雷公藤内酯醇对AngⅡ介导的肾小球系膜细胞核因子-κB活化及MCP-1表达的影响

目的：观察不同剂量雷公藤内酯醇对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的肾小球系膜细胞（GMC）核因子-κB（NF-κB）活化及单核细胞趋化因子-1（MCP-1）表达的影响，探讨雷公藤内酯醇抑制肾小球系膜细胞炎症因子表达的可能机制。方法：分离培养大鼠GMC，用10^-6mol／L AngⅡ刺激GMC，将培养的大鼠GMC随机分为5组：正常培养对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ和3种不同浓度的雷公藤内酯醇共孵育组。分别采用酶联免疫激光扫描共聚焦显微镜、ELISA、RT—PCR法、Western Blot法，检测GMC内NF-κB p65核易位阳性率、细胞培养上清液中MCP-1水平、GMC内MCP-1 mRNA表达及ⅠκBα蛋白表达水平。结果：雷公藤内酯醇呈剂量依赖性下调AngⅡ介导的大鼠GMC内NF-κB p65水平，抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC MCP-1及MCP-1 mRNA的表达，抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC内ⅠκBα蛋白表达下调。结论：雷公藤内酯醇能够抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC ⅠκB的磷酸化降解及NF—κB活化；抑制AngⅡ诱导的大鼠GMCMCP-1 mRNA表达MCP-1分泌。     

三七总苷对氧化低密度脂蛋白诱导大鼠系膜细胞的影响

目的：探讨三七总苷（PNS）对氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）诱导大鼠肾小球系膜细胞合成细胞外基质（ECM）、表达转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响。方法：采用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）检测纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）及TGF-β1的mRNA表达;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测FN、ColⅣ及TGF-β1的蛋白含量;免疫细胞化学观察核转录因子-κB（NF-κB）p65核转位。结果：OX-LDL（50μg/ml）诱导系膜细胞FN、ColⅣ及TGF-β1表达增强,NF-κB活化,p65核转位率增加;PNS（200~800μg/ml）作用一定时间后,FN、ColⅣ及TGF-β1表达降低,NF-κBp65核转位率明显低于诱导组。结论：PNS能够抑制OX-LDL诱导的系膜细胞FN、ColⅣ合成,并抑制TGF-β1表达;这种效应可能与影响NF-κB核转位有关。     

雷公藤甲素对TNF-α诱导的肾系膜细胞MCP-1和ICAM-1表达干预及其机制的研究

目的：观察雷公藤甲素对TNF-α诱导的肾系膜细胞（GMC）MCP-1,ICAM-1表达的干预并探讨其作用机制。方法：把培养的GMC按刺激及干预情况分为正常对照组、TNF-α刺激组、雷公藤甲素低（5ng/ml）,中（10ng/ml）,高浓度（15ng/ml）干预组,以及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）干预组（阳性对照组）、PDTC与雷公藤甲素（10ng/ml）联合干预组。TNF-α刺激干预诱导24h后,分别提取细胞上清液、细胞质、细胞核等成分,采用ELISA法检测MCP-1,ICAM-1,IκB,IκBα,ELISA结合EMSA方法检测各组NF-κB p65,以RT-realtime PCR方法检测MCP-1,ICAM-1的mRNA。结果：TNF-α刺激组MCP-1、ICAM-1的mRNA及蛋白表达、NF-κB p65分子水平较对照组显著增高（P〈0.01）;各浓度雷公藤甲素或PDTC干预后上述指标显著下降（P〈0.01）,其中PDTC与雷公藤甲素联合干预组较单用PDTC干预组MCP-1、ICAM-1更低。相关分析表明NF-κB p65与MCP-1及ICAM-1的蛋白和mRNA表达水平呈正相关。GMC经TNF-α刺激后IκB有所下降,雷公藤甲素呈剂量依赖性上调κB,TNF-α刺激后磷酸化的IκBα较正常对照组显著升高（P〈0.05）,低浓度雷公藤甲素可显著下调其水平（P〈0.05）。结论：雷公藤甲素能显著抑制GMC分泌MCP-1、ICAM-1等促炎因子的mRNA及蛋白表达,其机制可能是促进IκB表达上调,并抑制IκBα磷酸化,从而阻断细胞核NF-κB p65活化所致。     

