Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化,激酶活性检测方法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化。结果 脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Ⅰ～Ⅵ组(空白对照、正义对照、400、600、800、1000ng/ml反义转染组)细胞内p38MAPK活性分别为7.03、7.07、13.47、16.37、43.97及47.87;caspase-3活性分别为0.015±0.010、0.014±0.002、0.026±0.003、0.042±0.001、0.093±0.001及0.100±0.001;Ⅳ～Ⅵ组细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高。转染后细胞发生G_2/M期阻滞,Ⅰ～Ⅵ组细胞凋亡率分别为0.70％、0.76％、2.43％、7.82％、23.11％及31.35％,各实验组细胞凋亡较对照组明显增加。细胞内微丝形态结构破坏,Ⅰ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度分别为189.69±6.68、184.23±8.76、173.14±8.15、99.48±6.57、76.69±10.05及63.80±6.79,Ⅳ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度较对照组明显降低。结论 脂质体介导转染survivi     

Bcl-2反义寡核苷酸诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的研究

目的　探讨Bcl 2反义寡核酸对膀胱癌细胞凋亡的影响。方法　以Bcl 2基因的前六个密码子互补的、以硫代磷酸修饰的寡核苷酸(PS ASO)作为实验组 ,以硫代磷酸修饰的Bcl 2正义寡核苷酸为阴性对照组 ,仅加入培养液的作为空白对照组 ,与人膀胱癌细胞株EJ细胞共同孵育 ,光镜、电镜观察细胞形态 ,流式细胞仪测定和分析。结果　与阴性对照组及空白对照组比较 ,Bcl 2PS ASO实验组细胞在第 1 2、2 4、48、72h出现较明显的凋亡峰 ,以及凋亡等形态学变化 ,凋亡率明显增高 (P <0 0 5) ,并显示时间的依赖性。结论　Bcl 2反义寡核酸能诱导膀胱癌EJ细胞凋亡 ,对膀胱癌的治疗有潜在的意义。     

Survvin反义寡核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡的作用

目的探讨生存素（Survivin）反义寡核苷酸（ASODN）诱导人胃癌细胞SGC7901凋亡的作用。方法设计合成特异性靶向Survivin的ASODN,将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、脂质体转染对照组（Lip组）、正义链转染对照组（Lip-SODN组）和ASODN转染组（Lip-ASODN组）。作用48h后,Westemblot法检测各组Survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中PCNA表达情况。结果脂质体介导Survivin ASODN转染后的胃癌细胞Survivin蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P均〈0．05）,各对照组间无统计学差异（P〉0．05）。ASODN转染后胃癌细胞中PCNA表达水平明显降低。结论 Survivin ASODN转染胃癌细胞能下调Survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

生存素反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的　生存素 (survivin)是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员 ,在多数恶性肿瘤组织中丰富表达。因此 ,观察生存素反义寡核苷酸转染对肝癌细胞凋亡、增殖、细胞对化疗药物敏感性的影响。方法　设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸 (ASODN)。肝癌细胞株hepG2 分为 6组 :空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、2 0 0、40 0和 6 0 0nmol/LASODN转染组。作用 2 0h后收获各组细胞。倒置显微镜观察细胞形态变化 ,Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况 ,流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡指数 ,MTT法检测 5 氟尿嘧啶 (5 FU)和顺铂 (DDP)对各组细胞的生长抑制率。结果　各ASODN转染组细胞生存素表达有不同程度减弱 ,细胞变圆、折光增强、漂浮、细胞碎片形成等 ,而各对照组细胞生长良好 ;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组 (P <0 .0 5 ) ,以 6 0 0nmol/L转染组最为明显 (P <0 .0 5 ) ,而各对照组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;各ASODN转染组细胞增殖指数明显低于各对照组 (P <0 .0 5 ) ,以 6 0 0nmol/L转染组最为明显 (P <0 .0 5 ) ,而各对照组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;等浓度化疗药物 5 FU和DDP对各ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组(P <0 .0 5 ) ,以 6 0 0nmol/L     

WT1-反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞的促凋亡作用

应用缺陷型重组腺病毒介导WT1-反义寡核苷酸（ASODN）转染人脑胶质瘤（U251）细胞,逆转录聚合酶链反应检测WT1 mRNA的表达,Western blot检测WT1蛋白的表达;观察转染前后半胱天冬氨酸酶（caspase）3活性的变化及细胞凋亡情况.结果发现WT1-ASODN可使U251细胞中WT1 mRNA和蛋白表达下降;caspase3活性明显增加（P＜0.05）;细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）.     

