ATM基因在电离辐射诱导下对BRCA1、RAD51表达的影响

目的 探讨^60Co γ射线照射前、后,BRCA1、RAD51蛋白在GM、ATM＋AT、AT细胞中的 表达。方法 应用免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜,观察GM、ATM＋-AT、AT细胞在0和10Gy^60Co γ射线照射后,BRCA1、RAD51蛋白在上述细胞中的定位及表达并进行定量分析。结果 ^60Coγ射线照射前,BRCA1、RAD51蛋白在GM、ATM＋-AT、AT细胞中仅有少量表达并且无共定位表达,其中在AT细胞中表达量最低;10 Gy ^60Co γ射线照射后,BRCA1、RAD51在GM、ATM＋-AT、AT细胞中表达量增高,其中GM、ATM＋-AT细胞呈现共定位表达,AT细胞无共定位表达;GM、ATM＋-AT细胞中BRCA1、RAD51蛋白表达量与AT细胞比较差异有统计学意义（P＜0.01）;GM细胞中BRCA1、RAD51蛋白表达量与ATM＋-AT细胞比较差异也有统计学意义（P＜0.01）。结论 GM细胞和ATM＋-AT细胞中存在ATM基因,ATM在射线等因素诱导下可以激活其下游基因BRCA1、RAD51,并且使这两种蛋白表达或表达量增加并且相互作用,共同完成辐射损伤后的细胞修复;外源性ATM转入正常GM细胞后,由于外源性的ATM基因不能完全弥补内源性的ATM突变基因的功能,对其下游基因Brca1“部分”磷酸化,表现为BRCA1、RAD51蛋白表达量均较GM细胞低。     

低剂量辐射对小鼠睾丸生精细胞中细胞色素c和caspase-3表达的影响

目的 研究低剂量电离辐射对小鼠睾丸生精细胞细胞色素c（Cytc）和caspase-3蛋白表达的影响。方法 采用免疫组化法（SABC法），观察低剂量X射线照射后，小鼠睾丸各类生精细胞Cytc和caspase-3表达的剂量与时程效应关系。结果 0、0.025、0．05、0．075、0．1和0.2Gy照射后12h，小鼠睾丸各类生精细胞不同程度表达Cyt c和caspase-3，以精原细胞和精母细胞表达为主，精于细胞和精于则表达相对较少，而且，随着剂量的增加，表达也增多。0．075Gy照射后。两种蛋白的表达开始随时间推移而增强，12h达到峰值，然后下降，但仍高于正常组。结论低剂量电离辐射诱导小鼠睾丸生精细胞Cytc和caspase-3蛋白的表达具有一定的剂量和时程效应规律性。     

AT细胞系辐射敏感性与细胞凋亡的相关研究

目的 探讨AT细胞高辐射敏感性与细胞凋亡之间的联系。方法 以液体闪烁测量法测3H-TdR掺入百分率来观察^60Co γ射线照射对AT5BIVA（AT）和GM0639（GM）细胞增殖的影响;实验于照射后0、24、48和72 h,用细胞流式术动态检测AT和GM细胞的自发凋亡率及^60Co γ射线照射诱发的凋亡率。结果 ^60Co γ射线0～6 Gy照射后,AT和GM两种细胞3H-TdR掺入百分率均呈剂量依赖性降低,且AT细胞降低得比GM细胞快,两种细胞3H-TdR掺入百分率与受照射剂量间可拟合成指数方程：SAT=0.9718e^-0.6855D（R^2=0.9950）、SGM=1.0928e^-0.3731D（R^2=0.9777）;AT细胞的自发凋亡率高于GM细胞;2～6 Gy照后24 h,两种细胞由辐射诱发的凋亡率均随照射剂量增大而升高,且在同一剂量点,前者凋亡率高于后者;2 Gy照射后0～72 h,AT和GM细胞的凋亡率均呈时间依赖性增加,且随照后时间延长两者间差异逐步增大,在72 h达到显著水平。结论 AT细胞高辐射敏感性与其较高的自发及辐射诱发的凋亡密切相关。     