白细胞介素-1β激活核转录因子-κB介导A549细胞分泌白细胞介素-8的研究

目的研究白细胞介素-1β(IL-1β)对肺II型上皮A549细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)的诱导作用,探讨相关的细胞内信号通道的激活和传导的机理。方法以1ng/ml终浓度的IL-1β干预经核转录因子-κB(NF-κB)的IKK2复合物抑制物(AS602868)预处理的A549细胞,Western blot检测IL-1β干预后细胞内磷酸化IκBα(p-IκBα)和IκBα蛋白的表达水平;激光扫描共焦显微镜(LSCM)检测NF-κB的p65和p50蛋白的核转移过程;ELISA检测NF-κB的p65和p50蛋白与DNA结合活性及IL-8蛋白的释放。结果IL-1β干预后细胞内p-IκBα蛋白明显升高,IκBα蛋白明显下降;LSCM扫描显示p65和p50蛋白从胞浆向胞核转移,同时p65和p50与DNA结合活性明显升高(P<0.01);IL-8的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。细胞经AS602868的预处理,阻断了细胞内p-IκBα蛋白升高和IκBα蛋白降解;减少了p65和p50蛋白的核转移和与DNA结合活性(P<0.01);降低了IL-8蛋白的表达水平(P<0.01)。结论IL-1β通过激活NF-κB介导了A549细胞分泌IL-8,结果提示可能通过抑制NF-κB信号通道的方法,减轻呼吸机相关肺损伤(VALI)的生物性损伤。     

脂氧素A4对脂多糖活化小鼠巨噬细胞NF-κB和TNF-α转化酶的影响

目的 研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）活化的小鼠巨噬细胞NF-κB及TNF-α转化酶的影响。方法 小鼠RAW 264．7巨噬细胞株培养于细胞培养板,随机分为空白对照组、LPS处理组（LPS 1μg/ml）和LPS＋LXA4组（LPS 1μg/ml＋LXA4 10^-7mol/L）。酶联免疫吸附法测定上清液TNF-α水平,提取细胞总蛋白,Western blot法测定NF-κB p65、IκB-α及TNF-α转化酶含量,荧光素酶报告质粒测定NF-κB活性。结果 LXA4抑制LPS活化的RAW 264．7巨噬细胞IκB-α降解、NF-κB p65核转位及NF-κB活性,同时抑制TNF-α蛋白表达和上调TNF-α转化酶蛋白表达。结论 LXA4通过抑制NF-κB活性和下调TNF-α转化酶表达而减少LPS活化的RAW264．7巨噬细胞分泌TNF-α。     

氧化低密度脂蛋白刺激人肾小球系膜细胞产生单核细胞趋化蛋白-1由核因子-κB活化调控

目的 研究核因子ＫＢ（ＮＦ－ＫＢ）在氧化低密度脂蛋白（Ｏｘ- ＬＤＬ）诱导的体外培养的人肾小球系膜细胞表达单核／巨噬细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）中的作用。方法 采用凝胶迁移率变动分析检测ＮＦ－ＫＢ的ＤＮＡ结合活性变化，以免疫组织化学观测细胞内ｐ６５的核转位，用细胞ＥＬＩＳＡ法检测细胞内 ＭＣＰ－１及ＩＫＢα蛋白含量变化。结果 不同浓度（１０、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ）Ｏｘ－ＬＤＬ刺激肾小球系膜细胞均可引起细胞ＮＦ-ＫＢ的ＤＮＡ结合活性增强、ＩＫＢα蛋白表达下降以及ＭＣＰ－１蛋白表达增强，以５０μｇ／ｍｌ刺激１ｈ ＮＦ－ＫＢ活化及ＩＫＢα表达减弱最明显，作用２４ｈＭＣＰ-１表达水平最高。ＮＦ－ＫＢ俯活化的同时伴有ｐ６５核转位。上述效应可被ＮＦ－ＫＢ特异性抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯（ＰＤＴＣ）所抑制。结论Ｏｘ－ＬＤＬ刺激人肾小球系膜细胞产生ＭＣＰ－１是由ＮＦ－ＫＢ调控，ＮＦ－ＫＢ参与了脂质肾损害的发病过程。     