低剂量辐射对荷人胶质瘤(U251)裸小鼠移植瘤细胞凋亡相关基因蛋白Bcl-2表达的影响

目的研究低剂量辐射对荷人胶质瘤（U251）裸小鼠移植瘤细胞凋亡相关基因蛋白Bcl-2表达的影响。方法对荷人胶质瘤裸小鼠进行全身深部X射线照射，采用免疫组化技术检测荷人胶质瘤裸小鼠移植瘤组织的Bcl-2蛋白表达水平。结果D1（75mGy）照射后，胶质瘤细胞的Bcl-2蛋白表达呈下降趋势，与假照组（0mGy）比，无显著差异（P〉0．05）；D2（4Gy）组、D1＋D2组的Bcl-2蛋白表达明显减少，与假照组（0mGy）比有统计学差异（P〈0．05）；而D1＋D2组与D2组比较，有统计学差异（P〈0．05），以D1＋D2组Bcl-2蛋白的表达减少更为显著。结论低剂量辐射在一定程度上可能下调了胶质瘤细胞的Bcl-2蛋白的表达，同时对其后的大剂量辐射有协同作用。     

survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞可诱导caspase-3活化

目的:观察survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AS ODN)诱导肝癌细胞凋亡的可能途径。方法:培养survivin表达阳性的肝癌细胞株SMMC-7721。设计合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸。将SMMC-7721细胞接种于6孔培养板内,分为6组:①空白对照组;②脂质体转染对照组;③正义链转染对照组;④200nmol/L AS ODN转染组;⑤400nmol/L AS ODN转染组;⑥600nmol/L AS ODN转染组。作用20小时后收获各组细胞,并进行后续实验:①倒置显微镜下观察细胞形态变化;②western blot法检测各组细胞survivin蛋白的表达情况;③流式细胞术检测细胞增殖和凋亡指数;④比色法检测各组细胞caspase-3的活性变化。结果:①AS ODN转染组细胞survivin表达减弱,以600nmol/L转染组最为明显,各对照组survivin蛋白表达无明显改变;②AS ODN转染组细胞形态出现变圆、折光增强、漂浮、细胞碎片形成等变化,而各对照组细胞生长良好;③各AS ODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/L转染组最为明显,而各对照组间差异无显著性意义(P>0.05);④各AS ODN转染组细胞增殖指数明显低于各对照组(P<0.05),以600nmol/L转染组最为明显,而各对照组间差异无显著性意义;⑤在各AS ODN转染组中,可见到不同程度的caspase-3的活化,而对照组细胞内无明显的变化。结论:survivin AS ODN转染能下调survivin蛋白表达,诱导肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,其作用途径可能涉及抑制survivin表达,诱导caspase-3活化,启动凋亡信号传导。     

反义生存素诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的构建反义生存素真核表达载体(anti-pcDNA3-svv),探讨其对胃癌的凋亡诱导作用。方法采用反义生存素核酸瞬时电转染法转染胃癌细胞系Skov3,筛选出阳性细胞株。以Western blot检测生存素蛋白的表达,用流式细胞仪检测其对Skov3的凋亡诱导作用,并检测实验组细胞(Skov3-SVVanti)MDR-1 mRNA的表达。结果稳定表达anti-pcDNA3-svv的Skov3-SVVanti组生存素蛋白表达较Skov3-neo和Skov3组明显降低,Skov3-SVVanti组细胞流式细胞仪检测显示其凋亡率为19%。Skov3-SVVanti组MDR-1 mRNA表达较Skov3和Skov3-neo组明显减少(P<0.01)。结论反义生存素核酸可诱导胃癌细胞凋亡,并能降低MDR-1mRNA表达。     

