Ghrelin对胰岛β细胞作用及机制的研究

Ghrelin是一种脑肠肽，表达于人体各种不同的器官和组织中，其中包括胰岛。Ghrelin在体内以乙酰化和非乙酰化两种结构存在，发挥胰岛素调节作用的主要是乙酰化ghrelin。Ghrelin通过与生长激素促分泌素受体结合发挥重要的内分泌作用。研究表明，ghrelin可通过作用于胰岛β细胞的电压门控Ca^2＋通道、受体门控Ca^2＋通道调节胰岛素的分泌。此外，ghrelin还可以通过磷脂酶C等细胞内信号途径及K^＋通道调节胰岛素的分泌反应。     

游离脂肪酸对胰岛β细胞及α细胞功能影响研究

分为FFA正常组与升高组,分别对血糖、胰岛素、C肽、胰高血糖素(0、60、120、180min)结果进行对比分析.结果两组比较,其血糖、胰岛素、C肽、胰高血糖素(0、60、120、180min)均无显著性差异.结论FFA升高组对胰岛β细胞及α细胞功能影响与正常组相比无差异.可能FFA不是一个独立的损害胰岛细胞功能的因素,以及同时存在一些保护胰岛细胞、抵消FFA毒性作用的因素有关.另外,FFA损害的可能是胰岛素分泌的第一时相.     

胰岛与Sertoli细胞体外共同培养

目的 研究胰岛体外长期培养的新方法。方法 采用绿色荧光蛋白（GFP）标记成年SD大鼠胰岛，与Sertoli细胞共同培养20周，应用形态学方法和透射电镜观察胰岛细胞单独培养和共同培养的生长特性；放射免疫法测定胰岛素分泌量。结果 胰岛单独培养3周。细胞存活率显著下降，胰岛阳性细胞数目减少，胰岛素24h累积分泌量和对葡萄糖刺激的反应性下降，大部分胰岛β细胞超微结构破坏，分泌颗粒减少；与Sertoli细胞共同培养的胰岛存活时间显著延长，细胞存活率和胰岛素阳性细胞数目较单独培养显著增加，胰岛素分泌量始终处于高水平状态，培养20周胰岛β细胞超微结构基本正常，结论 大鼠胰岛与Sertoli细胞共同培养可以促进胰岛生长，显著延长存活时间，是一种新的体外长期培养胰岛的方法。     

MicroRNAs对胰岛β细胞功能的影响

近年已有大量研究证实,在β细胞功能调节中,microRNA起重要作用.MicroRNA是基因表达的负调控因子,在β细胞的增殖、生存方面起关键作用.特定microRNA水平的改变与β细胞代偿功能相关,促进β细胞存活和发挥作用的激素或生物活性肽可调节microRNA水平.相反,细胞因子、高脂血症、高血糖和氧化型低密度脂蛋白引起的microRNA的表达修饰,可以促进β细胞功能衰竭和凋亡.     

β细胞素对体外培养大鼠胰岛的影响

研究β细胞素(BTC)对体外培养大鼠胰岛的作用。BTC无促胰岛急性分泌作用,但对长期培养大鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)具有一定保护效力;实时PCR及免疫荧光检测胰高血糖素、胰岛素、PDX-1、葡萄糖转运子2的表达未随培养时间延长而丰度下降,BTC可能不是通过调节上述基因的表达来维护胰岛GSIS功能的。     

游离脂肪酸对胰岛β细胞功能影响的研究进展

胰岛素抵抗和B细胞分泌功能缺陷是2型糖尿病发生的重要病理生理学基础,近年来研究显示,脂代谢紊乱在其发病中起着重要作用,2型糖尿病患者常伴有脂代谢紊乱,血浆游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）水平升高。脂毒性（lipotoxicity）是指血中FFA水平长期升高,超过脂肪组织储存能力和各组织对FFA的氧化能力,使过多的FFA以甘油三酯（TG）形式沉积在非脂肪组织而造成该组织的损伤。FFA不仅参与了胰岛素抵抗的发生,     

