重组人穿孔素肽段的体外杀伤肝癌细胞活性

目的 :以肝癌细胞系SMMC 772 1作为靶细胞 ,观察重组人穿孔素 (PFP)N端肽段 (rhPFP N)及C端肽段 (rh PFP C)体外杀伤肿瘤细胞的活性。　方法 :用大肠杆菌表达PFP N和PFP C与谷胱甘肽转移酶 (GST)的融合蛋白 ,对表达产物进行纯化 ,将不同浓度的GST rhPFP C或GST rhPFP N加入体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1,2 4h后用镜检和MTT法检测细胞存活情况。　结果 :用GST rhPFP N或GST rhPFP C处理后 ,可见SMMC 772 1细胞膜溶解和细胞破裂。用MTT法检测 ,实验组A值显著低于对照组 (P <0 .0 0 1)。GST rhPFP C和GST rhPFP N浓度为 2 .5ml L时 ,其杀伤活性分别为 33.38%和 5 .90 %。　结论 :rhPFP C和rhPFP N对人肝癌细胞SMMC 772 1均有明显的杀伤活性 ,rhPFP C对SMMC 772 1的杀伤活性显著高于rhPFP N。     

小剂量γ射线辐照外周血单个核细胞对人前列腺癌LNCaP细胞的杀伤作用

目的 观察小剂量γ射线辐照外周血单个核细胞对培养人前列腺癌细胞系LNCaP细胞的杀伤作用.方法 实验设LNCaP肿瘤细胞对照组、单纯外周血单个核细胞对照组、照射和未照射的外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养组,照射剂量为0.5-3 Gy,剂量率为17Gy/min.利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法,观察外周血单个核细胞对LNCaP细胞的杀伤情况.结果 外周血单个核细胞在照射后各组培养至144 h均有大量细胞死亡.存活细胞明显少于未照射组,培养至240 h时,照射与非照射组中存活的外周血单个核细胞均减少,但是在照射的各组中减少更为明显.在外周血单个核细胞与LNCaP肿瘤细胞共培养组中,各照射组问在培养72 h内无明显差异,在共培养96～240 b时.0.5～2Gyγ射线照射外周血单个核细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用明显增强,尤其以1Gy照射组更为明显.而2.5与3Gyγ射线辐照组以及未照射外周血单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显低于0.5～2 Gy各组,在培养至240h时,仍有肿瘤细胞存活并出现增生.结论 γ射线辐照对某些外周血单个核细胞有损伤作用,0.5～2Gyγ射线辐照的外周血单个核细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,而2.5Gy和3Gyγ射线辐照对分离后的外周血单个核细胞对肿瘤细胞杀伤有抑制作用.     

γ射线辐照外周血单个核细胞对肿瘤细胞杀伤作用的研究

目的:观察γ射线辐照外周血单个核细胞对培养人前列腺癌细胞系PC-3细胞的杀伤作用。方法:实验设PC-3P肿瘤细胞对照组、单纯外周血单个核细胞对照组、照射和未照射的外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养组,照射剂量为1Gy,吸收剂量率为17Gy/min。利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法和MTT比色法,观察外周血单个核细胞对PC-3细胞的杀伤情况。结果:外周血单个核细胞在照射后体外培养至144h有大量细胞死亡,存活细胞明显少于未照射组,培养至240h时,照射与非照射组中存活的外周血单个核细胞均减少,但是在照射的各组中减少更为明显。在外周血单个核细胞与PC-3肿瘤细胞共培养时,照射组在培养至96h时,γ射线照射外周血单个核细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用明显增强,杀伤活性明显增加。结论:γ射线辐照对某些外周血单个核细胞有损伤作用,但是γ射线辐照的外周血单个核细胞其杀伤肿瘤细胞活性增强。     