bcl-2反义核酸增强柔红霉素诱导原代白血病细胞凋亡的研究

研究表明 :bcl 2基因的过度表达可明显降低化疗药物引起的细胞凋亡 ,针对bcl 2mRNA翻译起始部位的反义核苷酸可抑制许多肿瘤细胞中bcl 2的表达 ,促进细胞的凋亡 ,提高肿瘤细胞对化疗的敏感性[1] 。我们在前一阶段的研究中[2 ] ,已经在bcl 2mRNA翻译起始区和蛋白编码区发现了2个有效反义作用靶点。本研究进一步观察这两个有效序列的反义寡核苷酸是否会增强柔红霉素 (DNR)诱导原代培养的急性白血病 (AL)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)的细胞凋亡 ,期望为白血病的治疗开辟一条新的途径。一、材料与方法1.病例选择 :AL 13例中急性粒细胞白血…     

人参皂甙单体Rh2对人脑胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响及其机制探讨

目的观察人参皂甙单体Rh2（GS-Rh2）对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法用GS-Rh2处理人脑胶质瘤U251细胞,采用MTT法检测U251细胞增殖抑制率,流式细胞仪和Annexin V-FITC/PI双染法观察U251细胞凋亡情况,TRAP-ELISA法检测U251细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测U251细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA的表达。结果 5、10、20、40、80μg/ml GS-Rh2组U251细胞增殖抑制率分别为20.42%、32.19%、45.09%、57.37%、73.82%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC30、IC50、IC70值分别为9.7、25.2、68.4μg/ml。FITC和PI荧光双参数点图显示实验组细胞分布区域与对照组相比出现明显改变,随着药物浓度的增加,早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。9.7、25.2、68.4μg/ml GS-Rh2处理12、24、48、72 h后U251细胞端粒酶活性随GS-Rh2浓度增加和作用时间的延长而降低。浓度为25.2μg/ml GS-Rh2作用24、48、72 h的U251细胞hTERTmRNA与β-actin灰度值比为0.964 9±0.004 2、0.401 8±0.001 4、0.297 8±0.001 8,对照组为0.976 4±0.005 1。作用48、72 h U251细胞hTERT mRNA与β-actin灰度值比与对照组相比P均〈0.05;作用48、72 h者相比P〈0.05。结论 GS-Rh2能够诱导人脑胶质瘤U25l细胞凋亡,抑制U25l细胞增殖。其机制与其抑制hTERT基因表达,降低端粒酶活性有关。     

MGMT反义RNA对人脑胶质瘤细胞系U251／BCNU耐药性逆转的研究

为逆转胶质瘤的耐药性,模拟临床亚硝基脲类药物的用药程序,在体外建立由MGMT介导的人脑胶质瘤耐药细胞系U251／BCNU,并进行细胞耐药性检测和细胞中MGMTmRNA表达的分析;观察MGMT反义RNA对U251／BCNU细胞MGMT表达的调节作用及对U251／BCNU细胞BCNU敏感性的影响。经过5次用药过程,首次在体外成功地建立了对BCNU具有稳定抗性的U251／BCNU,其对BCNU的耐受程度约为U251的17倍;RT－PCR结果显示,U251／BCNU细胞有MGMTmRNA的表达。MGMT反义RNA的表达载体pLaMT5SN和pLaMTSN能够在一定程度上降低U251／BCNU细胞中MGMTmRNA的表达水平,提高其对BCNU的敏感性。认为MGMT反义RNA能够在一定程度上抑制MGTMT的表达水平,提高肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的敏感性。     

Potentiation of dexamethasone-, paclitaxel-, and Ad-p53-induced apoptosis by Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides in drug-resistant multiple myeloma cells

