单次差速贴壁法纯化培养大鼠嗅神经鞘细胞的实验研究

目的:探讨单次差速贴壁法纯化培养成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的可行性.方法:选取8～10周龄的成年SD大鼠,无菌条件下切取嗅球、剪碎,胰酶消化制成细胞悬液后接种,采用18 h单次差速贴壁的方法纯化培养嗅鞘细胞,定期在倒置显微镜下观察嗅鞘细胞的形态学变化及生长情况,并对其行神经生长因子受体p75抗体(NGFR p75)及碘化丙啶的免疫荧光鉴定,同时计算嗅鞘细胞的纯度.结果:通过18 h单次差速贴壁法纯化培养的嗅鞘细胞经NGFR p75免疫荧光鉴定后,纯度可达70%～80%,形态上以双极和三极细胞为主,伴有少许单极及多极细胞.结论:应用18 h单次差速贴壁法纯化培养嗅鞘细胞是一种简便、稳定、经济、快捷的方法.     

改良差速贴壁＋无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞

背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是最适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准.目的:运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法.设计、时间和地点:观察性对照实验.实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成.材料:健康成年SD大鼠6只.体质量150-180 g.方法:①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验.②单纯改良差速贴壁:将单细胞混悬液以8000个/cm2密度种植于无包被的25 cm2培养瓶中.经12 h+24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109L-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周.⑧单纯无血清条件培养液纯化:将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周.④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化:经12 h+24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0～3.0 d后,改换成无血清条什培养液,孵育36～48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养.以后视情况每3～5 d半量换液1次,培养3周.主要观察指标:运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征.采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度.结果:①倒置显微镜观察:差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难.差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长.伴少量扁平状"油煎蛋样"细胞.继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性最佳,数量和纯度最高.培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间.②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%～75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%～52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%～92%.结论:实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法.     

大鼠嗅鞘细胞原代培养克隆样生长的人为干预效应

目的:通过对大鼠嗅鞘细胞早期原代培养的克隆样生长进行人为干预,观察其对细胞的增殖、贴壁及再分布的作用。方法:实验于2005-08/2006-01在云南省肿瘤研究所完成。①将取自成年SD大鼠嗅球的嗅鞘细胞用差速贴壁法进行纯化。②将纯化后的细胞随机分为干预组和对照组,干预组于干预前1d换液,次日倒掉上清液,加入1.25g/L胰酶,加入量以刚浸没瓶底为宜。置于37℃培养箱消化3min,待镜下示胞体回缩变圆时加入DMEM培养基终止消化,并予以尖吸管反复吹打至镜下见大量细胞悬浮无明显克隆样细胞团为止。随后再加入适量培养基置于培养箱中继续培养。对照组不行任何措施。③采用倒置显微镜下观察两组生长的形态学特点,比较干预组干预前后嗅鞘细胞的生长情况及贴壁分布变化。结果:①干预前两组细胞的形态学观察:用差速贴壁法纯化细胞后,发现细胞早期呈克隆样生长,分布不均匀。②干预后两组细胞的形态学观察:干预组细胞经消化吹打干预后均匀贴壁生长,无明显克隆样生长中心,细胞多呈双极或多极样形态,细胞立体感及折光性好,视野清晰,细胞增殖迅速,数天后即可长满瓶底;对照组细胞分布不均,培养至3周仍无法长满瓶底,仍呈克隆样生长状态,周边区域的细胞数量少,增殖缓慢。结论:嗅鞘细胞原代培养的早期需采取人为干预使细胞均匀分布贴壁生长,从而加快细胞的生长速度,缩短实验耗时。     

阿糖胞苷结合神经生长因子体外纯化培养大鼠嗅鞘细胞

背景:由于嗅鞘细胞终生具有成髓鞘能力,如何利用简单而又经济的方法获得大量较高纯度的嗅鞘细胞是脊髓损伤研究的热点.目的:分析阿糖胞苷结合神经生长因子对大鼠嗅球源性嗅鞘细胞纯化培养的可行性.方法:将差速贴壁后的大鼠嗅鞘细胞首先用含10 mg/L阿糖胞苷的完全培养基培养24 h,然后用含体积分数为1%胎牛血清和25 μg/L神经生长因子的DMEM/F12培养基进行体外培养.观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和免疫组化染色对细胞及其纯度进行鉴定.结果与结论:体外培养的大鼠嗅鞘细胞神经生长因子受体NGFRp75染色呈阳性反应,细胞呈双极和三级,伸出细长突出,并渐结成网状,在体外培养的第7天纯度为95%,第9天时为90%,且形态良好.结果提示阿糖胞苷结合神经生长因子是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法.     