姜黄素诱导的耐受性树突状细胞及其机制

目的 探讨姜黄素(Cur)诱导耐受性树突状细胞(DC)的效果及其机制.方法 分别用不同浓度Cur(0、10、20和30μmol/L)作用于Wistar大鼠来源的不成熟DC,流式细胞仪分析其表型.再以30μmol/L的Cur作用于不成熟DC,加或不加脂多糖(LPS)刺激,流式细胞仪检测其吞噬葡聚糖的能力,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定DC分泌白细胞介素12(IL-12)的能力,Western印迹法检测DC中核因子кB(NF-кB)p65和RelB核转位,NF-кB DNA结合ELISA和荧光素酶报告基因检测核内NF-кB活性,混合淋巴细胞反应检测其刺激Lewis大鼠T淋巴细胞增殖的能力.结果 Cur能显著抑制DC共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达,呈剂量依赖性,当Cur的浓度达30 μmol/L时,其共刺激分子的表达与不成熟DC比较,差异无统计学意义.DC在LPS刺激下(LPS组),吞噬葡聚糖的DC占(36.6±7.2)%,IL-12的分泌量达(415.9±42.7)pg/ml,其核内RelB及NF-кB p56高表达,RelB DNA结合活性和NF-кB p65 DNA结合活性分别为0.65±0.08和0.74±0.07,报告基因荧光素酶活性是对照细胞的435%,该DC有较强的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力.而先以30μmol/L Cur作用于DC,然后再加入LPS者(Cur+LPS组),吞噬葡聚糖的DC占(78.6±14.2)%,明显高于LPS组(P＜0.01)IL-12的分泌量为(97.5±19.6)pg/ml,明显低于LPS组(P＜0.01);其核内RelB及NF-кB p56低表达;RelB DNA结合活性和NF-кB p65 DNA结合活性分别为0.15±0.06和0.29±0.06,均明显低于LPS组(P＜0.01);报告基因荧光素酶活性是对照细胞的197%,明显低于LPS组(P＜0.01);该DC刺激同种T淋巴细胞增殖的能力明显弱于LPS组.结论 Cur诱导产生耐受性DC可能是通过抑制DC中NF-кB的活化实现的.     

ERK1/2-核因子-кB通路介导乙型肝炎病毒x蛋白抑制过氧化物酶体增殖物激活受体-α表达

目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α的抑制作用,并探讨其中的内在机制。方法培养人肝癌细胞系HepG2,转染HBx表达质粒,Western blot方法检测PPAR-α、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK,ERK1／2)和IкB蛋白的变化,凝胶迁移率实验检测核转录因子(NF)-кB蛋白的活性改变,分别加入MAPK和NF-кB特异性的抑制剂PD98059与吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC),观察PPAR-α蛋白的变化。结果(1)HBx质粒转染HepG2后,与对照组相比,ERK2表达增加,NF-кB被激活,PPAR-α的表达下调；(2)阻断NF-кB后,NF-кB的活性下降,PPAR-α的表达增加；(3)阻断MAPK后,转染HBx表达质粒,NF-кB的活性下降,PPAR-α的表达增加。结论HBx抑制细胞核转录因子PPAR-α的表达,可能与ERK1／2-NF-кB激活有关。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子KB活化的抑制作用