用染色体畸变研究AT细胞系辐射敏感性和适应性反应

目的探讨毛细血管扩张运动共济失调症(ataxiatelangiectasia,AT)细胞系的辐射敏感性和对低剂量辐射能否诱导细胞遗传学适应性反应。方法用2cGy60Coγ射线预先照射进入G1期的AT5B1VA(AT)细胞和GM0639(GM)细胞,培养6h后再照射1.0Gy或3.0Gy60Coγ射线,分析染色体畸变。结果G1期的GM细胞在预照射2cGy60Coγ射线的诱导剂量后能非常显著地降低随后照射1.0Gy或3.0Gy60Coγ射线诱发的染色体畸变率,染色体畸变的观察值非常显著地低于预期值(P<0.001),而对AT细胞则没有观察到这种现象,染色体畸变的观察值与预期值差异无统计学意义(P>0.05);另外,1.0Gy或3.0Gy60Coγ射线诱发AT细胞的各种畸变率(包括着丝粒畸变、无着丝粒畸变和染色单体型畸变)均显著地高于GM细胞(P<0.001)。结论低剂量电离辐射不能诱导AT细胞产生细胞遗传学适应性反应;AT细胞对电离辐射诱发染色体畸变高度敏感,可能是由于不能正确修复DNA双链断裂的结果。     

电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞P21蛋白表达的影响

目的阐明电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞P21蛋白表达的影响。方法采用免疫细胞化学方法和流式细胞术检测X射线照射对P21蛋白表达的时程和量效变化的影响。结果时程实验结果显示，离体培养的EL-4细胞经4．0Gy X射线照射后，P21蛋白表达在2．72h（免疫细胞化学方法检测）和8—72h（流式细胞术检测）明显增高（分别为P〈0．01、P〈0．001）。量效实验结果显示，X射线照射后24h，P21蛋白表达在0．5—6．0Gy（免疫细胞化学方法检测）和1．0～4．0Gy（流式细胞术检测）明显增高（分别为P〈0．05、P〈0．01、P〈0．001）。结论X射线能诱导P21蛋白表达增高，在一定范围内存在时间和剂量依赖关系。     

电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的影响

目的　研究电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的影响。方法　采用Northernblot检测p16mRNA水平的变化 ;采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术检测p16蛋白表达的变化。结果　研究证实 ,2 0Gy照射后 2～ 2 4h ,胸腺细胞p16mRNA水平明显增高 ,8～ 4 8hp16蛋白表达显著增高 (P <0 0 5～P <0 0 1) ;照射后 2～ 8h脾细胞p16mRNA水平明显增高 ,2 4hp16蛋白表达显著增高 (P <0 0 5 )。研究还证实 ,0 5～ 6 0Gy照射后 ,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高 ,p16蛋白表达在 1 0～ 4 0Gy组显著增高 (P <0 0 5～P <0 0 1) ;脾细胞p16mRNA水平亦增高 ,但增幅远低于胸腺细胞 ,p16蛋白表达在 1 0～ 4 0Gy组显著增高 (P <0 0 5～P <0 0 1)。结论　电离辐射可诱导p16基因转录及蛋白表达增高 ,其增高幅度表现出一定的细胞异质性。     

电离辐射对不同放射敏感性细胞中高迁移率簇蛋白B1的诱导表达作用

目的 探讨电离辐射对已建立的宫颈癌放射抗拒细胞对比模型中高迁移率簇蛋白B1（HMGB1）和mRNA诱导表达的差异性,分析HMGB1对宫颈癌放射敏感性调控的可能性。方法人宫颈癌细胞系HeLa重复照射12次后,传代培养调整细胞状态至细胞增殖稳定,筛选得抗拒细胞系HeLaR。以2、5、10 Gy X射线分别照射亲代HeLa和HeLaR细胞,于照射后0、0.5、2、4、6、12、18、24、36、48 h收集细胞,提取蛋白质和RNA,采用Western blot和实时荧光定量PCR法分别检测样本中HMGB1蛋白和mRNA的表达情况。结果 在蛋白水平,2、5、10 Gy X射线照射后,HeLaR细胞在48 h内均表现为HMGB1表达量下降,在48 h达到未照射水平,后有增加趋势,与照射后0 h比较,2、5、10 Gy照射后6~36 h各时间点,差异具有统计学意义（t=3.574~9.754,P < 0.05）;相反,HeLa细胞在照射后6 h,其HMGB1表达逐渐增多,尤其在5和10 Gy表现明显,与照射后0 h比较,2 Gy照射后6、12、48 h（t=3.945~4.864,P < 0.05）、5 Gy照射后6、36、48 h（t=-2.875~3.295,P < 0.05）及10 Gy照射后36、48 h（t=-4.480、-4.517,P < 0.05）,差异具有统计学意义。在mRNA水平其趋势与蛋白水平基本一致。结论 不同剂量X射线照射后可诱导人宫颈癌细胞中HMGB1的表达变化,且其变化在人宫颈癌放射敏感细胞及放射抗拒细胞中不同。HMGB1可能参与人宫颈癌放射抗拒机制。     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.     