游离脂肪酸对胰岛β细胞及α细胞功能影响研究

分为FFA正常组与升高组，分别对血糖、胰岛素、C肽、胰高血糖素(0、60、120、180min)结果进行对比分析。结果两组比较，其血糖、胰岛素、C肽、胰高血糖素(0、60、120、180min)均无显著性差异。结论FFA升高组对胰岛β细胞及α细胞功能影响与正常组相比无差异。可能FFA不是一个独立的损害胰岛细胞功能的因素，以及同时存在一些保护胰岛细胞、抵消FFA毒性作用的因素有关。另外，FFA损害的可能是胰岛素分泌的第一时相。     

从胰岛β细胞看Ghrelin在糖尿病中扮演的角色

Ghrelin可由胰岛α、β、ε细胞及胃黏膜细胞等分泌,可能通过旁分泌、自分泌或内分泌作用影响β细胞的分泌功能;同时抑制胰岛β细胞凋亡。Ghrelin呈剂量依赖性抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌,并呈瞬时调节,与胰岛素共同参与生理条件下的摄食和体重调节。1型糖尿病患者的Ghrelin基础水平偏高,经胰岛素治疗后下降,因此被认为是1型糖尿病初发及胰岛素治疗有效的标志物。Ghrelin水平与2型糖尿病的发病呈负相关;机体胰岛素抵抗时Ghrelin水平下降,胰岛素分泌增加,葡萄糖耐受性提高,是早期2型糖尿病的一种保护机制。     

Ghrelin抑制胰岛β细胞胰岛素释放的机制探讨

目的探讨ghrelinx对小鼠胰腺β细胞株NIT-1细胞胰岛素释放的影响及其作用机制。方法NIT1细胞与不同浓度ghrelin和高浓度葡萄糖孵育后，放免法测定上清液胰岛素含量，RTPCR法检测葡萄糖转运子2（GluT2）、胰十二指肠同源盒-1（PDX-1）、含两个跨膜区的内向整流钾通道（Kir6．2）及磺酰脲受体1（SUR-1）等基因的表达。NIT-1细胞与不同浓度ghrelin孵育不同时间后，MTT法检测细胞增殖情况。结果（1）10^-9mol／L至10^-7mol／L ghrelin呈剂量依赖性抑制NIT-1细胞高浓度葡萄精刺激的胰岛素释放；（2）10^-7mol／L ghrelin硅著降低Kir6．2mRNA的表达，但对GluT2、PDX-1及SUR-1 mRNA的表达无明显的效应；（3）Ghrelin对NIT-1细胞的增殖无垃著影响。结论Ghrelin可抑制胰岛β细胞高浓度葡萄糖刺激的胰岛素释放，该效应可能是由于下调ATP敏感性钾通道组成成分Kir6．2基因的表达所致。     

高糖对胰岛β细胞功能影响研究进展

诸多研究表明长期而持续的高血糖是导致β细胞功能缺陷的重要因素,包括早期减少葡萄糖刺激的胰岛素分泌和最终不可避免地减少胰岛素基因转录和β细胞数量,本文就近几年来有关高血糖对胰岛β细胞功能影响的研究进展作简要归纳,深入认识糖尿病的发病机制和致病过程,将更好地防治2型糖尿病具有重要意义。     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化

目的 观察成熟胰岛细胞对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymalstem cells,mMSCs)的诱导分化作用,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供移植细胞来源.方法 采用贴壁法分离培养小鼠mMSCs,并传代扩增.应用共聚焦显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析其表面分子.经胆总管注入Ⅳ型胶原酶消化胰腺,行密度梯度离心获得胰岛细胞.运用Transwell共培养体系,取第3代mMSCs与胰岛细胞共培养,倒置显微镜观察细胞的生长及形态变化,细胞免疫化学法检测mMSCs胰岛素的表达,胰岛素释放试验检测胰岛素分泌.以单独培养mMSCs作为对照组.结果 从小鼠骨髓中获得的细胞培养48 h后呈长梭形,体积较大,1周后呈集落式生长,可传代培养.细胞表面分子Sca-1、CD29、CD44、CD105呈阳性,且表达水平较高,而CD34、CD45阴性,证实为mMSCs.与小鼠胰岛细胞共培养7 d后,部分mMSCs细胞胰岛素免疫组化染色呈阳性,胰岛素分泌量为(16.83±0.15)μIU/ml.结论 从小鼠骨髓中分离培养的mMSCs与胰岛细胞共培养后可以被诱导分化为胰岛样细胞,为在胰岛细胞移植治疗糖尿病中存在的供体缺乏和免疫排斥问题提供了新的解决方法 .     

