人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别

【目的】构建人类Foxm1b基因的原核表达载体，表达并纯化蛋白，制备多克隆抗体，并用此抗体检测肝癌细胞中Foxm1b基因的表达，为进一步研究Foxm1b基因的功能奠定基础。【方法】从GenBank中下载人类Foxm1b基因全长cDNA序列并用Pegene软件分析其可能的抗原表位，设计引物．应用RT—PCR获得含抗原表位的Foxm1b基因片段，重组人原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL-21（DE31中诱导表达，应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫大鼠制备多克隆抗体，用ELISA检测抗体滴度并用免疫细胞化学的方法检测此抗体对肝癌细胞中天然Foxm1b蛋白的识别。【结果】成功构建了Foxm1b基因重组表达载体pET-28a—Foxm1b，表达的蛋白经纯化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗体．该抗体可以识别肝癌细胞中的天然抗原。【结论】人类Foxm1b基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及有诊断价值的抗体的制备为后续的研究提供了基础。     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

一个新的人信号识别微粒受体基因APMCF1的克隆、表达和抗体制备

目的：克隆人类新基因APMCF1，原核表达并制备其特异性多克隆抗体．方法：运用5’末端快速扩增方法，结合Genbank数据库进行电子拼接，完善APMCF1的5’端序列；利用RT-PCR方法，扩增出APMCF1的蛋白编码cDNA序列，克隆入pGEX-KG中，构建APMCF1的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达后获得了GST-APMCF1融合蛋白，以此融合蛋白为免疫原制备兔抗血清，用Western blot鉴定抗体特异性．结果：通过RACE及电子拼接，完善了APMCF1的5’端序列，其cDNA长度为1745bp，与鼠信号识别微粒受体β亚基序列同源性较高，染色体定位于3q22．2；克隆了APMC2F1 816bp的开放读框序列并表达了GST-APMCF1融合蛋白．制备了特异性兔抗GST-APMCF1多克隆抗体．结论：APMCF1可能是编码人类信号识别微粒受体β亚基的基因．该分子多克隆抗体的初步制备，为进一步研究APMCF1的功能提供了必要工具。     

hErmin160蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的:对hErmin氨基端160个氨基酸(hErmin160)蛋白进行表达、鉴定和纯化并制备其多克隆抗体,为研究hEr-min功能奠定基础.方法:PCR扩增编码hErmin160的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pET41-b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达hErmin160融合蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,经镍柱纯化后,免疫家兔,制备其多克隆抗体,并对免疫后抗血清进行亲和纯化,用Western-Blot检测抗体纯化的效果.结果:测序证实获得hEr-min氨基端前160个氨基酸的编码序列;SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为51 ku,与理论值相符;灰度扫描分析hErmin160融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的10%,纯化产物纯度达92%;Western Blot确认所表达的蛋白;抗血清和纯化后的多克隆抗体Westerm Blot反应均为阳性.结论:利用大肠杆菌融合表达系统,获得了较高纯度的可溶形式hErmin160融合蛋白,并通过亲和纯化成功制备hEr-min160多克隆抗体.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

人LINGO-1aa76-319蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1_(aa76-319))融合蛋白,并制备兔源性抗hLINGO-1_(aa76-319)的多克隆抗体(pAb).方法 利用PCR从pCMV-SPORT6获得hLINGO-1_(aa76-319)编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319);将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-hLINGO-1_(aa76-319)融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新两兰大白兔制备多克隆抗血清,Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性.结果 成功构建了pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319)原核表达载体,原核蛋白hLINGO-1_(aa76-319)以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90% 以上的hLINGO-1_(aa76-319)蛋白,蛋白浓度为4600 mg/L,制备的抗hLINGO-1_(aa76-319)多抗效价高达1:1.6×106,Western blotting鉴定其具有良好的特异性.结论 获得高纯度hLINGO-1_(aa76-319)蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究LINGO-1的生物学功能提供实验基础.

Abstract：

Objective To express and purify the fusion protein of extracellular domain of human Ig domain-containing, neurite outgrowth inhibitor (Nogo) receptor-interacting protein-1 (LINGO-1_(aa76-319)) in prokaryotic cells and prepare the rabbit anti-LINGO-1 polyclonal antibody (pAb). Methods The 732 bp DNA sequence of hLINGO-1_(aa76-319), was obtained from pCMV-SPORT6 by PCR and inserted into pET30a (+) plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pET30a(+) -hLINGO-1_(aa76-319) which was subsequently transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni~(2+)-NTA affinity chromatography column. The antiserum against hLINGO-1_(aa76-319) was obtained from the rabbits immunized with hLINGO-1 _(aa76-319), and the titer of the pAb was determined using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and its specificity identified using Western blotting. Results The prokaryotic expression plasmid pET30a (+)-hLINGO-1_(aa76-319) was constructed successfully. Efficient expression of the target fusion protein was achieved with IPTG induction at the optimal concentration of 0.4 mmol/L and culture temperature at 37 ℃ for 2.5 h. The hLINGO-1_(aa76-319) fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion bodies, and the soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedures, and the purified fusion protein showed a purity above 90%. The titer of the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained by immunizing the rabbits with the purified protein reached l:1.6×10~6, and Western blotting confirmed its good specificity. Conclusion The fusion protein hLINGO-1_(aa76-319) with high purity has been obtained and the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained shows a high titer and good specificity, which provide important experimental basis for further functional investigation of LINGO-1.     

