人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗膀胱癌的实验研究

目的　观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV tk/GCV)自杀基因系统体外对人膀胱癌的选择性杀伤效应。　方法　利用不同感染复数(MOI)的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因感染膀胱癌细胞253J和人成纤维细胞MRC 5,荧光显微镜下观察其感染效率。利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad hTERT HSV/tk以及Ad CMV HSV/tk感染253J和MRC 5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受染细胞的存活率。　结果　重组腺病毒Ad hTERT EGFP能特异性转染253J细胞,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高(P<0. 01),MOI为1时转染率为8. 3%,MOI为1000时转染率达100. 0%;应用GCV处理后,Ad CMV HSV/tk对253J和MRC 5细胞均有杀伤作用,而Ad hTERT HSV/tk只杀伤253J细胞(P<0. 001),随着MOI和GCV浓度增加, 253J细胞存活率明显降低(P<0. 01),MOI为1、GCV浓度为1μmol/L时存活率为95. 4%,MOI为100、GCV浓度为1000μmol/L时存活率仅为6. 1%,并有旁观者效应。　结论　重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率,hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统对人膀胱癌细胞有靶向杀伤作用。     

hTERT启动子调控腺病毒介导的HSV-tk/GCV基因系统治疗前列腺癌的实验研究

目的探讨人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)驱动的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合环氧鸟苷(GCV)对人前列腺癌的治疗作用。方法①体外实验:用携带启动子hTERT的重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP以及携带小鼠巨细胞病毒(CMV)启动子的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP分别感染人前列腺癌细胞LNCaP及人正常成纤维细胞MRC-5,根据报告基因EGFP表达的不同计算病毒的细胞转染率。MTT法评估GCV对分别感染Ad-hTERT-EGFP、Ad-CMV-EGFP、Ad-hTERT- HSV-tk和Ad-CMV-HSV-tk的MRC-5细胞及LNCaP细胞的杀伤作用。②体内实验:建立人前列腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型,将成瘤裸鼠按随机表法分为4组,每组10只。A组为治疗组,肿瘤局部注射1.0×109 PFU/ml的Ad-hTERT-HSV-tk病毒上清0.1 ml,第1、5、10天各1次,第2～15天腹腔注射GCV 100 mg·kg-1·d-1;B组为Ad-hTERT-HSV-tk对照组,注射Ad-hTERT-HSV-tk同A组,第2～15天腹腔注射PBS;C组为GCV对照组,肿瘤局部仅注射PBS 0.1 ml。第1、5、10天各1次,注射GCV同A组;D组为阴性对照组。比较各组肿瘤体积、瘤重及肿瘤抑制率。结果①体外实验:当感染复数(MOI)=10时,Ad-CMV-EGFP在MRC-5及LNCaP中的转染率分别为88.41%及90.23%,二者比较差异无统计学意义(P>0.05),而Ad-hTERT-EGFP在MRC-5及LNCaP中的转染率分别为0及66.67%,二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。MOI=100,GCV=1000μg/ml时,Ad-hTERT-EGFP、Ad-CMV-EGFP、Ad-hTERT-HSV-tk和Ad-CMV-HSV-tk对MRC-5细胞的抑制率分别为0、0、1.1%和98.4%,对LNCaP细胞的抑制率分别为0、0、97.4%和99.4%。②体内实验:荷瘤裸鼠治疗后第14天,A、B、C和D组肿瘤体积分别为82.56、132.85、135.03和174.07 mm3;各组移植瘤重量分别为(0.49±0.22)、(1.17±0.18)、(1.35±0.19)和(1.46±0.13)g;A组的肿瘤体积和重量明显小于其它组(P<0.01)。第21天时,各组的移植瘤抑制率分别为72.55%、2.49%、12.28%和0,A组的移植瘤抑制率明显大于其它组(P<0.01)。结论Ad-hTERT-HSV-tk对LNCaP细胞具有靶向杀伤作用,对MRC-5无明显杀伤作用;Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对人前列腺癌裸鼠移植瘤模型具有明确的治疗作用。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的重组腺病毒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒系统，观察其在膀胱癌细胞中的表达。方法构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC315-Tp—EGFP，细胞重组技术获得腺病毒Ad-hTERT-EGFP，按感染复数（MOI）100体外转染膀胱癌细胞株253J及人胚肺成纤维细胞株MRC-5，通过倒置荧光显微镜和Rt—PCR分别检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒（mCMV）启动子的腺病毒Ad-EGFP作为阳性对照。结果成功构建出重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP，滴度为3．8×10^10空斑形成单位（pfu）／ml，Ad—hTERT-EG-FP感染的253J细胞中，（85．2±3．3）％发出明亮的绿色荧光；而其感染的MRC-5细胞未产生绿色荧光（P〈0．01）；对照病毒Ad-EGFP在253J和MRC-5中分别有（87．1±2．2）％及（92．5±3．1）％的细胞可见到绿色荧光。RT-PCR检测显示：253J细胞转染Ad-hTERT-EGFP、Ad-EGFP后及MRC-5细胞转染Ad-EGFP后均有EGFP基因表达；而MRC-5细胞转染Ad-hTERT-EGFP后未见EGFP基因表达。结论该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在膀胱肿瘤细胞中表达，在正常细胞中不表达，具有明显的靶向性。     