Overexpression of Bcl-2 in myeloma cells results in resistance to drugs such as dexamethasone (DEX), adenovirus-mediated delivery of p53 (Ad-p53), and paclitaxel (TAX), which work through the intrinsic apoptotic pathway. Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides (Bcl-2-ASO) have been shown to induce apoptosis in cancer cells, as a single agent or, better, in combination with chemotherapy. We hypothesized that down-regulation of Bcl-2 by Bcl-2-ASO will sensitize drug-resistant myeloma cells to undergo apoptosis. In this paper we report a detailed time/dose study of the effect of Bcl-2-ASO on myeloma cells with varying levels of Bcl-2. Treatment of myeloma cells expressing relatively low levels of Bcl-2 with Bcl-2-ASO resulted in a substantial apoptosis concomitant with a substantial depletion of Bcl-2 protein. Maximal apoptosis was observed at 5 to 10 microg/mL Bcl-2-ASO, following 4 days of treatment. Down-regulation of Bcl-2 and apoptosis were time and dose dependent and were sequence specific. In these cell lines, apoptosis was accompanied by activation of caspase-9 and caspase-3 and by release of cytochrome c to the cytosol. In contrast, high Bcl-2-expressing myeloma cells were practically resistant to Bcl-2-ASO. Most important, however, pretreatment of myeloma cells expressing high levels of Bcl-2 with Bcl-2-ASO increased the extent of DEX-, TAX-, and Ad-p53-induced apoptosis from 10%-20% to 70%-90%. Increased apoptosis was accompanied by additional decrease in Bcl-2 protein. Similar results for down-regulation of Bcl-2 and apoptosis were obtained with freshly isolated myeloma cells. These data support development of clinical trials with combinations of Bcl-2-ASO and DEX, TAX, or Ad-p53 in the treatment of refractory myeloma patients.     

人参皂甙Rh2对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响及机制探讨

目的观察人参皂甙Rh2（GS-Rh2）对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响,并探讨其机制。方法人脑胶质瘤细胞株U251经GS-Rh2处理后,采用MTT法测算细胞抑制率,用流式细胞术测算细胞凋亡率,用RT-PCR检测U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA,用Western blot法检测U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果 GS-Rh2对U251具有抑制作用,并呈剂量依赖性;根据细胞增殖抑制曲线计算出GS-Rh2作用于细胞的抑制浓度（IC）,求得IC30、IC50、IC70值分别为10.6、22.3、70.2μg/ml;GS-Rh2可诱导U251凋亡,并呈剂量依赖性。在GS-Rh2作用下,U251中Bcl-2 mRNA、蛋白呈明显低表达,随着GS-Rh2作用时间延长,Caspase-3 mRNA、蛋白表达逐渐增高。结论 GS-Rh2可明显抑制U251增殖,诱导其凋亡,其机制与GS-Rh2下调U251中Bcl-2 mRNA及蛋白表达、上调Caspase-3 mRNA及蛋白表达有关。     

Bcl-2 antisense oligodeoxyribonucleotide increases apoptosis of lung carcinoma cells induced by cisplatin]

OBJECTIVE: To study the effect of antisense oligodeoxyribonucleotide (ODN) to apoptotic suppress gene bcl-2 on apoptosis of lung carcinoma cells induced by cisplatin. METHODS: The lung carcinoma cells expressing bcl-2 were chosen to participate in this experiment. Cultured cells were divided into 7 groups: ODN, nonsense, ODN + cisplatin, nonsense + cisplatin, cisplatin, lipofectin and control. Bcl-2 antisense or nonsense mixed with lipofectin was added into above corresponding cultured cells. After cultured for 6 hours, cisplatin was added into corresponding groups. The cells were cultured again for 16 hours. And then, the cells were smeared on slides. Apoptotic cells were labeled with TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) method on cell smears. Apoptotic index (AI) was counted to show the percentage of apoptotic cancer cells. The immunocytochemistry was used to detect the expression of bcl-2 in carcinoma cells. RESULTS: The bcl-2 expression of cancer cell in ODN group was significantly decreased compared to the control and nonsense groups. The AI of ODN + cisplatin group was 16.4 +/- 1.7, cisplatin group 4.1 +/- 0.8, antisense group 5.9 +/- 0.2, nonsense group 3.3 +/- 0.7, nonsense + cisplatin 7.6 +/- 1.1, lipofectin 5.1 +/- 0.9, control group 3.6 +/- 0.6. The AI of antisense + cisplatin group was significantly higher than that of other groups. CONCLUSION: Antisense oligodeoxyribonucleotide to bcl-2 can inhibit significantly the expression of bcl-2 of lung cancer cells and increase apoptosis of cancer cells induced by cisplatin.     