胰岛淀粉样纤维对体外胰岛细胞膜的毒性作用

目的探讨胰岛淀粉样多肽（IAPP,也称胰淀素Amylin）的纤维状态胰岛淀粉样纤维（IAf）对胰岛细胞膜的毒性作用及可能机制。方法比较用可溶性IAPP和IAf孵化培养的胰岛细胞膜流动性的变化,并在黏附细胞仪570记录各组[Ca^2＋]i的动态变化;以10μmol/LIAf组为对照组,分别比较Ca^2＋通道阻断剂组、无Ca^2＋培养液组、胆固醇干预组[Ca^2＋]i的动态变化,了解[Ca^2＋]i变化与钙离子通道的关系。结果细胞膜流动性和[Ca^2＋]i在IAf组中呈剂量依赖性升高,与可溶性IAPP组及空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;而可溶性IAPP组与空白对照组间差异无统计学意义（P〉0.05）。Ca^2＋通道阻断剂预处理组加10μmol/LIAf刺激后[Ca^2＋]i变化与对照组相比差异无统计学意义（P〉0.05）,而无Ca^2＋培养液组和胆固醇预处理组加10μmol/LIAf刺激后[Ca^2＋]i变化均明显低于对照组（P〈0.01）。结论IAf可能通过改变胰岛细胞膜流动性和细胞内钙超载而导致细胞损伤,钙超载是由于外钙内流所致,其途径可能并非经过钙离子通道,可能与“淀粉样通道”形成有关。胆固醇具有拮抗此毒性的作用。     

The effects of islet cell surface antibodies on the metabolic function of mouse islet B cells in vitro

Immunoglobulin (Ig) fractions from the plasma of a group of newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus (type 1) patients and a set of control subjects were assessed for their effects on isolated mouse islet function. It was found that Igs from type 1 patients caused a significant inhibitory effect on insulin secretion when incubated with mouse islets as compared with controls (25.6±2.9 pg islet^–1 h^–1 vs 44.7±7.7 pg islet^–1 h^–1,P<0.05). The plasma samples from which the Igs were obtained were then tested for the presence of antibodies to the mouse islet cell surface (ICSA). Four of the nine patients were positive for ICSA, and plasma samples from eight control subjects were all negative. ICSA-positive samples appeared to have the greatest inhibitory effect on insulin secretion when compared with their respective controls (53.3±7.0 pg insulin islet^–1 min^–1 vs 30.9±3.7 pg insulin islet^–1 min^–1,P<0.05). In contrast, it was also found that ICSA-positive Ig fractions had no significant effect on glucose oxidation when co-incubated with mouse islets as compared with the controls (11.3±2.3 pmol islet^–1 h^–1 vs 11.2±2.9 pmol islet^–1 h^–1). These studies suggest that Igs from newly diagnosed type 1 patients containing ICSA may impair insulin secretion from isolated mouse islets by mechanisms which do not involve the inhibition of B-cell glucose metabolism.     

磺脲类药物对胰岛β细胞凋亡影响的研究进展

磺脲类降糖药物目前广泛应用于2型糖尿病的临床治疗。它主要的降糖机制是通过与胰岛细胞膜上的磺脲类受体结合，关闭了由SUR1和KIR6．2组成的钾通道（KATP），导致了细胞膜的去极化，触发了L型钙离子通道开放，从而使钙离子大量内流，促进了胰岛细胞分泌胰岛素。但与此同时，大量钙离子内流，造成了胰岛细胞的钙超载，加之胰岛细胞活化过程中产生的大量氧自由基都造成了胰岛细胞的损伤。故很多文献报道，磺脲类药物对胰岛细胞有诱导凋亡作用，但机制各有不同。事实上，不同的磺腮茨药物对于胰岛β细胞凋亡的作用机制尚未完全明确，且有很多争论。新近研究表明，一些新型磺脲类药物剂型，如格列美脲对胰岛细胞凋亡的作用可能有所不同。     