腺病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对雄激素非依赖性前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 观察腺病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因对雄激素非依赖前列腺癌细胞的杀伤作用,探讨雄激素非依赖性前列腺癌( AIPC)基因治疗的可行性.方法 制备携带HSV-TK的重组腺病毒载体(AdTK),AIPC细胞PC-3细胞加入AdLacZ,滴度(MOI)分别为50、100、150、200、250.48 h后计算各滴度AdLacZ转染PC-3细胞的细胞感染率(％).转染后使用更昔洛韦(GCV)处理,浓度为10 mg/L,噻唑蓝(MTT)比色法观察AdTK/GCV对PC-3细胞的体外杀伤效应.结合电镜技术、流式细胞仪检测探讨AdTK/GCV对PC-3细胞的杀伤机制.结果 对体外培养的PC-3细胞杀伤实验表明,随着AdTK MOI增加及GCV剂量增加,细胞存活率逐渐降低.AdTKMOI为150和250时,GCV的半数致死最(IC50)分别为7.75 mg/L和5.00 mg/L.电镜和流式细胞仪检测证实细胞死亡有细胞凋亡机制参与.AdTK/GCV处理后非转染PC-3细胞出现死亡,存在旁观者效应,效应强弱与AdTK转染、未转染细胞混合比例相关.结论 AdTK/GCV能有效杀伤雄激素非依赖前列腺癌PC-3细胞.     

Scopadulciol对胸腺激酶依赖的丙氧鸟苷杀伤253J细胞的增效作用

目的 观察Scopadalciol(SDC)在人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用中的增效作用.方法 利用重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk、GCV、SDC的不同组合作用于膀胱癌细胞253J和人成纤维细胞MRC-5,噻唑蓝(MTT)比色法观察细胞存活率;另外,利用携带Ad-hTERT-HSV-tk感染253J细胞和MRC-5细胞,加入不同组合和不同浓度的GCV和SDC,MTT法观察受染细胞的存活率.结果 经重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk感染的253J细胞,应用GCV处理后,253 J细胞能被特异性地杀伤,而MRC-5细胞不被特异性杀伤,253J细胞存活率为25.7%(P＜0.01),联合应用SDC(0.1 μmol)后,253J细胞的存活率又有明显降低,253J细胞存活率为2.3%(P＜0.01);不同剂量SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV·tk/GCV作用于膀胱肿瘤细胞253J后,随着剂量和浓度的增加,253J细胞的存活率呈降低趋势(P＜0.05),当GCV浓度为1 μmol/L,SDC剂量为0.04 μmol时,253J细胞的存活率为45.7%,当GCV浓度为100 μmol/L,SDC剂量为0.1 μmol时,253J细胞的存活率仅为2.3%,并有旁观者效应.结论 在胸腺激酶依赖的GCV可以靶向杀伤人膀胱癌细胞的基础上,联合应用SDC后,对膀胱癌细胞的杀伤作用具有明显增效作用.     

腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统杀伤膀胱癌细胞的研究

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV－tk/GCV)系统杀伤膀胱癌细胞的作用。方法;采用人巨细胞病毒早期蛋白启动子驱动HSV－tk基因重组腺病毒（Ad)载体,体外转染HTB9和Scan BER细胞,MTT法测定杀伤率,PCR检测Ad-tk转染细胞中tk基因及腺病毒E1区基因。结果：GCV对转染的癌细胞有杀伤作用,感染复数（MOI）100时,10mg/L GCV杀伤80％的tk^ 细胞,而对未转染的细胞无杀伤作用。不同MOI的Ad-tk转染两种细胞,其毒性与Ad-tk MOI正相关,MOI100时,15mg/L GCV杀伤100％的细胞,无GCV组未受到抑制。PCR证实Ad-tk转染细胞有tk基因,腺病毒E1区基因阴性。Annexin V法证实杀伤效应与凋亡有关。结论：HSV-tk/GCV系统是一种有效,安全治疗膀胱癌的新方法。     

腺病毒介导自杀基因对消化系统肿瘤的杀伤作用

目的观察腺病毒介导的自杀基因对消化系肿瘤的杀伤作用。方法腺病毒介导的自杀基因HSV-TK分别转染结肠癌LOVO细胞、胃癌MGL-803细胞和肝癌BEL-7402细胞,比较腺病毒载体对不同肿瘤细胞的转染效率。加入前药丙氧鸟苷(GCV),通过MTT法检测细胞存活率,观察单纯疱疹病毒1型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统对不同肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果在GCV浓度100mg/L以上时,3种转基因肿瘤细胞均可被HSV-TK/GCV系统完全杀伤;旁观者效应以MGL-803细胞最为明显,与LOVO细胞和BEL-7402细胞相比,差异有显著性意义(P<0.05);腺病毒对肿瘤细胞的转染效率强弱依次为BEL-7402细胞、MGL-803细胞和LOVO细胞。结论重组腺病毒可以作为消化系肿瘤基因治疗的高效载体。HSV-TK/GCV系统对胃癌MGL-803细胞的作用最佳。     

野甘草醇对胸腺激酶依赖的更昔洛韦阻断前列腺癌进展的增效作用

目的 观察野甘草醇(SDC)在人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对人前列腺癌细胞的杀伤作用中的增效作用.方法 测定胸苷激酶(TK)活性,应用高效液相色谱( HPLC)法测定三磷酸更昔洛韦(GCV-TP)在肿瘤细胞内的浓度,将不同配伍浓度的SDC、Ad-hTERT-HSV-tk、更昔洛韦(GCV)应用于前列腺癌细胞,观察体外对前列腺癌细胞的杀伤作用、旁杀伤效应.结果 SDC对转染Ad-hTERT-HSV-tk的LNCaP、PC3细胞的TK酶活性影响不明显.应用高效液相色谱法分析,以单加GCV组的GCV-TP浓度计作100％.在加入0.04μmolSDC后,GCV-TP浓度与不加SDC比较提高到(101.0±1.5)％,但差异无统计学意义(P＞0.05);加入5倍治疗剂量0.20 μmol SDC后,GCV-TP浓度提高到(106.0±4.5)％,差异有统计学意义(P＜0.05).并进一步通过细胞实验证实,SDC对Ad-hTERT-HSV-tk+ GCV杀伤前列腺癌细胞无明显增效作用,但是旁杀伤效应增加明显.结论 SDC对胸腺激酶依赖的GCV阻断前列腺癌进展有一定的增效作用,将天然药物SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk以及GCV联合应用,可以达到增效减毒的目的.     

腺病毒介导双自杀基因选择性杀伤血管内皮细胞

目的研究腺病毒介导的双自杀基因在KDR启动子调控下对血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法应用PCR扩增出KDR启动子序列,分别构建携带KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控下的CD与TK的融合基因的重组腺病毒AdKDR-CDglyTK、AdCMV-CDglyTK,体外感染脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和结直肠癌细胞系LOVO细胞,利用重组病毒携带的GFP基因,在荧光显微镜下观测重组病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV和5-氟胞嘧啶(5-FC),观测杀伤作用,比较两种启动子的转录调控特性。结果成功构建了两种重组病毒,并高效地转染了HUVEC和LOVO细胞。两种重组病毒对两种细胞的转染效率相似,并随重组病毒的感染复数MOI(multiplicityofinfection)增加而升高;以MOI=100的两种病毒分别转染的两种细胞表现出对前药的不同敏感特性:转染了AdCMV-CDglyTK的HUVEC和LOVO细胞以及转染了AdKDR-CDglyTK的HUVEC细胞,对前药的敏感性差异无显著性意义(P>0.05);转染了AdKDR-CDglyTK的LOVO细胞,对前药敏感性低,与其他3组比较,差异存在显著性意义(与其他3组两两间比较,P均<0.001)。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因在血管内皮细胞中的特异性表达,有利于实现双自杀基因靶向恶性肿瘤血管内皮细胞的抑癌疗法。     