目的了解稀土元素镧对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)核因子κB(NF-κB)活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔 Mφ,分为:空白对照组,无刺激因素;LPS 组,用1μg/ml LPS 刺激30 min;镧离子(La~(3 ))组,用2.5 μmol/L La~(3 )刺激30 min;La~(3 ) LPS 组,先后用2.5μmol/L La~(3 )、1μg/mI LPS 各刺激30 min;La~(3 )/LPS 组,2.5μmol/L La~(3 )刺激30 min 后,洗涤细胞,再加入1μg/ml LPS 刺激30 min。采用细胞免疫荧光染色法观察 NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法捡测胞核中 NF-κB/p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内 NF-κB/p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)的表达量。ELISA 法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死冈子α(TNF-α)的含量。结果 (1)免疫荧光染色显示,空白对照组、La~(3 )组、La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组 Mφ绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS 组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组(P<0.01)。(2)胞核 NF-κB/p65蛋白活性:LPS 组吸光度值为0.435±0.066.与空白对照组(0.048±0.027)、La~(3 )组(0.062±0.049)、La~(3 ) LPS 组(0.066±0.031)、La~(3 )/LPS 组(0.108±0.017)比较,明显偏高(P<0.01)。(3)LPS 组 Mφ胞核 NF-κB/p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质 IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。(4)TNF-α含量:La~(3 )组培养上清液中 TNF-α含量低于试剂盒检测下限(25 pg/ml)及空白对照组(P<0.05),La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组低于 LPS 组(P<0.01),但高于空白对照组。结论 LPS 可激活小鼠腹腔 MφNF-κB/p65核移位,并使胞核中 NF-κB/p65的表达量和活性升高、胞质 IκBα蛋白表达下调,导致 TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子κB活化的抑制作用

目的 了解稀土元素镧对内毒素／脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞（Mφ）核因子KB（NF-κB）活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔Mφ,分为：空白对照组,无刺激因素：LPS组,用1μg／mlLPS刺激30min;镧离子（La^3＋）组,用2,5μmol／L La^3＋刺激30min;La^3＋＋LPS组,先后用2,5-μmol／L La^3＋、1μg／ml LPS各刺激30min;La^3＋／L PS组,2．5μmol／L La^3＋刺激30min后,洗涤细胞,再加入1μg／ml LPS刺激30min。采用细胞免疫荧光染色法观察NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测胞核中NF-κB／p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内NF-κB／p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α（IκBα）的表达量。ELISA法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果 （1）免疫荧光染色显示,空白对照组、La^3＋组、La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组M小绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组（P〈0.01）。（2）胞核NF-κB／p65蛋白活性：LPS组吸光度值为0．435±0．066,与空白对照组（0．048±0．027）、La^3＋组（0．062±0．049）、La^3＋＋LPS组（0.066±0.031）、La^3＋／LPS组（0．108±0.017）比较．明显偏高（P〈0．01）。（3）LPS组M由胞核NF-κB／p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。（4）TNF-α含量：La^3＋组培养上清液中TNF-α含量低于试剂盒检测下限（25pg／m1）及空白对照组（P〈0.05）,La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组低于LPS组（P〈0．01）,但高于空白对照组。结论 LPS可激活小鼠腹腔M由NF-κB／p65核移位,并使胞核中NF-κB／p65的表达量和活性升高、胞质IκBα蛋白表达下调,导致TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