阿糖胞苷结合神经生长因子体外纯化培养大鼠嗅鞘细胞

背景：由于嗅鞘细胞终生具有成髓鞘能力,如何利用简单而又经济的方法获得大量较高纯度的嗅鞘细胞是脊髓损伤研究的热点。目的：分析阿糖胞苷结合神经生长因子对大鼠嗅球源性嗅鞘细胞纯化培养的可行性。方法：将差速贴壁后的大鼠嗅鞘细胞首先用含10mg/L阿糖胞苷的完全培养基培养24h,然后用含体积分数为1%胎牛血清和25μg/L神经生长因子的DMEM/F12培养基进行体外培养。观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和免疫组化染色对细胞及其纯度进行鉴定。结果与结论：体外培养的大鼠嗅鞘细胞神经生长因子受体NGFRp75染色呈阳性反应,细胞呈双极和三级,伸出细长突出,并渐结成网状,在体外培养的第7天纯度为95%,第9天时为90%,且形态良好。结果提示阿糖胞苷结合神经生长因子是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。     

大鼠嗅鞘细胞原代培养克隆样生长的人为干预效应

目的：通过对大鼠嗅鞘细胞早期原代培养的克隆样生长进行人为干预，观察其对细胞的增殖、贴壁及再分布的作用。方法：实验于2005—08／2006—01在云南省肿瘤研究所完成。①将取自成年SD大鼠嗅球的嗅鞘细胞用差速贴壁法进行纯化。②将纯化后的细胞随机分为干预组和对照组，干预组于干预前1d换液，次日倒掉上清液，加入1．25g/L胰酶，加入量以刚浸没瓶底为宜。置于37℃培养箱消化3min，待镜下示胞体回缩变圆时加入DMEM培养基终止消化，并予以尖吸管反复吹打至镜下见大量细胞悬浮无明显克隆样细胞团为止。随后再加入适量培养基置于培养箱中继续培养。对照组不行任何措施。③采用倒置显微镜下观察两组生长的形态学特点，比较干预组干预前后嗅鞘细胞的生长情况及贴壁分布变化。结果：①干预前两组细胞的形态学观察：用差速贴壁法纯化细胞后，发现细胞早期呈克隆样生长，分布不均匀。②干预后两组细胞的形态学观察：干预组细胞经消化吹打干预后均匀贴壁生长，无明显克隆样生长中心，细胞多呈双极或多极样形态，细胞立体感及折光性好，视野清晰，细胞增殖迅速，数天后即可长满瓶底；对照组细胞分布不均，培养至3周仍无法长满瓶底，仍呈克隆样生长状态，周边区域的细胞数量少，增殖缓慢。结论：嗅鞘细胞原代培养的早期需采取人为干预使细胞均匀分布贴壁生长，从而加快细胞的生长速度，缩短实验耗时。     

以差速贴壁与化学药物并胰酶限时消化法纯化新生大鼠嗅鞘细胞:优于单一差速贴壁和化学药物法吗?

背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用.目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成.材料:新生2 d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供.方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5 mm~3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×10~8L~(-1)密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养.设立4组:①未经纯化的常规对照组.②化学药物组加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂.③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞.④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6 d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25 g/L胰蛋白酶消化1 min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFR p75免疫细胞荧光染色结果.结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7 d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14 d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同.存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%:差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上.结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法.     

改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞

背景:目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低.目的:拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察.于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成.材料:10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备.方法:完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109L-1密度接种于末包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18～20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm2玻璃培养瓶中(第1次差速贴壁),24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中(第2次差速贴壁),接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞.在差速贴壁培养后二三天,加入3.0～5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定.结果:体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞.纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上.结论:改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞.     

人胚嗅球成鞘细胞的体外培养

目的：评估人胚嗅球成鞘细胞的分离与培养方法。方法：试验于2005-03／2005-08在昆明总医院中心实验室完成。选取自愿捐献自然流产3～5个月的胚胎，分离原代嗅球成鞘细胞，利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法对细胞进行纯化，采用免疫组织化学方法鉴定细胞并计算其P75阳性率。结果：①人胚嗅球成鞘细胞的形态学观察：原代培养5d的人胚嗅球成鞘细胞胞体呈长梭形，多极状，立体感强，折光性好。8d后，胞体变大，突起变长，并逐渐相互交织成网。14d后细胞主要表现为双极、三极形态。②人胚嗅球成鞘细胞免疫细胞化学染色及纯度鉴定：贴壁第2天，第7天的细胞染色。P75阳性达到95％以上。第14天细胞染色阳性率降至90％。25d则仅为50％。结论：应用延迟差速贴壁法与阿糖胞苷化人胚嗅鞘细胞的方法，分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法。     

