREENΙ荧光PCR和常规RTPCR扩增,并对SYBRGREENΙPCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃,最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBRGREENΙ荧光PCR方法进行检测。结果SYBRGREENΙ荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1PFU/ml。对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响。对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性。结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段。     

基因转移的DNA病毒方法

在基因治疗中,作为基因转移的载体,迄今几乎都用逆转录病毒,但是在某些情况下(例如将外源基因导入非分裂状态的细胞),DNA病毒作为载体具有明显的优越性。本文对腺相关病毒、腺病毒和疱疹病毒作为外源基因载体进行了简要的讨论。     

结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立

目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性;应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析;采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证;采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差;经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.     

不同方法检测淋巴瘤病理标本EB病毒的比较

目的:探讨用不同方法检测淋巴瘤标本中EB病毒LMP-1的表达率以选择一种敏感、可靠的检测手段.方法:运用SP法、CSA法检测EB病毒LMP-1在Raji细胞株细胞学涂片、123例淋巴瘤(其中104例NHL,19例HL)切片中的表达,部分病例结合PCR加以验证.结果:(1)细胞学涂片SP阳性细胞率为70±10%,CSA法100%阳性.(2)HL中,SP法检测LMP-1阳性率为6/19(32%),CSA法阳性率8/19(42%),PCR阳性率为11/19(58%).(3)非霍奇金淋巴瘤(NHL)中SP法阳性率为3/104(其中B-NHL 1/79,1.26%,T-NHL 2/25,8%).CSA法阳性率为9/104,其中B-NHL4/79(5%),T-NHL 5/25(20%),ITCL达 2/10(20%).结论:SP法在检测低丰度抗原时漏检率较高,CSA法为一种较敏感、可靠的检测手段,结合PCR方法可有效检测低丰度抗原.