人羊膜负载猪骨髓间充质干细胞生长的形态学研究

目的 建立人羊膜（HAM）负载培养骨髓间充质干细胞（MSCs)生长的组织工程方法，观察MSCs生长增殖的形态特点。方法 将贵州小香猪的MSCs原代培养，传代扩增后，以不同密度多次接种于HAM基质面，逐日到倒置显微镜下观察MSCs的生长增殖变化情况，并于培养8、18d后进行光镜、电镜观察。结果 接种后30min内明显见到MSCs在HAM上贴附生长，MSCs能以合适的接种密度在羊膜上良好生长。结论 HAM对MSCs有明显的促增殖作用，MSCs可以HAM为载体在体外进行培养，HAM是MSCs的良好载体。     

HPV感染阳性角朊细胞的原代培养及生物学特性研究

目的 培养人原代乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染阳性皮肤角朊细胞,观察其生物学特性。方法 取患者新鲜疣体及正常包皮皮肤组织,用胰酶消化法培养角朊细胞,观察其生长情况,绘制细胞生长曲线图,用ＰＣＲ及原位杂交方法检测上述细胞。结果 ＨＰＶ阳性角朊细胞（ＰＫ）在１６４０液中生长情况良好,增殖速度较正常角朊细胞快。结论 ＰＫ细胞在１６４０液中生长情况良好,适合作为ＨＰＶ感染动物模型用于进一步研究。     

在空气—液体交界面培养角朊细胞

为使体外培养的角朊细胞在近似体内状况下生长,本实验将人体表皮角朊细胞置于塑料培养环内的胶原基质上进行空气—液体交界面培养。培养14d后,将培养物冰冻切片,行普通细胞染色和免疫细胞化学检查,结果显示,有多层细胞形成,且在上层细胞中出现filaggrin。提示此培养技术可用于研究人体表皮细胞的生长和分化。     

人的复合人工皮肤组织工程学研究—角朊细胞库的构建

目的：介绍成我包皮角细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定技术。方法：采用细胞工程技术及免疫组化技术。结果：采用细胞工程技术至少可将角朊细胞传至６代以上，此时的细胞数至少原代培养的细胞数的１万倍，经冻存、复苏后，此角朊细胞仍既能增殖、又能分化，生长状态与原代培养的角朊细胞相类似；免疫组化显示：ＡＥ１反应阳性。结论：可以认为我们建立了角朊细胞库。     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

 【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

人的复合人工皮肤组织工程学研究——角朊细胞库的构建

目的 :介绍成人包皮角朊细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定技术。方法 :采用细胞工程技术及免疫组化技术。结果 :采用细胞工程技术至少可将角朊细胞传至 6代以上 ,此时的细胞数至少为原代培养的细胞数的 1万倍 ,经冻存、复苏后 ,此角朊细胞仍既能增殖、又能分化 ,生长状态与原代培养的角朊细胞相类似 ;免疫组化显示 :AE1反应阳性。结论 :可以认为我们建立了角朊细胞库     

兔骨髓诱导的内皮细胞和纤维蛋白凝胶体外共培养

目的将兔骨髓诱导的内皮细胞接种于纤维蛋白凝胶内并观察其生长增值情况。方法梯度离心分离兔骨髓单个核细胞（MNCs）,直接向内皮细胞诱导培养,传代培养至第2代细胞,倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,免疫组化鉴定;以10^5密度接种于纤维蛋白凝胶中培养并定期观察细胞生长情况,单纯细胞及胶原内的细胞分别用MTT法检测其生长并绘制生长曲线,胶原切片并作苏木精．伊红染色观察细胞在胶原内的生长。结果诱导的内皮细胞为铺路石样。呈单层生长,第2代细胞CD31、八因子相关抗原免疫组化均为阳性,摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性;细胞在纤维蛋白凝胶内成立体生长,细胞在纤维蛋白凝胶内3d后成梭形铺开,6d后自发形成管腔样结构;细胞在纤维蛋白凝胶内生长曲线成“s”形。结论骨髓诱导的内皮细胞在纤维蛋白凝胶内生长增值良好,纤维蛋白凝胶可以作为接种骨髓诱导的内皮细胞的基质材料。     