人胚嗅球成鞘细胞的体外培养

目的:评估人胚嗅球成鞘细胞的分离与培养方法。方法:试验于2005-03/2005-08在昆明总医院中心实验室完成。选取自愿捐献自然流产3～5个月的胚胎,分离原代嗅球成鞘细胞,利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法对细胞进行纯化,采用免疫组织化学方法鉴定细胞并计算其P75阳性率。结果:①人胚嗅球成鞘细胞的形态学观察:原代培养5d的人胚嗅球成鞘细胞胞体呈长梭形,多极状,立体感强,折光性好。8d后,胞体变大,突起变长,并逐渐相互交织成网。14d后细胞主要表现为双极、三极形态。②人胚嗅球成鞘细胞免疫细胞化学染色及纯度鉴定:贴壁第2天,第7天的细胞染色,P75阳性达到95%以上。第14天细胞染色阳性率降至90%。25d则仅为50%。结论:应用延迟差速贴壁法与阿糖胞苷化人胚嗅鞘细胞的方法,分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法。     

大鼠嗅球嗅鞘细胞的体外分离培养及纯化

背景:差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的应用较多,细胞换液过程中使用含血清的培养基主要针对成纤维细胞的去除,而对神经元的去除作用不明显.目的:根据神经元体外培养需要血清的特性,拟利用无血清培养基在体外建立一种分离培养嗅鞘细胞的简单方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在哈尔滨医科大学动物实验中心完成.材料:成年SD大鼠10只,由哈尔滨医科大学实验动物中心提供.方法:在差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的基础上,剪开大鼠颅骨,显露位于颅腔前方的嗅球,取出2只嗅球,在显微镜下去除嗅球表面的软脑膜和毛细血管及外周组织,保留富含嗅鞘细胞的嗅神经层和嗅球颗粒层,剪成1 mm3小块分离获取单细胞悬浮液,调整细胞密度至1×107L-1,接种在用poly-l-lysine包被的培养瓶或培养板中,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,第3天用无血清DMEM/F12培养基换液培养.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态学观察、生长曲线分析、免疫荧光染色结果.结果:培养前3 d细胞数目无明显增加,甚至减少;然后细胞数目逐渐增多,13d细胞基本长满;传10代后细胞形态发生明显变化,胞浆内出现许多空泡,细胞增殖速度减慢或停止.纯化培养10 d后,培养板内双极和三极细胞均呈GFAP,NGFRp75阳性.结论:在差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的基础上,利用无血清DMEM/F12培养基进行换液培养可使嗅鞘细胞迅速增殖,是一种效率较高的体外培养方法.     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景:髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9 等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化.目的:体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞.方法:经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar 大鼠椎间盘髓核组织,第1,2 代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞.结果与结论:分离纯化后的第3 代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan 免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8 生长曲线显示细胞经过2d 的生长潜伏期,3d 的指数生长期,进入生长停滞期.说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致.     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景：髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化。目的：体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞。方法：经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织,第1,2代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞。结果与结论：分离纯化后的第3代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8生长曲线显示细胞经过2d的生长潜伏期,3d的指数生长期,进入生长停滞期。说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。     

三种纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞的比较

目的:嗅鞘细胞纯化培养方法有免疫亲和吸附法、免疫磁珠法、化学药物法、差速贴壁法、无血清饥饿法等,但均存在缺陷.比较3种纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞的纯度,寻求简单实用的高纯度人胚嗅球嗅鞘细胞的体外培养方法.方法:实验于2007-08/12在西安交通大学口腔医院医学实验中心进行.选用流产胚胎标本24份,胎龄4～6月,由西安交通大学第二医院和陕西省妇幼保健院产科提供.实验经产妇及家属同意,并经医院伦理委员会的批准.实验方法:取胚胎嗅球分离培养嗅鞘细胞,制成单细胞悬液.将单细胞悬液加入未包被的培养瓶中培养,然后再次将细胞悬液加入未包被的培养瓶中,具体差速时间根据观察决定.最后将差速贴壁后含未贴壁细胞的细胞悬液加入多聚赖氨酸包被的培养瓶或培养板中,用3种方法纯化培养:阿糖胞苷法、无血清饥饿法和间断神经营养因子3法纯化培养人胚嗅球嗅鞘细胞.比较3种纯化方法下嗅鞘细胞生长变化及纯度.结果:①培养早期嗅鞘细胞呈圆形, 随着培养过程进行细胞逐渐伸出细长突起呈双极、三极和多极细胞,胞核位于细胞中央. 成熟的嗅鞘细胞大多呈双极、三极细胞与许旺细胞相似,细胞折光性好,胞核呈圆形位于细胞中央,"煎蛋样" 细胞少见.②差速贴壁法培养3～6 d时纯度为88%,以后成纤维细胞增殖嗅鞘细胞纯度迅速下降.阿糖胞苷法阿糖胞苷作用后细胞大量死亡,免疫染色几乎未见阳性反应细胞存在.无血清饥饿法培养3～6 d时嗅鞘细胞纯度为90%,但细胞状态差.间断神经营养因子3法培养3～9 d时嗅鞘细胞纯度为95%,且细胞状态良好.结论:差速贴壁结合间断间断神经营养因子3法比结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法获得的嗅鞘细胞纯度高,且细胞状态良好.     

