稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS—1细胞株的筛选与鉴定

目的 建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS—1细胞株。方法 将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS—1细胞，经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株，并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果 筛选所得稳定表达细胞株经RT—PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应。而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论 筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株，命名为NS／HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。     

以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建

目的：构建以HBV HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒，以探讨HBV基因免疫的新途径。方法：PCR扩增HBc第1－72aa及93－183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheI/XhoI位点，构建真核表达载体pHBcdM。合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点，构建HBc-Mep融合基因真核表达质粒。经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒。结果：双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因。结论：成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc-Mep，为研究pHBc-MeP作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。     

HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 观察HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞株HepG2细胞内表达情况。方法 将构建的HBc与HBV多表位复合基因真核表达质粒pHBcMep以Lipofectamine介导转染HepG2细胞，通过间接免疫荧光、Western-blot检测表达产物。结果 经G418筛选的阳性转染细胞经间接免疫荧光染色后在紫外光激发时发出明显的荧光，而末转染质粒或转染pcDNA3．1的HepG2细胞则无明显荧光。Western-bot结果显示表达产物约为33kDa，并能与抗preS2多抗特异性结合。结论 HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞内获得正确表达。     

癌胚抗原T、B细胞表位短肽诱导特异性体液免疫反应研究

目的筛选癌胚抗原含T、B细胞表位的短肽并分析其诱导机体产生体液免疫的特性。方法利用免疫信息学方法预测CEA CTL表位,结合我们早期对CEA B表位预测的结果,选择含多个CTL表位肽和B表位肽的CEA氨基酸序列580～598处短肽作为目的基因。目的基因密码子优化后采用pET32a(+)原核表达系统表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot-ting鉴定融合蛋白的抗原性;经镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化CEA580～598全长融合蛋白,纯化蛋白用佐剂乳化后经日本大耳白家兔背部皮下多点免疫注射,采用Western blotting检测血清抗体的特异性,采用ELISA法检测血清抗体水平及变化趋势。结果含多个T、B细胞表位的短CEA580～598在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的25.6%;表达产物的相对分子质量(Mr)约21kDa,与预期Mr相符;Western blotting分析结果显示,在21kDa处出现特异性条带。日本大耳白兔经CEA580～598融合蛋白免疫后产生高水平的特异性抗体,与空载体和PBS对照组比较具有显著性差异(P<0.05),制备的免疫血清不但能特异识别CEA580～598短肽,而且能特异识别天然CEA抗原。结论 CEA580～598短肽融合蛋白具有较强的免疫原性,诱导的兔免疫血清能特异性结合CEA抗原,为基于CEA表位疫苗的研究奠定理论和实验基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E胞外域基因的真核细胞稳定表达及其免疫反应性的初步研究

目的：真核细胞稳定表达水痘-带状疱疹病毒( VZV)糖蛋白E( gE)的胞外域基因,应用gE抗原建立VZV感染的血清学试验来评价VZV疫苗的免疫效果。方法构建含有VZV gE胞外域基因的真核表达质粒pCDNA3．1-gE,测序后脂质体转染 COS-7细胞,经 G418筛选出稳定表达VZV gE的细胞株。采用RT-PCR法检测VZV gE的mRNA, Western blot和间接免疫荧光法检测gE的免疫反应性,表达产物经Ni2+-NTA柱纯化后包被ELISA板,对127份0~10岁正常儿童血清中VZV-IgG抗体水平进行检测。结果成功筛选出能够稳定表达VZV gE胞外域基因的COS-7细胞株,RT-PCR检测到gE的mRNA,经Western blot和间接免疫荧光鉴定,gE具有明显的免疫反应性,COS-7细胞株和其培养上清液中均有gE融合蛋白,表达量约为0．632 mg/ml,纯度约为90%。 ELISA实验检测了127份0~10岁儿童血清中VZV-IgG抗体,总阳性率为81．89%,特异度和灵敏度分别为93．75%和88．24%。结论本实验获得稳定高效表达VZV gE胞外域基因的COS-7细胞株,建立的ELISA 血清学检测方法有助于 VZV感染的流行病学研究和对易感人群VZV感染的诊断和预防。     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

基因疫苗pcDNA3.0-PSMA肿瘤细胞模型的建立

目的 构建表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的肿瘤细胞模型,为基因疫苗的抑瘤效应研究及免疫机制的探讨提供实验材料.方法 脂质体转染法分别将PSMA-pcDNA3.0质粒和pcDNA3.0质粒转染至SP2/0细胞,G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株,RT-PCR、间接免疫荧光法、Western blot检测PSMA蛋白的表达.结果 RT-PCR、间接免疫荧光法和Western blot均证明转染了PSMA-pcDNA3.0质粒的SF2/0细胞表达PSMA.结论 成功建立了稳定表达PSMA的小鼠肿瘤细胞模型,最终为前列腺癌的预防和免疫治疗研究打下了坚实的基础.     