HCMV感染对神经胶质细胞NGF表达的影响

目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染时神经胶质细胞内源性神经生长因子(NGF)的表达变化.方法 采用免疫荧光法检测HCMV即刻早期蛋白(IE),RT-PCR技术检测正常培养和感染HCMV的神经胶质瘤(U251)细胞的NGF.结果 HCMV能够感染U251细胞,U251能够表达NGF,感染HCMV后初期NGF表达没有变化,后期明显下调(P＜0.05).结论 HCMV能够诱导U251细胞中的NGF表达异常.     

C-myc反义寡脱氧核苷酸抑制类风湿滑膜细胞增生诱导滑膜细胞凋亡

目的 研究硫代磷酸化修饰的c—myc反义寡脱氧核苷酸(antisens phosphorothioate oligodeoxynucleotides，ASP-ODN)在血清存在条件下对培养的人类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)滑膜B型细胞增生的影响及诱导凋亡的作用。方法 培养RA滑膜B型细胞，合成c—myc AS P-ODN，以阳离子脂质体。lipofectin为载体转染滑膜B型细胞，用显微镜观察和四唑盐(MTT)法检测对细胞增生的抑制作用，用荧光染色、荧光显微镜、流式细胞仪检测诱导细胞凋亡和c—myc蛋白表达的变化。结果c—myc AS P-ODN呈序列特异性抑制滑膜B型细胞增生并下调c—myc蛋白表达，诱导滑膜B型细胞凋亡。结论 c—myc AS P-ODN可能对RA的滑膜增生性炎症具有潜在的治疗作用，c—myc原癌基因可能成为反义核酸技术治疗RA的靶基因。     

TNF-α诱导脑胶质瘤细胞凋亡过程中NF-κB、IκB活性的研究

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)及其抑制因子(IκB)在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人脑胶质瘤细胞株U 251细胞凋亡过程中生物活性的变化。方法应用流式细胞仪检测TNF-α对U-251细胞生长的抑制和诱导凋亡作用。用免疫组化方法检测肿瘤细胞p65的表达,用W estern b lot检测IκB蛋白的变化。结果TNF-α可诱导U 251细胞凋亡,激活细胞中p65并诱导IκB降解;抗氧化剂二硫碳吡咯烷醇(PDTC)可抑制TNF-α诱导的IκB的降解及NF-κB的激活,增强TNF-α诱导U 251细胞的凋亡。结论TNF-α在诱导U 251细胞凋亡的过程中可激活NF-κB。抑制NF-κB活性,可增强TNF-α诱导细胞凋亡的作用。     

反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒表达诱导凋亡的体外研究

目的：研究反义脱氧寡核苷酸（ASON）抗乙型肝炎病毒（HBV）复制表达的作用。方法：设计合成针对HBV PreS2的ASON并设非互补序列作对照,以人肝癌细胞系2.2.15细胞为细胞模型,应用ELISA观察了ASON对HBV基因表达的抑制作用,流式细胞仪观察了ASON对宿主细胞凋亡和增殖的影响。应用RIA法和MTT法观察ASON对细胞代谢的影响。结果：ASON可有效地抑制HBV基因的表达,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为66%和91%,而非互补序列对照无抑制作用：ASON可诱导宿主细胞凋亡,用药后第3天和第6天凋亡率分别为6.10%和6.43%,增殖指数分别为37%和36%,RIA和MTT法表明ASON对宿主细胞无细胞毒性作用。结论：ASON不仅以序列特异性方式发挥抗病毒作用,而且可能以凋亡的方式清除HBV。