体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响

目的 观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）/丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统在体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法 采用含有甲胎蛋白基因启动子、增强子和HSV-tk基因的嵌合基因,插入腺病毒中形成重组腺病毒（AdrAFPTK）,将该重组腺病毒分别感染体外培养的甲胎蛋白阳性人肝癌细胞BEL-7402和甲胎蛋白阴性人肝癌细胞SMMC-7721,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测HSV-tk基因的转录表达,观察GCV对人肝癌细胞的选择性杀伤作用。结果GCV在体外对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阳性的人肝癌细胞BEL-7402有明显的杀伤作用和“旁观者效应”,而对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阴性的人肝癌细胞SMMC-7721无明显作用。结论 在体外,表达HSV-tk基因的甲胎蛋白的人肝癌细胞可被受甲胎蛋白基因表达调控序列控制的自杀基因HSV-tk特异性杀伤,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的特异性基因治疗。     

重组腺病毒介导β半乳糖苷酶基因转染内皮祖细胞的实验研究

目的测定重组腺病毒介导β半乳糖苷酶基因对内皮祖细胞的转染率,为利用人类单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因转染内皮祖细胞治疗肺癌提供依据。方法将转染β半乳糖苷酶（LacZ）的重组腺病毒AD5F35（AD5F35LacZ）加入培养有内皮祖细胞的24孔板,转染内皮祖细胞。转染后用LacZ检测试剂盒染色,计算转染率。结果在光学显微镜下观察,蓝色细胞为AD5F35LacZ基因转染成功的内皮祖细胞。在不同感染复数MOI的前提下,腺病毒对内皮祖细胞的转染率是不同的,在一定的范围内,转染率随MOI的增大而增大,在MOI达到400时,转染率最大,为98．38％±1．25％。结论重组腺病毒可成功转染内皮祖细胞,转染率随MOI的增大而增大,当感染复数为400时转染率最大。     

自杀基因联合全反式维甲酸治疗对前列腺癌PC-3细胞旁观者效应的影响

目的 观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统联合全反式维甲酸(ATRA)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞旁观者效应的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测HSV-TK(Ad-TK)/GCV系统对PC-3细胞的杀伤力.流式细胞仪检查连接蛋白(Cx)43阳性细胞数.结果 单纯Ad-TK/GCV系统对PC-3细胞旁观者效应在TK+:TK-细胞混合比例为5:5时明显出现(P<0.05),而联合ATRA后,在TK+:TK-细胞混合比例为3:7时就明显出现(P<0.05).Ad-TK/GCV联合ATRA处理PC-3细胞后,在细胞抑制率均达到约50%时,其TK+PC-3细胞混合比例可降低20%.ATRA(10-6 moL/L)处理PC-3细胞1、3、5 d后,Cx43阳性细胞率由10.5%分别升高为25.8%、50.8%和62.4%(P<0.01).结论 ATRA可能通过增强基于Cx43的旁观者效应,从而提高Ad-TK/GCV系统对前列腺癌的杀伤效应.     

CEA启动子特异性启动双自杀基因CD与TK在CEA＋恶性肿瘤中表达

目的探讨CEA启动子（CEA promoter，Cp）在肿瘤细胞特异性启动双自杀基因胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase，CD）与胸苷激酶（thymidine kinase，TK）的作用。方法培养Lovo与Hela细胞，传代冻存。10μl带有Cp．CD．TK重组腺病毒（recombinant adenovirus with Cp．CD．TK，RA-Cp．CD．TK）病毒液转染Lovo与Hela，荧光显微镜观察，收集细胞提取总RNA，PCR扩增Cp、CD与TK，电泳鉴定。病毒转染Lovo与Hela传代接种96孔培养板，每株细胞分两组，每组24孔：第一组给予5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-Fc）10mg／L培养液，第二组给予更昔洛韦（ganeiclovir,GCV）5mg／L培养液，光镜观察细胞形态，台盼蓝染色检测细胞活力。结果转染病毒的Lovo细胞及Hela细胞均可见绿色荧光，PCR均可扩增出Cp、CD和TK。5-Fc和GCV对Lovo细胞具有很强的杀伤作用，对Hela细胞则微弱，5-Fc实验组Lnvo细胞活力平均为8．54％±1．34％．Hela细胞平均为95．05％±2．18％（P〈0.01）。GCV实验组Lovo细胞活力平均为8．38％±1．22％，Hela细胞平均为95．39％±1．64％（P〈0．01）。结论RA-Cp．C．T靶向性杀伤CEA＋的Lovo结肠癌细胞，而对CEA-的Hela子宫颈癌细胞生长无影响。     