鼠尾胶作为细胞贴附剂的实验评价

脑星形胶质细胞和皮肤角朊细胞分别是研究中枢神经系统及皮肤疾病的细胞模型,这两种细胞在塑料培养瓶或板中呈贴附性生长,均是锚着依存性细胞(anchorage-dependent cells)[1].但从经济及可反复使用方面考虑 ,需使用玻璃培养瓶以获得大量细胞,而这两种细胞在玻璃这种底物上贴附性较差,一般底物上涂胶原底层有利于细胞生长[1],为此,笔者采用鼠尾胶作为贴附剂,取得良好效果.     

人工皮肤培养模型的建立

模拟体内生理条件,采用细胞三维培养技术将角朊细胞接种在一活性真皮替代物（即成纤维细胞胶原凝胶）上,然后行气液界面培养,使角朊细胞的一些正常生长和分化的特殊提以再现,从而形成一种能应用于临床的人工皮肤。而且这一培养模型使角朊细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成了一有机的整体,因而也是研究表皮分化、其表皮间相互关系的良好模型。     

TGF—β1对小鼠表皮细胞生长动力学影响的研究

目的探讨离体培养条件下TGF-β1对小鼠表皮细胞生长动力学的影响。方法分离培养c-57小鼠表皮细胞,以每孔5×10^4细胞接种于96孔板,培养72h后,（1）加入不同浓度的TGF—β1,观察其对表皮细胞生长的抑制作用;（2）加入不同浓度抑制剂SB431542,30min后加入10μg／mL TGF-β1,观察其对TGF—β1的拮抗作用。以XTT法测定细胞增殖曲线。以Brdu标记,用DAKO-Brdurd单克隆抗体共孵育,用荧光标记免抗鼠二抗显色,用PI衬染,流式细胞仪分析,计算不同细胞周期比率和细胞周期时间。结果TGF-β1可抑制小鼠表皮细胞的增殖,并有浓度依赖性,且作用时间越长,抑制作用越显著。SB431542能拮抗TGF-β1对表皮细胞的抑制作用,且当10-5mol／L时拮抗作用最强。流式细胞仪分析显示,用10μg,mLTGF-β1作用52h后,G0/G1期细胞百分率显著增加（从47％增加到78％）,Brdu阳性百分率下降95％,Brdu阳性细胞的下降与S期细胞下降平行。结论培养条件下TGF-β1可以使小鼠表皮细胞生长停止于G0／G1期,具有抑制细胞增殖的作用。SB431542可以拮抗TGF-β1对小鼠表皮细胞生长的抑制作用。     

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的方法,研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC,体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用四唑盐比色（MTF）法测定MSC的生长曲线;流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进人生长期,7天后进入平台期。FCM检测CIM5、CD90阳性率分别为19．60％、95．38％。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞的体外培养及生长特性

目的 研究肝硬化患者骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外扩增方法及其生长特性和特异性表面标记,为肝组织工程“种子细胞”的选择提供新的理论依据,为进一步研究自体骨髓间充质干细胞移植治疗肝衰竭时移植细胞在体内的调控机制打下基础。方法 无菌抽取4例肝硬化志愿者骨髓3～4mL,年龄30～40岁,利用密度梯度离心法联合贴壁筛选法逐步筛选MSCs,获取MSCs,倒置显微镜下逐日观察细胞生长特性,细胞计数,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志CD甜、CD45。结果 原代培养细胞生长潜伏期0～9d,对数增殖期为10～19d,生长平台期为20～24d;传代细胞生长周期较原代细胞快,细胞生长潜伏期为4～24h,对数增殖期为3～12d,13～15d进入生长平台期。肝硬化患者骨髓MSCs高表达CD44,低表达CD45。结论 肝硬化患者骨髓MSCs体外生长良好,性质稳定,可以作为“种子细胞”用于自体骨髓干细胞移植和生物人工肝系统。     

神经生长因子对兔牙髓干细胞体外增殖、成骨分化影响的实验研究

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)体外增殖及成骨分化的影响,为牙髓组织的损伤修复提供新线索.方法:采用酶解组织块法分离培养健康新西兰兔的DPSCs,光镜下观察其形态学及生长变化.将培养的第3代DPSCs分为3...     