BTG2作为一种新的电离辐射诱导基因的研究

目的 研究γ射线照射对肿瘤细胞的B细胞易位基因2（BTG2）表达水平的影响.方法 应用RT-PCR方法研究电离辐射对肿瘤细胞BTG2 mRNA水平的影响;应用Western blot方法测定电离辐射对肿瘤细胞BTG2蛋白表达水平的影响.结果 与未照射对照细胞相比,3 Gyγ射线单次剂量照射明显提高了人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和人宫颈癌细胞系C33A、HeLa中的BTG2蛋白的表达水平.γ射线照射人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231导致了照射剂量和时间依赖性的BTG2表达水平的升高,而且这种改变既表现在BTG2 mRNA水平上,也反映在BTG2蛋白水平上.结论 BTG2是一种新的辐射诱导DNA损伤的反应基因,进一步研究将为BTG2作为肿瘤放射治疗的疗效和预后评价指标提供实验基础和依据.     

X射线全身照射对小鼠骨髓细胞CyclinD、CDK4表达的影响

目的 研究X射线全身照射对小鼠骨髓细胞CyclinD、CDK4表达的影响，以探讨电离辐射诱导小鼠骨髓细胞G1阻滞的分子机理。方法 采用Northern blot和半定量RT－PCR方法分别检测CDK4、CyclinD基因转录水平变化；流式细胞仪检测了X射线全身照射小鼠骨髓细胞CyclinD、CDK4的表达及周期时程的变化。结果 2Gy X射线全身照射后12h骨髓细胞出现G1期细胞百分数升高（P＜0．05），G2＋M期细胞百分数于照后4h及12h升高（P＜0．05）；CyclinD基因转录水平从2h开始下降，48h达到最低，照后72h恢复至正常水平，CDK4的变化趋势与CyclinD相似，只是从8h开始下降，48h达到最低，照后72h恢复假照组水平；CyclinD蛋白表达在照射后2、4、24、48h显著降低（P＜0．01），CDK4蛋白表达在照射后2h开始急剧下降，持续至照射后48h仍未恢复到对照水平（P＜0．01）。结论 2Gy X射线全身照射可诱导小鼠骨髓细胞发生G1、G2阻滞；CyclinD、CDK4基因及其蛋白产物可能在电离辐射诱导的小鼠骨髓细胞周期阻滞中起重要作用。     

X射线全身照射诱导小鼠脾细胞LAMP-1 表达的时程变化

目的观察X射线全身照射对小鼠脾细胞LAMP-1表达的影响。方法采用流式细胞术检测0．075和2Gy X照射后不同时间（0、2、4、8、16、24和48h）以及用Con A刺激4h后，脾细胞表面表达LAMP-1的阳性细胞数。结果脾细胞表面的LAMP-1在2Gy X射线全身照射后8、16和24h表达明显下降；0．075Gy X射线全身照射后2h显著升高，而48h又下降到低于对照的水平。0．075和2Gy X射线全身照射后再加用Con A（10μg／μl）刺激4h，LAMP-1的表达均增强；但是此时2Gy的效应比0．075Gy更明显。结论LAMP-1参与电离辐射作用下免疫信号的传导，高剂量X射线抑制它的表达，而低剂量X射线在早期对其表达有促进作用，与体内免疫细胞的活性密切相关。Con A促进免疫细胞表面LAMP-1的表达。     

辐射联合外源性野生型p53基因对不同p53状态的黑色素瘤细胞系的生物学效应

目的研究辐射结合腺病毒（Ad CMV）载体介导的p53基因转导对不同p53状态的人黑色素瘤细胞系基因转移效率、凋亡和辐射敏感性的影响。方法用复制缺陷的重组腺病毒载体（AdCMV-p53）介导入p53基因转导1Gy X射线预照射的黑色素瘤细胞系A375（wt p53）和WM983a（mu p53），RT-PCR检测mRNA水平，流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况，Tunel法检测细胞凋亡，克隆形成率测定辐射后细胞存活率。用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照。结果1Gy X射线照射可较高地增加AdCMV-p53对A375和WM983a细胞系的基因转导效率，转导的外源性野生型p53可在两种细胞中高效表达，并诱导细胞周期G1期阻滞；单纯转导p53对A375（wt p53）细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应，但可部分诱导WM983a（mu p53）细胞凋亡；而转导p53基因48h后给予X射线辐射，两种细胞的克隆存活率较其对照组均明显减低，外源性p53基因对WM983a（mu p53）细胞的辐射增敏作用较A375（wt p53）细胞明显。结论外源性野生型p53基因过表达可增加黑色素瘤细胞系A375和WM983a的辐射敏感性，但对WM983a细胞系的辐射增敏作用高于A375细胞系。表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的候选基因。     