地塞米松对脂多糖刺激THP-1释放炎性因子的影响及其机制

目的探讨地塞米松（Dexamethasone,DEX）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人外周血单核细胞（human peripheral mononuclear cell,THP-1）炎症因子释放的影响及其机制。方法体外培养人THP-1单核细胞,随机分为对照组（Control）、脂多糖组（LPS）和地塞米松组（DEX）。地塞米松组（1microg/ml）孵育地塞米松2 h后与脂多糖组（0.1μg/ml）均加入脂多糖刺激24 h。应用免疫蛋白印迹电泳法（Western blotting）检测各组细胞总蛋白、糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor ,GR）、磷酸化的糖皮质激素受体（p-GR）,IκB-α,磷酸化 IκB-α（p-IκB-α）,核因子κB （NF-κB）,磷酸化核因子κB （p-NF-ΚB）,巨噬细胞炎症趋化因子（MCP-1）的水平。用 ELISA 检测各组细胞培养上清中 MCP-1,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的表达水平,用实时定量 PCR（RT-PCR）检测各组细胞MCP-1,TNF-α和IL-6mRNA表达水平。结果 Westernblotting检测显示脂多糖组与对照组相比,脂多糖组 p-GR、p-NF-κB、p-IKB-α和 MCP-1蛋白表达水平明显升高（P〈0.05）,IκB-α表达明显下降（P〈0.05）,GR和 NF-KB表达水平无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR 和 ELASA 检测显示MCP-1,TNF-α和IL-6分泌水平和mRNA 表达水平均明显增高（P〈0.05）。与脂多糖组相比,地塞米松组p-NF-κB,p-IKB-α和MCP-1蛋白水平表达明显下降,以及 MCP-1,TNF-α和 IL-6分泌和mRNA水平也均表达明显降低,但p-GR和IκB-α蛋白表达水平明显增加（P〈0.05）,但在 NF-κB和 GR表达水平依然无明显差异（P〉0.05）。结论地塞米松预处理可通过激活糖皮质激素受体而下调 NF-κB活化从而抑制脂多糖诱导单核细胞THP-1产生的炎症反应。     

p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在单核细胞趋化蛋白1介导系膜细胞增殖及细胞外基质表达中的作用

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）介导大鼠系膜细胞（MCs）增殖及纤连蛋白（FN）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达中的调控作用。方法用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）评估不同浓度的MCP-1（12．5、25、50、100ng／ml）及p38MAPK阻断剂SB203580（1、5、10μmol／L）于不同时间对体外培养的大鼠MCs的增殖作用。采用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测细胞内FN、ColⅠmRNA的表达。用ELISA法检测上清液FN、ColⅠ蛋白含量。结果MCP-1能刺激MCs的增殖，呈剂量和时间依赖性（P〈0．05），而p38MAPK阻断剂明显抑制上述MCP-1的作用（P〈0.01）。MCP-1能使细胞FN、ColⅠ的表达上调，而p38MAPK阻断剂能抑制其上调表达的作用。结论p38MAPK信号转导通路在MCP-1介导大鼠MCs增殖及FN和ColⅠ表达中起调控作用。MCP-1在系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）的发病中起一定的作用。     

白细胞介素-1β激活核转录因子-kB介导A549细胞分泌白细胞介素-8的研究

目的研究白细胞介索-1β（IL-1β）对肺Ⅱ型上皮A549细胞分泌白细胞介素-8（IL-8）的诱导作用，探讨相关的细胞内信号通道的激活和传导的机理。方法以1ng／ml终浓度的IL-1β干预经核转录因子-KB（NF-KB）的IKK2复合物抑制物（AS602868）预处理的A549细胞，Western blot检测IL-1β干预后细胞内磷酸化IKBa（p-IKBu）和IkBα蛋白的表达水平；激光扫描共焦显微镜（LSCM）检测NF-KB的p65和p50蛋白的核转移过程；ELISA检测NF-KB的p65和p50蛋白与DNA结合活性及IL-8蛋白的释放。结果IL-1β干预后细胞内p-IKBa蛋白明显升高，IKBd蛋白明显下降；LSCM扫描显示p65和p50蛋白从胞浆向胞核转移，同时p65和p50与DNA结合活性明显升高（P〈0．01）；IL-8的蛋白表达水平明显升高（P〈0．01）。细胞经AS602868的预处理，阻断了细胞内p-IxBa蛋白升高和IkBa蛋白降解；减少了p65和p50蛋白的核转移和与DNA结合活性（P〈0．01）；降低了IL-8蛋白的表达水平（P〈O．01）。结论IL-1β通过激活NF-KB介导了A549细胞分泌IL-8，结果提示可能通过抑制NF-kB信号通道的方法，减轻呼吸机相关肺损伤（VALI）的生物性损伤。     