树突状细胞活化肝癌肿瘤浸润淋巴细胞抗瘤免疫的体外研究

目的　研究负载肿瘤抗原的树突状细胞 (DC)对原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)体外增殖和细胞毒作用的影响。方法　联合应用GM -CSF和IL - 4对原发性肝癌病人外周血分离的单核细胞进行体外诱导 ,加入自体癌细胞匀浆粗提物进行刺激 ,制备负载肿瘤抗原的DC后 ,与自体TIL在含有低浓度IL - 2的完全培养基中混合培养 ,计数TIL增殖数量 ,ELISA法检测培养上清中IFN -γ和TNF -α的含量 ,LDH法测定TIL对自体肝癌细胞、K5 6 2肿瘤细胞的细胞毒作用 ,与单纯在含有低浓度IL - 2的完全培养基中培养的TIL进行比较。结果　TIL在含低浓度IL - 2的完全培养基中与负载肿瘤抗原的DC混合培养 ,较单纯在含低浓度IL - 2完全培养基中培养增殖效果明显 (P <0 .0 1) ;分泌IFN -γ和TNF -α的量明显提高 (P <0 .0 1) ;对自体肝癌细胞的细胞毒作用显著性增强 (P <0 .0 1) ;两组TIL对自体肝癌细胞的细胞毒作用明显高于对K5 6 2肿瘤细胞的细胞毒作用 (P <0 .0 5 ) ,对K5 6 2肿瘤细胞的细胞毒作用无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论　负载肿瘤抗原的DC与TIL混合培养 ,可增强TIL的抗肿瘤活性 ,且具有促增殖作用。     

γ射线诱导人肝癌细胞表达B7—1共刺激分子的研究

目的 研究电离辐射与肿瘤细胞Ｂ７－１分子表达之间的关系，探讨肿瘤细胞辐粕免疫原性增强的机制。方法 采用间接免疫荧光－流式细胞仪分析技术，研究在用不同剂量γ射线照射ＳＳＭ－７７２肝癌细胞后，培养不同时间内ＳＭＭＣ－７７２细胞Ｂ７－共刺激分子的表达水平。并用＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法测定照向射肿瘤细胞与人反应后的细胞知性。结果 未燠才经１０、２０、３０Ｇｙ照射的人肝癌细胞不表达Ｂ７－１分子经４０、５０、６０     

辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用

目的：研究携带可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(shTRAIL)基因的辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL在人肝癌细胞株中的表达及其促凋亡作用。方法：体外通过脂质体转染SMMC7721细胞。转染细胞分别接受0(假照组)、2、5和10 Gy X线照射,ELISA法检测sTRAIL的表达;细胞分为正常SMMC7721组,分别接受0(假照组)、2和5 Gy X线照射的转染空质粒pshuttle-Egr1组及转染重组质粒pshutlle-Eyr1-shTRAIL组,采用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率;分别取SMMC772细胞、转染STRAIL细胞、转染空载体及照射组细胞,采用克隆形成实验检测细胞存活率。结果：不同剂量X射线照射SMMC7721-shTRAIL细胞上清中可溶性TRAIL表达量明显高于假照组（P< 0.001）;与假照组比较,照射转染后SMMC7721细胞的凋亡细胞百分数明显增加（P<0.05或P<0.001）,细胞存活率明显下降（P<0.05
或P<0.001）。结论：pshuttle-Egr1-shTRAIL     

肝癌SMMC-7721细胞中PKB对β-连环蛋白的调控

目的　探讨在肝癌SMMC - 772 1细胞中蛋白激酶B(PKB)对 β 连环蛋白 (β catenin)的调控作用。 方法用WesternBlot和RT PCR等研究在肝癌SMMC - 772 1细胞中激活或抑制PKB后 ,β catenin基因及蛋白水平的变化。结果　以H2 O2 活化PKB ,则SMMC - 772 1细胞胞质内游离的 β catenin水平明显升高 ,而与E cadherin结合的 β catenin水平没有变化 ,β catenin的mRNA表达也未见明显改变 ;用Wortmannin抑制PKB的活性 ,可使胞质内 β catenin的含量下降。 结论　肝癌SMMC - 772 1细胞中PKB可以调控胞质中游离的 β catenin ,这为深入研究 β catenin在肝癌发生中的作用机制提供了重要线索     

^60COγ射线对HeLa细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨γ射线对人宫颈癌细胞系HeLa端粒酶活性的影响。方法 不同剂量的γ射线照射HeLa细胞后24、72、120h，用TRAP-ELISA法检测端粒酶的活性。结果 γ射线照射后细胞能增加端粒酶的活性。较低剂量(0．5-1．5Gy)γ射线照射后24h，端粒酶的活性呈剂量依赖式增加；2-3Gy时增加的幅度减低；而较高剂量(4-12Gy)γ射线照射时，又呈剂量依赖式增加。与照射24h相比。在较高剂量(4-12Gy)照射后72及120h。酶的活性呈剂量依赣式减少。结论 HeLa细胞受γ射线照射后。端粒酶活性增加；不同剂量范围。增加幅度不同。     