新生大鼠许旺细胞体外培养纯化的最佳培养条件

背景:许旺细胞对促进外周神经的生长,发育和修复有重要作用,目前对于许旺细胞体外培养方法的优劣情况报道不一.目的:筛选许旺细胞最佳体外培养条件.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/10在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:三四天龄SD大鼠24只,由武汉大学医学部实验动物中心提供.方法:无菌剥离大鼠双侧坐骨神经,应用低浓度酶快速消化法、差速贴壁法分离培养纯化许旺细胞.取处于指数生长期的细胞,调整密度为1×107 L-1接种到6孔培养板,然后分组实验.设定4个条件:培养基pH(6.8～8.8)、胎牛血清体积分数(2%～20%)、培养箱温度(34～39℃)、培养箱CO2浓度(3%～8%).首先固定胎牛血清体积分数、培养箱温度和培养箱CO2浓度,改变培养基pH对细胞进行培养,从而确定最适培养基pH.然后依次改变胎牛血清体积分数、培养箱温度以及培养箱CO2浓度,进而得到其他3个指标的最佳值.镜下观察见明显克隆形成时终止培养,以含5个以上细胞的细胞团作为1个克隆,在倒置显微镜下进行克隆计数.主要观察指标:通过许旺细胞长势及克隆形成情况,筛选许旺细胞体外培养扩增的最适pH、胎牛血清体积分数、培养温度和培养箱CO2浓度.结果:在以DMEM/F12(1:1)为基础培养基的情况下,培养基pH为7.0～7.2时克隆形成最多,＜7.0或＞7.2时克隆形成明显下降:胎牛血清体积分数为10%许旺细胞长势较好且克隆数明显增加,当血清浓度过高或过低时克隆形成相对较差;34～36℃细胞生长受到明显抑制,克隆形成较少,37℃时克隆形成最多,＞37℃细胞长势开始变差,克隆形成下降,至39℃时细胞已无法贴壁民;培养箱CO2浓度为3%～8%时许旺细胞克隆形成无明显变化.结论:许旺细胞体外培养的最佳条件为pH7.2的DMEM/F12(1:1)细胞培养基、胎牛血清体积分数10%、培养箱温度37℃、培养箱CO2浓度5%.     

人胚胎嗅鞘细胞的分离培养与纯化

目的：大量的实验证实，嗅鞘细胞是能促进已损伤的中枢神经重新恢复功能最有效的种子细胞之一。实验拟建立一种简便易行、省时、经济，临床应用更安全，临床效果更好的培养和纯化嗅鞘细胞的方法。 方法：实验于2004—12／2006—12在山东省泰安荣军医院细胞实验室完成。流产胚胎（4～6个月，由家属自愿捐献）。实验方法：在无菌条件下，用显微外科器械将胚胎的嗅球取出，在解剖显微镜下仔细剥离嗅球表面的软膜和血管，尽量保持嗅球完整性，然后用眼科剪反复剪碎，剪成0．5～1．0mm^3大小的组织块，将组织块移人离心管内，加入含有13％胎牛血清的D／F12培养液，用弯头吸管来回轻轻吹打组织块制成细胞悬液，用含有阿糖胞苷的无血清纯化液纯化嗅鞘细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，制成单细胞悬液并进行计数。 结果：胚胎嗅鞘细胞在24h后开始部分贴壁，胞体呈球形、星形，有一个甚至多个突起，但突起短小。贴壁3d后，大部分细胞迅速生长，突起延伸变长。贴壁5～7d后，随着培养时间的延长，嗅鞘细胞成簇密集排列生长，细胞突起相互交织越来越多，形成网状。可见3种比较典型的嗅鞘细胞：双极或梭形、多突起形和扁圆或油煎蛋形。主要以梭形和多突起形细胞为主。细胞培养至7～14d时细胞数量不再有明显增加，但是细胞仍生长旺盛，活性好，细胞纯度高达95％～98％。 结论：实验建立的人胚胎嗅鞘细胞培养的方法简便易行，经济，细胞纯度较高。     

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法,探索一种操作简便,既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法,为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨,以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞,进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好,具备典型成骨细胞特性,细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多,细胞存活率高(P<0.05);且比分段胶原酶消化法操作简单,耗时短。组织块法操作最为简单,对细胞损伤较小,但是细胞数量低、耗时长,很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。