p38丝裂原活化蛋白激酶介导抵抗素调节高糖刺激下人肾小球系膜细胞增殖的作用

目的 观察巨噬细胞因子抵抗素过度表达对高糖刺激作用下人肾小球系膜细胞p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的影响，探讨抵抗素调控肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质积聚的作用机制。 方法 通过转染携带野生型抵抗素基因的腺病毒载体 （Ad-resistin）构建过度表达抵抗素的人巨噬细胞模型，并与高糖刺激后的人肾小球系膜细胞共培养。3H-氚标胸腺嘧啶掺入法检测肾小球系膜细胞增殖。免疫细胞化学法检测系膜细胞激活蛋白1（AP-1）的表达。免疫荧光检测细胞外基质层粘连蛋白（LN）的表达。Western印迹检测系膜细胞内p38MAPK、转化生长因子(TGF)β1的表达并测定Smad2的磷酸化水平。 结果 Ad-resistin转染后，人巨噬细胞抵抗素 mRNA水平及蛋白表达均显著升高（P < 0.01）。与对照组比较，与过度表达抵抗素的人巨噬细胞共培养后，人肾小球系膜细胞p38MAPK、TGF-β1的蛋白表达显著增强；细胞内Smad2的磷酸化水平显著升高（P < 0.05）；肾小球系膜细胞出现明显的增殖（P < 0.01）；细胞外基质的合成增多（P < 0.05）。 结论 巨噬细胞因子抵抗素的过度表达可能通过p38MAPK信号通路，促进高糖刺激作用下肾小球系膜细胞的增殖及细胞外基质的异常积聚。     

慢性肾衰竭兔血清对主动脉平滑肌细胞增殖及核因子κB活化的作用

目的 研究慢性肾衰竭兔血清对其主动脉平滑肌细胞增殖和核因子κB （NF-κB）活化的影响,并探讨其作用的可能机制。 方法 建立慢性肾衰竭兔模型,采集血清。采用原代培养的兔主动脉平滑肌细胞,用不同浓度的慢性肾衰竭兔血清刺激不同时间,四甲基偶氮噻唑盐（MTT）法检测细胞增殖;Hoechst33342染色观察细胞凋亡;Western印迹检测慢性肾衰竭血清对主动脉平滑肌细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、NF-κB p65蛋白表达的影响;免疫荧光观察NF-κB p65核转位。 结果 （1）在较低浓度（≤10%）时,慢性肾衰竭兔血清对平滑肌细胞的增殖有明显的促进作用,且呈浓度、时间依赖性;但血清浓度继续增加后,对平滑肌细胞的促增殖作用却明显减弱,与正常血清组差异有统计学意义（P < 0.05）。（2）Hoechst33342染色表明,慢性肾衰竭血清在低浓度时（≤10%）细胞凋亡率和正常血清组差异无统计学意义（P > 0.05）,但高浓度（>10%）时,平滑肌细胞凋亡率增加,与正常血清组差异有统计学意义（P < 0.01）。（3）慢性肾衰竭血清刺激24 h后,低浓度促进PCNA、NF-κB p65蛋白表达,高浓度抑制PCNA、NF-κB p65表达,与正常血清组差异有统计学意义（P < 0.01）。（4）10%慢性肾衰竭血清与平滑肌细胞孵育24 h后免疫荧光显示,NF-κB p65发生了核转位。 结论 不同浓度的慢性肾衰竭兔血清可导致平滑肌细胞增殖或凋亡,其促增殖作用可能与其活化了NF-κB有关。本研究为防治慢性肾衰竭加速性动脉粥样硬化提供理论依据。     