外源性p16基因对人原发性肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的:探讨导入外源性p16cDNA真核表达载体对人原发性肝癌细胞系SMMC- 772 1生物学行为的影响及其分子机制。方法:构建外源性p16基因真核表达载体并转染SMMC- 772 1细胞,经G4 18抗性筛选和扩增,得到稳定的表达株,并经RT -PCR及免疫细胞化学鉴定。通过生长曲线,流式细胞术,免疫细胞化学及Western -Blot等实验方法,对转基因后肿瘤细胞生物学行为及细胞周期调控因子CDK4 ,CyclinD1及pRb进行观察。结果:转染外源性p16基因的SMMC- 772 1细胞有外源性p16基因的整合及表达,细胞生长速度明显减慢,倍增时间明显延长,G1期细胞明显多于转基因前(P <0 .0 5 ) ;免疫细胞化学显示外源性p16表达可下调CDK4及cylinD1的表达(P <0 .0 5 ) ,Western -Blot提示转染外源性p16基因后细胞中磷酸化pRb表达明显降低。结论:外源性p16基因导入人肝癌细胞株SMMC -772 1中可稳定表达并使细胞停滞在G1期,抑制细胞生长,其机制可能为下调CDK4、cyclinD1的表达和抑制pRb磷酸化有关。     

γ射线对人淋巴细胞Cx43和Egr-1基因转录表达影响

目的研究γ射线对人外周血淋巴细胞Cx43和Egr-1基因转录表达的影响。方法对数生长期的淋巴细胞,分别给予2、4和6Gy的60^Coγ射线照射,并于照射前（对照组）和2Gy照射后4、8、12、24、48和72h及不同剂量照射后12h,分别提取总RNA,反转录成cDNA。利用实时荧光定量PCR技术,检测各组Cx43和Egr-1基因表达改变。结果人外周血淋巴细胞Cx43 mRNA表达水平在2Gy照射后4～12h明显增高,为对照组的6．74倍以上（P〈0．05）;24～72h,其表达水平与对照组相比没有明显变化。不同剂量照射后12h,2Gy和6Gy时表达水平高,是对照组的10．52倍以上（P〈0．05）。Egr-1 mRNA表达水平在2Gy照射后的8h和24h增高,但没有统计学意义;4、12、48和72h,Egr-1 mRNA表达水平比对照组显著降低（P〈0．05）。不同剂量照射后12h,2Gy时,Egr-1 mRNA表达水平比对照组降低（P〈0．05）,4Gy时,其表达水平接近对照组,6Gy时,表达水平增高,为正常对照组的7．94倍（P〈0．05）。结论γ射线照射后能够明显上调Cx43基因表达。Egr-1要达到表达水平增高倍数和Cx43倍数相同,所需剂量比Cx43大。     

放射线对肝癌细胞中端粒酶启动子活性的影响

目的:研究放射线对不同的肝癌细胞株中人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子活性的影响。方法:报告质粒phTERTp-Luc经脂质体METAFECTENE介导瞬时转染4种不同的肝癌细胞株后,给予2 Gyγ射线照射,观察照射组与非照射组中荧光素酶的表达。结果:瞬时转染4种不同的肝癌细胞株后,检测到照射可经hTERT启动子而诱导荧光素酶的表达增强,即hTERT启动子在2 Gy照射组中比在非照射组中具有更高的活性。结论:2Gyγ射线可以诱导肝癌细胞中hTERT启动子活性增强,有望用于增强肝癌细胞中hTERT启动子介导的靶向基因治疗,并为进一步深入研究奠定了基础。     