GnRHa和孕三烯酮对异位子宫内膜细胞生长及凋亡的影响

目的探讨GnRHa及孕三烯酮对体外培养的异位子宫内膜间质(ES)细胞生长和凋亡的影响,及两种药物作用后基质金属蛋白酶 3(MMP 3)在ES细胞表达的变化。方法以不同浓度的GnRHa和孕三烯酮对体外培养的ES细胞分别进行处理,倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态,免疫组化法鉴定间质细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测药物作用0～60?h的细胞抑制情况,并绘制细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测GnRHa和孕三烯酮作用48h后异位内膜间质细胞周期和凋亡率的变化。采用免疫组化法检测不同浓度GnRHa和孕三烯酮作用48h后MMP 3在异位内膜表达的变化。结果GnRHa和孕三烯酮可抑制细胞的生长增殖,并呈时间和剂量依赖方式。药物作用48?h后,各组细胞均发生细胞周期阻滞,G1期细胞增加,S期细胞减少,各组凋亡率明显升高(P<0.05);免疫组织化学表明,两种药物均可降低异位子宫内膜MMP 3的表达;且GnRHa诱导异位子宫内膜细胞的凋亡、降低其MMP 3表达的作用强于孕三烯酮(P<0.05)。结论GnRHa和孕三烯酮均可明显抑制体外培养的ES细胞的生长增殖,诱导其凋亡,同时降低MMP 3的表达,且GnRHa上述作用的效果更加明显。     

银屑病患者外周血单个核细胞对自身角质形成细胞的促生长作用

目的：了解银屑病患外周血单个核细胞（PBMCs)对自体表皮角质形成细胞（KCs）增生的作用。方法：分离3例银屑病患的PBMCs,经30Gy钴照射后与来自同一患的KCs进行混合培养,观察KCs增生代谢方面的变化。结果：经过混合培养,来自银屑病患皮损和皮损周围未受累皮肤的KCs在自体的PBMCs作用下均发生快速增生反应。结论：表皮KCs与浸润炎性细胞的相互作用可能诱发KCs的过度增生,在银屑病发病机制中发挥重要作用。     

正常人角质形成细胞和黑素细胞体外共培养体系的建立

目的体外建立正常人表皮角质形成细胞和黑素细胞直接接触的共培养体系。方法分别培养角质形成细胞和黑素细胞,体外建立角质形成细胞和黑素细胞直接接触的共培养模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、紫外分光光度计检测、左旋多巴(L-Dopa)染色、免疫组织化学染色及透射电镜观察对共培养体系中的黑素细胞和角质形成细胞进行生物学鉴定。结果单独培养时,角质形成细胞呈圆形、"铺路石样"生长,黑素细胞呈两极或多级树突状生长;角质形成细胞和黑素细胞按一定比例混合培养后,2种细胞均迅速增殖,黑素细胞树突多为3～5个,与数十个角质形成细胞呈团块状生长,形成类似黑素单元的结构。共培养体系中的黑素细胞和角质形成细胞具备正常的生物学功能。结论角质形成细胞和黑素细胞直接接触的共培养体系为黑素细胞提供了更接近生理状态的体外研究模型。     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的 体外分离培养兔血管平滑肌细胞(VSMC)并观察其生长特征.方法 采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力.结果 原代培养5 d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型"峰-谷"状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似"S"形;细胞生长第3～5 d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化最显著.结论 体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5 d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24 h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料.     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的体外分离培养兔血管平滑肌细胞（VSMC）并观察其生长特征。方法采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力。结果原代培养5d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型＂峰-谷＂状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似＂S＂形;细胞生长第3～5d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24h内划痕宽度变化最显著。结论体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料。