反义单核细胞趋化蛋白1对大鼠系膜细胞增生的影响

目的研究反义单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）对系膜细胞MCP—1分泌及增生的影响。方法用逆转录病毒感染体外培养的系膜细胞，得到转染反义MCP—1的系膜细胞，经PCR及Southern印迹鉴定外源基因在系膜细胞基因组DNA上的整合。脂多糖（LPS）刺激反义MCP-1系膜细胞，以正常系膜细胞及转染空白载体的系膜细胞为对照，观察其增生情况。用RT-PCR法检测MCP-1、CC趋化因子受体2（CCR2）的mRNA表达。ELISA法检测细胞上清中MCP-1蛋白的分泌。结果经逆转录病毒转染得到的反义MCP-1的系膜细胞，其基因组DNA中有外源基因的整合。在正常的培养条件下，反义组与对照组系膜细胞的增生差异无统计学意义；MCP-1、CCR2的mRNA均有少量表达；MCP-1的蛋白也有微弱表达。在LPS的刺激下，反义组与对照组MCP-1的mRNA的表达均增高；MCP-1蛋白的分泌均增多。与对照组比较，反义组系膜细胞的增生受抑制[（16．83±1．16）×10^4／ml比（19．63±1．85）×10^4／ml]，MCP—1的mRNA的表达较少（0．424比0．866，P〈0．01），MCP—1蛋白的分泌减少。CCR2的mRNA表达与MCP-1的变化一致。结论（1）逆转录病毒载体pLXSN可有效地介导MCP-1 cDNA在系膜细胞的转染。（2）反义MCP-1可降低系膜细胞MCP—1的转录和翻译。（3）反义MCP—1的转染可降低系膜细胞在炎症状态时的增生。（4）大鼠系膜细胞具有CCR2的表达，在炎症状态时形成MCP-1、CCR2的自分泌环路。     

普伐他汀抑制羧甲赖氨酸修饰白蛋白诱导足细胞表达单核细胞趋化蛋白1

目的研究普伐他汀对羧甲基赖氨酸修饰白蛋白（CML-BSA）诱导的小鼠足细胞单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的干预作用。方法使用RT-PCR和ELISA方法检测MCP-1的表达水平及细胞上清液MCP-1含量。共聚焦显微镜测量对二氯荧光黄敏感的细胞内活性氧（ROS）的产量。Western印迹法和免疫组化技术检测活化的细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、核因子κB（NF-κB）和转录因子Sp1的表达。结果CML-BSA呈时间和浓度依赖的方式诱导MCP-1的表达。0.1或1.0 mmol/L普伐他汀可抑制CML-BSA诱导的MCP-1 mRNA和蛋白的表达。CML-BSA可迅速诱导足细胞内ROS的生成。普伐他汀不影响细胞ROS生成。CML-BSA诱导足细胞磷酸化ERK（p-ERK）表达升高,而普伐他汀可以浓度依赖方式对此加以阻断。Western印迹法和免疫组化实验结果均提示普伐他汀预处理足细胞可以阻断CML-BSA诱导的NF-κB和Sp1的易位。结论普伐他汀能够通过调节足细胞内ERK、NF-κB和Sp1信号途径,阻断CML-BSA诱导MCP-1的表达。     

p38 MAPK抑制剂对急性肺损伤大鼠肺组织核因子-кB表达的影响

目的 观察p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂预处理对大鼠内毒素型急性肺损伤(ALI)核因子-кB(NF-кB)的影响.方法 腹腔内注射+气管内给内毒素复制大鼠ALI模型,用免疫组化方法测定肺组织NF-кB的表达.结果 实验组、预处理组NF-кB的表达高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),且实验组高于预处理组(P＜0.05).结论 p38 MAPK抑制剂可减轻大鼠细胞的NF-кB表达,减轻肺组织的病理损害.     