人生发中心激酶基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人生发中心激酶（GCK）基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达GCK分子的基因转染细胞。方法采用RT-PCR法从pCMV5-GCK质粒载体上克隆GCK基因,通过双酶切（BglⅡ,SalI）装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,24 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达GCK蛋白的HEK293细胞株。结果构建了用于表达的含GCK基因的pIRES2-EGFP质粒载体,继而经RT-PCR、Western blot检测筛选出稳定表达人GCK蛋白的HEK293转基因细胞。结论构建了含人GCK基因重组pIRES2-EGFP质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

肾癌G250抗原基因在sp2/0细胞中的表达及其意义

【目的】将G250抗原cDNA片段转染入sp2/0细胞中并获得稳定表达,为G250基因疫苗研究提供实验工具。【方法】用脂质体转染法将鉴定好的重组质粒转染入sp2/0细胞中,经G418筛选得到稳定表达,采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、间接免疫荧光、Western blot检测G250基因在sp2/0细胞中的表达。【结果】转染2周后,筛选出阳性sp2/0细胞克隆,通过RT-PCR证实有G250mRNA转录,间接免疫荧光可以见到阳性细胞,Western blot证实有G250抗原表达。【结论】建立了稳定表达G250抗原的肿瘤细胞模型,为研究基于肾癌G250基因的肿瘤基因疫苗治疗奠定了基础。     

Establishment and identification of recombinant NS-1 cell strain that stably expresses chimeric HBc containing HBV multiepitope short peptides]

OBJECTIVE: To establish recombinant NS-1 cell strain that is capable of stable expression of chimeric HBc particle containing HBV multi epitope short peptides. METHODS: The recombinant plasmid, pHBc-Mep, was transfected into NS-1 cells via Lipofectamine, and the recombinant cell strain was screened with G418 and subclone screening. The expression products of the cells were examined by RT-PCR, ELISA, indirect immunofluorescence assay (IFA) and Western blotting. RESULTS: The results of RT-PCR, ELISA, IFA and Western blotting demonstrated that the recombinant protein HBc-Mep was expressed in the screened cells after continuous cloning for 3 times, but not in cells transfected with pcDNA3.1 or nontransfected cells. CONCLUSION: The recombinant cell strain stably expressing chimeric HBc particle containing multi epitope short peptides of HBV, designated as NS/HBc-Mep, has been established successfully.     

乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的为研究乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)20/21bp部分缺失(nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果变异株分泌到细胞外的HBsAg、HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论HBVCP20/21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的：为研究乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）20／21bp部分缺失（nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法：利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果：变异株分泌到细胞外的HBsAg,HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论：HBV CP20／21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

乙型肝炎病毒重组抗原表位检测敏感性研究

目的:在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位,并对其诊断敏感性进行评价。方法:人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124-147)的寡核苷酸序列,克隆入外源抗原表位表达载体系统FHV-RNA2-I3位点,构建重组质粒,在原核pET系统(BL21细胞)中表达。通过ELISA和West-ernblot检测表达产物的抗原性,并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Westernblot检测58份乙肝患者血清抗-HBs。结果:嵌和蛋白可与抗-HBs特异性结合,其ELISA检测抗-HBs阳性率为77.5%,Westernblot的为68%,而对照试剂盒的为62%。结论:在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性,有诊断应用价值。     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

Upregulation of phagocytic clearance of apoptotic cells by autoimmune regulator

To investigate the effect of autoimmune regulator （AIRE） on phagocytic clearance of apoptotic cells, a recombinant expression vector containing full-length human AIRE cDNA was transfected into 16HBE cells. After incubation with transfected 16HBE cells, engulfment of apoptotic HL-60 cells induced by camptothecin was detected by myeloperoxidase （MPO） staining. The change in the expression of Rac 1 in transfected 16HBE cells was determined by RT-PCR and Western blotting. The results showed that the phagocytosis percentage of the experimental group, the mock trans- fection group and the negative control group （non-apoptotic cells） was （25.50±3.67）%, （6.25±1.58）% and （1.0±0.67）%, respectively. Moreover, the expressions of Rac 1 mRNA and protein were up-regulated in AIRE-transfected 16HBE cells, suggesting that AIRE may function as a regulator in the phagocytic clearance of apoptotic cells by promoting the expression of Rac 1.     

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达简

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原（HBs）嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCVAR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H—AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV—HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-s真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCVAR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24HAR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA—AR3-S构建正确,Westernblot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H—AR3和pCMV—HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。