X射线诱导survivin在EL-4细胞中的表达及与P53表达的相互关系

目的观察电离辐射对EL-4细胞survivin蛋白表达的影响及与P53表达的关系。方法采用流式细胞术（FCM）观察EL-4细胞接受4GyX射线照射后，survivin蛋白的表达、P53表达及细胞凋亡的变化。结果4Gy X射线照射EL-4细胞，Survivin蛋白表达受抑制，在4h明显降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．001）；照射组P53蛋白表达水平均高于对照组，在此时间点上与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。照射后4h细胞凋亡率显著升高，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．001）。结论survivin与P53在细胞凋亡调控中发挥重要作用，survivin表达与P53表达水平相关。     

60Co γ射线对盐诱导激酶2的诱导表达作用

目的 探讨电离辐射对盐诱导激酶2（SIK2）蛋白和mRNA的诱导表达作用及细胞周期相关性。方法 HepG2细胞用⁶⁰Co γ射线照射,蛋白质印迹法和实时定量PCR法分别检测细胞的SIK2蛋白和mRNA的表达,胸腺嘧啶双阻滞法同步化细胞,流式细胞术测定细胞周期的变化。结果 HepG2细胞2 Gy照射后4、6、10 h,SIK2蛋白表达显著增加 （t=3.00、3.98、4.17,P<0.05）;10 Gy大剂量照射后,SIK2蛋白表达增加的趋势与2 Gy一致,但增加的幅度较前者低。2和10 Gy照射后SIK2基因 mRNA均在10 h出现了增加（t=4.54、2.74,P<0.05）。照后10 h出现了细胞G₂/M阻滞高峰。利用同步化细胞分析表明,细胞周期不同时相中SIK2 mRNA的表达无明显差别。结论 2和10 Gy照射均能诱导SIK2蛋白表达增加,2 Gy的作用更加明显。细胞照射后10 h,SIK2 mRNA的表达水平增加,但与辐射诱发细胞G₂/M期阻滞引起不同时相细胞的分布变化无关。     

人非小细胞肺癌细胞受照射后肿瘤坏死因子水平的变化

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549和NCI-H596受x射线照射后肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA表达及其蛋白水平的变化。方法应用实时荧光RT-PCR技术，观察肺癌细胞系A549和NCI-H596照射2、5、10、20、30和40Gy后1、3、6、12、24、48和72hTNF．amRNA表达及其蛋白水平。应用免疫组织化学法(EusA)检测相应培养液中TNF-α蛋白的水平。同时进行集落形成实验观察2种细胞系的放射敏感性。结果X射线照射后TNF-α mRNA表达及其蛋白水平较照射前升高，吸收剂量达40q时TNF-α mRNA表达水平达高峰，为对照组的83倍。NCI-H596细胞受照射后1h TNF-α mRNA表达逐渐升高，6h达高峰，为对照组的568倍。NCI-H596细胞受照射后TNF-α蛋白水平逐渐升高，受照射后24h达高峰(为基础水平的58倍)。且与受照射剂量有关。A549细胞受照射后1h TNF-α mRNA表达仅见瞬间升高，随后即降至基础水平。而且，A549细胞受照射后TNF-α蛋白水平无明显升高。结论X射线可诱导NSCLC细胞系NCI-H596产生TNF-α，呈现时间、剂量依赖性改变。     

电离辐射诱导EL-4细胞Caspase-3、P53蛋白表达及其生物学作用

目的研究电离辐射对EL-4细胞中Caspase-3和P53蛋白表达的影响，及其对辐射诱导细胞凋亡及多倍体细胞的作用。方法采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术检测蛋白表达的变化，采用PI荧光标记及流式细胞术检测细胞凋亡及多倍体细胞的变化。结果实验表明，4．0GyX射线照射后8及12h，EL-4细胞中Caspase-3蛋白表达与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；照射后2、4、8、12及24h，P53蛋白表达与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。实验还表明，4．0Gy照射后2、4、8、12、24、48及72h，EL-4细胞凋亡与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05～P〈0．001）；而照射后2～48h，多倍体细胞数与对照组比较则未见明显变化。结论电离辐射可诱导EL-4细胞Caspase-3及P53蛋白表达增高，可能在辐射诱导细胞凋亡中起重要作用，而辐射诱导多倍体细胞的分子通路则可能是P53非依赖性的。     