茯苓多糖对受照射肿瘤细胞自由基的影响

目的 :观察茯苓多糖对受照射的肿瘤细胞及细胞培养上清液自由基相关指标的影响。方法 :加不同剂量茯苓多糖的K5 6 2白血病细胞在60 Coγ射线 15Gy照射后 ,立即收集上清液和细胞样本检测自由基的变化。结果 :受照后细胞培养上清液中活性氧 (ROS)含量和丙二醛 (MDA)含量有明显的升高 ,加药后有所降低但仍高于未照射组 (P≤0 0 5 ) ,超氧化物歧化酶 (SOD)浓度在受照射及加入多糖后无明显变化规律 ;细胞中活性氧含量及MDA在受照射后增加 ,加入茯苓多糖后活性氧含量仍继续升高 ,而MDA有所降低但仍明显高于未照射组 ,SOD活性在受照射后有所下降 ,加药后SOD活性有所升高但仍低于未照射对照组 (P≤ 0 0 5 )。结论 :茯苓多糖对γ射线照射引起肿瘤细胞中自由基活性的增高无显著影响 ,由此推测茯苓多糖对正常细胞辐射防护作用的同时基本不会影响放疗的效果。     

γ射线照射后免疫细胞表面Fas表达变化规律的研究

目的 观察γ射线照射后小鼠脾赃淋巴细胞凋亡的变化规律与Fas(CD95)表达的关系。方法 采用PI染色、双荧光流式细胞术及免疫组织化学的ABC方法研究不同剂量γ射线照射后不同时间,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡及CD95表达的规律。结果 小鼠脾脏淋巴细胞对不同剂量照射的凋亡敏感性有显著性差异,4Gy照射后凋亡率最高(在2～6Gy之间观察),淋巴细胞表面Fas的表达随照射后细胞凋亡率的变化而改变。结论 B细胞较T细胞具有更高的辐射凋亡敏感性;脾脏淋巴细胞在辐射后表现出明显的Fas介导凋亡。     

毛喉萜对人肝癌细胞增殖影响的实验研究

目的　探讨毛喉萜 (Forskolin)的抗肝癌作用。方法　采用克隆形成、MTT比色法观察毛喉萜对SMMC 772 1细胞的作用 ,并利用免疫细胞化学方法检测其对rasp2 1、p5 3蛋白表达的影响。结果　毛喉萜可明显抑制SMMC 772 1细胞的增殖 ,其抑制率与剂量呈正相关 (P <0 .0 1 ) ,经毛喉萜处理后 ,rasp2 1、p5 3蛋白表达均有明显下降。结论　毛喉萜能明显抑制肝癌SMMC 772 1细胞增殖 ,其作用可能与降低rasp2 1、p5 3蛋白表达有关。     

~(60)Coγ射线对HeLa细胞端粒酶活性的影响

目的　探讨γ射线对人宫颈癌细胞系HeLa端粒酶活性的影响。方法　不同剂量的γ射线照射HeLa细胞后 2 4、72、12 0h ,用TRAP ELISA法检测端粒酶的活性。结果　γ射线照射后细胞能增加端粒酶的活性。较低剂量(0 .5～ 1.5Gy)γ射线照射后 2 4h ,端粒酶的活性呈剂量依赖式增加 ;2～ 3Gy时增加的幅度减低 ;而较高剂量 (4 12Gy)γ射线照射时 ,又呈剂量依赖式增加。与照射后 2 4h相比 ,在较高剂量 (4 12Gy)照射后 72及 12 0h ,酶的活性呈剂量依赖式减少。结论　HeLa细胞受γ射线照射后 ,端粒酶活性增加 ;不同剂量范围 ,增加幅度不同。     

60Coγ射线对CNE-2细胞周期素B1和增殖细胞核抗原表达的影响

目的研究60Coγ射线分割照射对CNE-2周期素B1(cyclin B1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达和细胞周期分布的影响.方法采用PI单染,用流式细胞术检测细胞周期;逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)结合半定量分析方法测定cyclin B1和PCNA mRNA的表达水平.结果 4.0、6.0、8.0 Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞不同时间可发生G1、S和G2期细胞比例增多.4.0、6.0、8.0 Gy照射第1天PCNA表达水平较对照组下降(P＜0.05),第3、5天PCNA表达水平较对照组无明显变化(P＞0.05).照射后cyclin B1表达水平较对照组下降(P＜0.05),但各照射组间cyclin B1表达水平无差别(P＞0.05).结论 60Coγ射线分割照射CNE-2细胞可诱发G1、S、G2期阻滞和抑制PCNA和cyclin B1的表达,但其抑制效应无剂量依赖性.     