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的　探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系,对人脐血管内皮细胞ECV30 4的选择性杀伤作用。方法　将质粒pAdEasy -KDR- CDglyTK在2 93细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的ECV30 4细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5 - 氟胞嘧啶(5 -fuorocytosine ,5 -FC)和/或丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV) ,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果　所得病毒对两种细胞细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加;表达KDR的ECV30 4细胞对前药的具有较高的敏感性,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P均<0 . 0 1) ;融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0 . 0 1) ;且观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测治疗后ECV30 4细胞G1期比率增多及S期细胞减少(P均<0 . 0 1) ,同时,电镜下可见ECV30 4有凋亡和坏死改变。结论　KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和更昔洛韦对膀胱癌细胞的旁观杀伤效应

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因和更昔洛韦（GCV）对膀胱癌细胞的旁观者效应和机制。方法：将转染HSV-tk基因的膀胱癌细胞HTB9与HTB9细胞混合培养，在GCV作用下，观测细胞的存活率。HTB9-tk细胞条件培养基，经不同孔径的滤膜过滤，将滤液及0.22μm滤膜上的物质重新加入HTB9细胞，观察细胞存活率。结果：当HTB9-tk细胞50％时，共培养细胞对GCV的敏感性近100％，表明每个表达HSV-tk基因的细胞至少杀死1个不含HSV-tk基因的膀胱癌细胞。HTB9-tk细胞的条件培养液过滤后直径大于0.22μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用。结论：HSV-tk/GCV对膀胱癌细胞具有明显旁观者效应的毒性作用，直径大于0.22μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用，其旁观杀伤效应机理可能是HTB9对HTB9-tk细胞凋亡囊泡的吞噬。     

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??Construction and expression of enhanced green fluorescent protein and HSV1-TK co-expression vector TANG Yong , LIU Zuo-jin, ZHOU Shi-ji ,et al. Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Scienses, Chongqing 400010??China Corresponding author: LIU Chang-an, E-mail??liuchanganyisheng@sina.com Abstract Objective To construct EGFP and HSV1-TK co-expression vector and to detect its expression level in hepatoma carcinoma cell line HepG2, and thus to provide experimented bases for the target gene therapy of liver cancer. Methods HSV1-TK gene was isolated from pORF-HSV1TK plasmids and cloned into eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP??The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-TK was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Then recombinant plasmid was transfected into hepatoma carcinoma cell line HepG2 by liposome reagent??and the expression of EFGP in cell were observed by fluorescence microscopy , TK protein and mRNA was analyzed by Western blotting and RT-PCR respectively?? Results The sequence of the cloned DNA fragment was identical to HSV1-TK that was reported on Gene bank??The recombinant expression plasmid was successfully transfected into HepG2 cell line, and green fluorescent was observed under fluorescent microscope, positive clones were picked out by G418 screening. The optimal G418 screening concentration was 600g/L.The mRNA expression level of TK was high and its protein expression was found. Conclusion The recombinant eukaryotic co-expression vector of EGFP and HSV1-TK was successfully constructed and effectively expressed in HepG2 cell line.     

KDR启动子驱动的双自杀基因对实体瘤细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因(AdKDRCDglyTK)体系对实体肿瘤细胞及血管内皮细胞靶向杀伤作用。方法分别将KDR和CMV启动子融合基因腺病毒体外感染表达KDR的ECV304、MCF7、MGC803及SW620细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5FC和/或GCV,观察其对各细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果两种腺病毒对各细胞的感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,各细胞株均达约100%感染;感染AdCMVCDglyTK的各组细胞和感染AdKDRCDglyTK的ECV304、MCF7、MGC803及SW620对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无统计学意义(P均>0.05);与其他细胞相比,感染AdKDRCDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01);且观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤实体肿瘤细胞及血管内皮细胞。