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响

为了探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞 (hEFs)端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响 ,采用基因重组技术构建hTERT全长cDNA正义荧光真核表达载体 ,并采用脂质体法将正义重组质粒pIRES2 EGFP hTERT及空载质粒pIRES2 EGFP分别转染原代培养hEFs,检测转染细胞端粒长度、端粒酶活性及端粒酶亚单位的变化。结果显示 ,外源性hTERT基因转染细胞 (hEF hTERT)端粒酶活性较未转染细胞 (hEFs)及空载体转染细胞 (hEF EGFP)显著增加 (P <0 0 1) ,hEF hTERT、hEFs及hEF EGFP端粒长度分别为 6 0kb、5 3kb及 5 4kb ,端粒酶亚单位中除hTERT在mRNA和蛋白水平表达均增加外 ,hTR和TP1mRNA无明显变化。以上结果提示 ,外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEFs端粒酶活化 ,端粒长度不再继续缩短 ,hTERT在mR NA和蛋白水平表达增加     

辐射对Jurkat细胞P21蛋白及ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响

目的 探讨电离辐射对Jurkat细胞P21蛋白和ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响.方法 采用流式细胞术(FCM),检测0、0.5、1.0、2.0、4.0及6.0 Gy X射线照射后Jurkat细胞中P21蛋白表达的变化.采用实时定量PCR技术,分别检测0、0.5、1.0、2.0、4.0及6.0 Gy X射线照射后4和24 hd'鼠胸腺及脾细胞中p21基因表达的变化.结果 不同剂量X射线照射后12和24 h,Jurkat细胞中P21蛋白表达在0.5～4.0 Gy范围内均随剂量的增大而升高(t=-24.23～-3.96,P<0.05),6 Gy时均出现表达下降(t=-11.19、-14.50,P<0.05);与假照射组相比,在0～6.0 Gy照射后4和24 h,小鼠胸腺及脾细胞中p21基因的相对表达量均随剂量增大逐渐增加(t=-29.96～8.80,P<0.05);并于6.0 Gy时达最高(t=-11.84～-3.42,P<0.05),仅胸腺细胞1 Gy照射后4 h除外(t=-3.42,P>0.05).结论 x射线能诱导P21蛋白及基因表达增加,并在一定剂量范围内存在良好的剂量-效应关系.     

小剂量电离辐射引起拓扑异构酶Ⅱα表达的变化

目的：探讨小剂量电离辐射引起DNA拓扑异构酶Ⅱα（TOPOⅡα）的表达变化。方法：用免疫细胞化学染色和Western blot的方法，检测了Hela细胞在５Gyγ射线照射后的时间效应和小于5Gy的剂量效应，以及小剂量的多次累积效应。结果：5Gyγ射线照射后4h TOPOⅡα开始下降，12h降为最低，16h开始回升；在小于或等于5Gy时，随剂量增加，TOPOⅡα的表达下降逐渐明显；且较小剂量多次累积效应。结论：小剂量的电离辐射引起的TOPOⅡα的表达变化具时间效应、剂量效应和多次累积效应。     

低剂量辐射诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡的适应性反应

目的：研究低剂量辐射诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡的适应性反应。方法：应用原位末端标记（TUNEL）和常规HE染色法分别结合光镜定量地观察75mGyX射线照射诱导小鼠睾丸生精细胞在生精周期中凋亡的适应性反应。结果：当1．0、2．0或3．0Gy（攻击剂量，D2）X射线照射前6h给予75mGy（诱导剂量，D1）预照射时明显减轻D2对睾丸精原细胞和精母细胞的凋亡损伤作用，而对精子细胞影响不明显，当1．0、1．5、2．0、2．5、3．0Gy（D2）X射线照射前3、6、12、24h给予75mGy（D1）预照射时，发现当D2剂量较小（1．0、1．5、2．0Gy）时，精原细胞和精母细胞的凋亡百分率减少出现较早，较明显，而且持续时间较长；反之，当D2剂量较大（2．5和3．0Gy）时，精原细胞和精母细胞的凋亡百分率减少只有照后6h）出现，而且不显著。结论：低剂量电离辐射可以诱导精原细胞和精母细胞凋亡的适应性反应，并与D1和D2间隔时间及D2剂量有关。