茯苓多糖对受照射肿瘤细胞自由基的影响

目的：观察茯苓多糖对受照射的肿瘤细胞及细胞培养上清液自由基相关指标的影响。方法：加不同剂量茯苓多糖的K562白血病细胞在^60Coγ射线15Gy照射后，立即收集上清液和细胞样本检测自由基的变化。结果：受照后细胞培养上清液中活性氧(ROS)含量和丙二醛(MDA)含量有明显的升高，加药后有所降低但仍高于未照射组(P≤0．05)，超氧化物歧化酶(SOD)浓度在受照射及加入多糖后无明显变化规律；细胞中活性氧含量及MDA在受照射后增加，加入茯苓多糖后活性氧含量仍继续升高，而MDA有所降低但仍明显高于未照射组，SOD活性在受照射后有所下降，加药后SOD活性有所升高但仍低于未照射对照组(P≤0．05)。结论：茯苓多糖对γ射线照射引起肿瘤细胞中自由基活性的增高无显著影响，由此推测茯苓多糖对正常细胞辐射防护作用的同时基本不会影响放疗的效果。     

Anti-tumor effect of human endostatin mediated by retroviral gene transfer in nude mice

目的　探讨逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因 (endostatin)对人肝癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒载体pLncx构建含有人endostatin基因及信号肽的重组逆转录病毒质粒 ,并将其导入PA317细胞制备重组病毒。用重组病毒感染人肝癌细胞SMMC772 1获得稳定转人endostatin基因细胞株 (SMMC endo)。同样用空白病毒质粒制备对照细胞株SMMC pLncx。免疫组化及Westernblot检测人endostatin基因在转染细胞株中的表达和分泌。应用血管内皮细胞生长抑制试验验证转染细胞株表达的人endostatin的生物学活性。同时对转染细胞株在体内外的生长情况进行观察。结果　免疫组化及Westernblot印迹分析证实转染人endostatin基因的肝癌细胞能表达并分泌人endostatin。与转染空白对照组 (SMMC pLncx)相比 ,表达人endostatin的SMMC772 1浓缩上清可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞生长 ,抑制率达 4 8% ,明显高于对照组 10 2 % (P <0 0 1)。体外生长实验显示 ,SMMC endo细胞与对照细胞SMMC pLncx体外生长速率无明显差别。而在转染细胞接种裸鼠 2 2d后 ,转染人endostatin基因的肿瘤细胞生长明显受到抑制 ,仅在部分裸鼠 (3/ 5只 )体内长出肿瘤 ,并且产生的腹侧肿瘤体积较对照组肿瘤缩小 94 5 % (P <0 0 0 1)。结论　逆转     

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的 :应用转染有小鼠B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法 :建立BALB/c小鼠转B7- 2基因肝癌细胞株H2 2 /B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BALB/c鼠皮下接种H2 2 /B7- 2及野生型H2 2细胞H2 2 /Wt,以空载体转染细胞H2 2 /neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性 ,同时测定培养上清IL -2、IFNγ ,研究B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果 :细胞在体外增殖能力一致 (P =0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种H2 2 /B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种H2 2 /Wt和H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 /B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞 (P <0 .0 5 )。结论 :共刺激分子B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 ,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应。     

阿拉瑞林对GnRH受体阳性肝癌细胞Fas/FasL基因表达的影响

目的　探讨Fas Fasl系统在LHRH类似物抑制肝癌细胞增殖过程中的作用。方法　用免疫组织化学方法检测SMMC772 1肝癌细胞中GnRH受体的表达 ;用半定量RT PCR方法 (QRT PCR)观察LHRH类似物对SMMC772 1肝癌细胞中Fas FasL系统mRNA表达的变化。结果　SMMC772 1肝癌细胞呈GnRH及其受体免疫反应阳性。PCR反应产物均与预期长度相符合。Fas FasL mRNA水平随LHRH类似物浓度增加而增大 ,经方差分析各组间有显著性差异 (Fas ,F =16.5 18FasL ,F =111.5 83 ,P <0 .0 1)。结论　SMMC772 1肝癌细胞具有自分泌GnRH的功能 ;Fas FasL系统可能参与了LHRH类似物对肝癌细胞增殖的抑制作用