人Tenascin-Raa454-1069蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的人Tenascin-R EGFL结构域（Tenascin-Raa454-1069）的融合蛋白,并制备相应的兔源性多克隆抗体（pAb）。方法 利用PCR从PMD18-T-TNR获得Tenascin-Raa454-1069编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-Tenascin-Raa454-1069融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清, Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果 成功构建了pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069原核表达载体,原核蛋白Tenascin-Raa454-1069以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的融合蛋白,蛋白浓度为1 600mg/L,制备的抗Tenascin-Raa454-1069多抗效价高达1∶1.6 ×106,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论 获得高纯度Tenascin-Raa454-1069蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究Tenascin-R的生物学功能提供实验基础。     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

小鼠DHRS4基因原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

目的：构建小鼠pDESTTM17/DHRS4重组载体,制备小鼠抗DHRS4多克隆抗体。方法：应用RT-PCR从小鼠肝组织扩增DHRS4的开放阅读框序列,测序确认后将其编码区构建到载体pDONRTM201上,再通过LR置换反应再将其置换到载体pDESTTM17上,测序后转化到E.coliBL21-AI工程菌中,并经阿拉伯糖诱导表达出抗DHRS4融合蛋白。以小鼠融合蛋白作为免疫原免疫大白兔,制备小鼠抗DHRS4多克隆抗体。结果：成功构建小鼠DHRS4重组载体;转化重组质粒的E.coliBL21-AI经阿拉伯糖诱导4 h后高效表达DHRS4融合蛋白;Western bolt实验结果显示制备的多克隆抗体可特异性检测小鼠肝组织DHRS4相应蛋白的表达。结论：成功构建小鼠pDESTTM17/DHRS4原核表达载体和获得小鼠抗DHRS4多克隆抗体。     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚基的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1亚基，制备兔抗人ASGPR1多克隆抗体。方法以质粒pEA1为模板，设计引物，将聚合酶链反应（PCR）扩增产物H1基因克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1/pET-32c的菌株BL21单菌落至LB肉汤中，1∶100稀释转种后用1 mmol/L终浓度的异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱亲和纯化，用纯化的ASGPR1免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果H1/pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3 kD大小的融合蛋白，用纯化的H1成功制备了兔抗人H1多克隆抗体，并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行免疫印迹技术（Western blot）分析，证实了抗体的正确性。结论应用多克隆抗体可以检测体内外ASGPR H1亚基基因的表达，为临床上测定血清可溶性ASGPR奠定基础。     

斑马鱼ISL1蛋白多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究ISL1作为第二生心区心脏前体细胞的分子标志在心脏发育中的功能,需要获得ISL1蛋白并制备其抗体。方法 根据已报道的ISL1基因序列,以斑马鱼mRNA为模板进行PCR扩增得到ISL1部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。将重组质粒进行酶切测序鉴定,然后利用大肠杆菌E．coli BL21对该重组质粒进行表达。经过IPTG诱导,采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的his-ISL1融合蛋白免疫新西兰大白兔制备ISL1多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价。结果获得了ISL1原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗ISL1多克隆抗体。结论本实验为ISL1在斑马鱼心脏发育中的新功能的进一步研究奠定了基础。     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备。方法应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg1～149aa）的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应。结论获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原（1～149aa）纯度高,免疫原性强。获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应。     

抗人跨膜型肿瘤坏死因子-α多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备特异的能区分人跨膜型肿瘤坏死因子（TM—TNF—α）和分泌型肿瘤坏死因子（sTNF—α）的多克隆抗体。方法借助抗原肽预测软件对TM—TNF—α的抗原表位进行预测，合成TM—TNF—α特异的20个氨基酸的多肽，将之与匙孔碱血蓝蛋白（KLH）耦联。BALB／c小鼠皮背部多点注射，收集分离血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术鉴定其特异性。结果成功免疫BALB／c小鼠，ELISA证实该抗血清与免疫多肽有良好的结合，而与sTNF-α、白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）无交叉反应，流式细胞术显示该抗血清可与细胞系U937表达的TM—TNF—α发生特异性结合。结论成功制备了TM—TNF—α特异性多克隆抗体。为制备TM—TNF—α特异性单克隆抗体莫定了基础，为区分TM—TNF—α和sTNF—α的生物学作用提供了有力的工具。