内毒素诱导大鼠胰岛细胞凋亡作用

目的：探讨内毒素（LPS）对大鼠胰岛细胞凋亡作用的机制。方法：观察腹腔注射2mg/kg LPS的大鼠血清胰腺NO含量动态变化,用原位杂交方法检测胰岛细胞诱生型一氧化氮合酶（iNOS)mRNA;采用单细胞凝胶电泳和DNA凝胶电泳技术,分析外源硝普钠（NO供体）和LPS离体条件下对胰岛细胞的损伤。结果：注射PLS 6h,大鼠血清NO水平明显升高并持续到3天,胰腺NO含量6h升高,12h达峰值,24h恢复至正常,胰岛细胞iNOS mRNA表达,6h开始升高,12h明显增强,体外试验显示。外源NO明显引起胰岛细胞NDA断裂,出现慧星尾和凋亡梯状带,并呈剂量依赖关系,高浓度NO（60mmol/L SNP)胰岛细胞DNA随机降解,LPS离体条件下,对胰岛细胞损伤作用不明显,结论：内毒素通过整本作用刺激炎症 细胞浸润胰岛并诱导iNOS表达,产生NO介导胰岛细胞凋亡和功能损害。     

猪骨髓间充质干细胞对共培养肝细胞的作用及其机制

目的 探索细胞外基质(ECM)在猪肝细胞与骨髓间充质干细胞(MSCs)体外共培养中的表达与分布规律. 方法自中华实验猪髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCs随机混合培养,观察肝细胞形态和功能的变化情况.用免疫细胞化学染色法观察ECM的表达和分布情况.RNA干扰MSCs后继续观察共培养肝细胞的功能变化情况.多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法.结果 第3代MSCs纯度>90%;肝细胞活率>95%,纯度>99%.共培养组肝细胞迅速黏附于MSCs表面,呈肝细胞岛样分布.共培养组肝细胞白蛋白分泌水平和尿素合成能力自共培养第1天起均明显高于单纯肝细胞组(P值均<0.01),并在第2天达到高峰,分别为(457.71士22.62)ng和(69.05±2.12)μg.免疫细胞化学检测结果显示共培养组MSCs表达多种ECMl RNA干扰实验进一步证实ECM的存在与共培养中肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成功能有关.结论 骨髓MSCs通过分泌多种ECM改善共培养肝细胞的形态与功能.     

Gene expression heterogeneity in human islet endocrine cells in vitro: the insulin signalling cascade

Aims/hypothesis Insulin secretion is a highly regulated mechanism involving a complex insulin-dependent network of communication between alpha, beta and delta cells. However, whereas the role of insulin in beta cells has been well documented, very little is known about its role in alpha and delta cells. Having recently demonstrated heterogeneity of insulin receptor (INSR) isoform expression in these three endocrine cell types, our current study aimed to characterise the expression pattern of the multiple isoforms involved in the insulin signal transduction cascade in human alpha, beta and delta cells in vitro. Materials and methods cDNA samples prepared from single human islet cells were subjected to nested PCRs. Results Of 706 cells analysed, 15% were alpha cells, 28% beta cells, 8% delta cells and 46% non-endocrine cells. Profiling of expression of the insulin signalling cascade elements showed a heterogeneity between islet cell types, although at least one member of each protein family was expressed in the three populations of endocrine cells. Thus, the mRNAs coding for INSR-B, phosphoinositide-dependent protein kinase-1 and the human homologue of v-akt murine thymoma viral oncogene homologue 1 (AKT1) could not be detected in alpha cells, but were expressed by beta and delta cells. In addition, while the insulin receptor substrates IRS1 and IRS2, phosphoinositide-3-kinase, catalytic, beta polypeptide (PIK3CB) and AKT2 were expressed with relatively low frequencies in alpha and delta cells (<17% for IRS1, IRS2, PIK3CB; <25% for AKT2), their frequencies of expression in beta cells were 50, 33, 33 and 100%, respectively. Conclusions/interpretation Our results suggest that insulin signalling cascade elements in human alpha, beta and delta cells have distinct expression patterns. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorised users.     