RNA干扰下调NF-κB p65基因表达诱导胰腺癌细胞株PANC-1的凋亡

目的运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术下调胰腺癌细胞株PANC-1中NF-κB p65基因表达,并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法利用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染入胰腺癌细胞株PANC-1中。采用RT-PCR法测定细胞内NF-κB p65mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变,运用Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测p65基因表达下调对PANC-1细胞凋亡的影响。结果化学合成的人NF-κB p65 siRNA能有效地抑制PANC-1细胞中NF-κB p65mRNA的表达（P〈0．01）,同时ELISA结果显示,RelA siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组（P〈0．05）。Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测发现下调p65基因表达能够诱导PANC-1细胞的凋亡。结论体外实验初步证明了NF-κB p65基因在胰腺癌细胞凋亡调控方面扮演重要角色．通过沉默其表达可诱导胰腺癌细胞的凋亡．     

血管紧张素Ⅱ诱导Toll样受体4在腹膜间皮细胞的表达及其对脂多糖诱导CD40表达的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对原代培养大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）Toll样受体4（TLR4）表达的影响及其在脂多糖（LPS）诱导的核转录因子κB （NF-κB）活化及CD40表达中的作用。 方法 分离及培养RPMC。用不同浓度AngⅡ（10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L）刺激细胞及用10-7 mol/L AngⅡ刺激细胞不同时间（mRNA为1、2、4、8、12、24、48 h和蛋白为6、12、24、36、48 h），观察血管紧张素1型受体（AT1R）阻滞剂洛沙坦（10－5 mol/L）和血管紧张素2型受体（AT2R）阻滞剂PD123177（10-5 mol/L）对AngⅡ诱导TLR4表达的影响。将细胞随机分为下列4组：对照组、AngⅡ (10－7 mol/L)组、LPS(1 mg/L)组、AngⅡ (10－7 mol/L)+LPS(1 mg/L)组，观察AngⅡ对LPS诱导的NF-κB激活和CD40表达的影响。RT-PCR检测TLR4、CD40 mRNA表达；Western印迹检测TLR4、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白表达；免疫荧光检测细胞NF-κB p65亚单位的表达及分布。 结果 (1)10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L AngⅡ作用RPMC 12 h，TLR4 mRNA表达分别增加70.5%、89.5%、102.9%和121.9%；作用24 h TLR4蛋白表达分别增加12.1%、27.7%、51.2%和41.6%。AngⅡ（10－7 mol/L）作用RPMC不同时间，TLR4 mRNA表达高峰为8 h和12 h（P < 0.01），蛋白表达高峰为12 h和24 h（P < 0.01）。(2)洛沙坦阻断后，AngⅡ诱导的TLR4表达与未阻断组比较，下调33.5%（P < 0.05）。PD123177对AngⅡ诱导的TLR4表达无显著影响（P > 0.05）。(3) 与正常对照组比较，LPS作用60 min p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调362.6%（P < 0.01）和67.4%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调299.9%（P < 0.01）；与LPS组比较，AngⅡ预刺激24 h加LPS作用60 min，p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调49.1%（P < 0.01）和29.3%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调56.8%（P < 0.01）。(4)免疫荧光结果显示正常对照组与AngⅡ组细胞中，p65信号定位于细胞胞质；LPS作用60 min，p65信号从胞质进入胞核；AngⅡ+LPS组NF-κB p65胞核信号显著增强。 结论 AngⅡ呈浓度、时间依赖性诱导RPMC TLR4表达，并显著增强LPS诱导NF-κB激活及CD40的表达。提示腹膜组织局部产生的AngⅡ可能对LPS诱导的腹膜组织炎性反应具有放大作用。