SIRT1对高糖高脂培养胰岛微血管内皮细胞炎性反应激活的影响

目的 分析高糖、高脂环境下胰岛微血管内皮细胞(IMVC)分泌E-选择素、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的变化,研究沉默信息调节蛋白1(SIRT1)/核因子-κB信号途径异常在内皮细胞炎性反应激活中的作用.方法 合成含绿色荧光蛋白报告基因的小鼠SIRT1基因重组质粒,以Lipofectamine 2000转染IMVC.之后将IMVC分为4组:正常对照组、高糖高脂组、高糖高脂+ SIRT1基因转染组、高糖高脂+基因转染对照组.高糖高脂组以33.3 mmol/L葡萄糖+0.5mmol/L棕榈酸处理48 h.高糖高脂+SIRT1基因转染组在高糖高脂处理前以SIRT1基因重组质粒预处理48 h;高糖高脂+基因转染对照组在高糖高脂处理前以空质粒进行预处理48 h.应用实时荧光定量PCR法检测SIRT1基因转染效果及各组核因子-κB的mRNA水平,应用酶联免疫吸附法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、E-选择素的水平.结果 与正常对照组相比,高糖高脂组SIRT1 mRNA表达明显下降(0.58 ±0.12,P＜0.01);而高糖高脂+SIRT1基因转染组的SIRT1基因表达明显升高,与高糖高脂组相比差异显著[(1.55±0.43)比(0.65±0.37),P＜0.01].与正常对照组相比,高糖高脂组核因子-κB mRNA(1.59 ±0.32,P＜0.01)、E-选择素[(48.46±1.04)比(67.12±0.57) ng/L,P＜0.01]、TNF-α[(467.46±8.98)比(621.14±11.26) ng/L,P＜0.01]、IL-1β[(63.32±1.48)比(118.43±1.40) ng/L,P＜0.01]的水平明显升高(P＜0.01).与高糖高脂组相比,高糖高脂+SIRT1基因转染组核因子-κB mRNA (0.95±0.31,P＜0.01)及TNF-α[(451.38±15.91)比(618.89±7.23) ng/L,P＜0.01]明显下降(P＜0.01),E-选择素、IL-1β无明显变化(P＞0.05).结论 高糖高脂环境下,IMVC存在炎性反应激活,可释放大量炎性反应细胞因子.SIRT1-核因子-κB-TNF-α通路异常与IMVC的炎性反应激活密切相关,早期干预该信号通路可能在预防及治疗2型糖尿病的胰岛炎性反应中具有重要意义.     

In vitro pancreas duodenal homeobox-1 enhances the differentiation of pancreatic ductal epithelial cells into insulin-producing cells

AIM: To observe whether pancreatic and duodenal homeobox factor-1 enhances the differentiation of pancreatic ductal epithelial cells into insulin-producing cells in vitro. METHODS: Rat pancreatic tissue was submitted to digestion by collegenase, ductal epithelial cells were separated by density gradient centrifugation and then cultured in RPMI1640 medium with 10% fetal bovine serum. After 3-5 passages, the cells were incubated in a six-well plate for 24 h before transfection of recombination plasmid XlHbox8VP16. Lightcycler quantitative real-time RT-PCR was used to detect the expression of PDX-1 and insulin mRNA in pancreatic epithelial cells. The expression of PDX-1 and insulin protein was analyzed by Western blotting. Insulin secretion was detected by radioimmunoassay. Insulin- producing cells were detected by dithizone-staining. RESULTS: XlHbox8 mRNA was expressed in pancreatic ductal epithelial cells. PDX-1 and insulin mRNA as well as PDX-1 and insulin protein were signifi cantly increased in the transfected group. The production and insulin secretion of insulin-producing cells differentiated from pancreatic ductal epithelial cells were higher than those of the untransfected cells in vitro with a significant difference (1.32 ± 0.43 vs 3.48 ± 0.81, P < 0.01 at 5.6 mmol/L; 4.86 ± 1.15 vs 10.25 ± 1.32, P < 0.01 at 16.7 mmol/L). CONCLUSION: PDX-1 can differentiate rat pancreaticductal epithelial cells into insulin-producing cells in vitro. In vitro PDX-1 transfection is a valuable strategy for increasing the source of insulin-producing cells.