TLR4激动上调内皮细胞氧化低密度脂蛋白受体LOX-1表达

目的近年研究表明介导先天免疫反应的受体Toll样受体4(TLR4)参与了动脉硬化的发生发展。业已证明氧化低密度脂蛋白受体LOX-1介导内皮细胞活化和功能失调，激发炎症过程，在动脉粥样硬化的发生和发展中起着极为重要作用。本研究观察TLR4激动是否调节内皮细胞LOX-1表达。方法应用脂多糖(LPS)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24h。采用RT—PCR和流式细胞术分别检测TLR4、LOX-1 mRNA和蛋白表达水平。为了观察转录因子NF—kB在调节LOX-1表达中的作用，应用NF-kB特异性抑制剂咖啡酸苯乙酯(CAPE)预处理细胞，然后以LPS刺激，检测LOX-1 mRNA和蛋白变化。结果LPS(10～1000ng／mL)上调HUVECs TLR4和LOX-1 mRNA表达，LPS(1000ng／mL)上调TLR4和LOX-1蛋白表达，CAPE(20μg／mL)可抑制LPS介导的LOX-1表达上调。结论TLR4／NF-kB信号途径可能通过上调内皮细胞LOX-1表达参与动脉粥样硬化的发生及发展。     

Toll样受体4/核因子κB和氧化低密度脂蛋白受体LOX-1对单核内皮细胞黏附的影响

目的近年研究表明介导先天免疫反应的受体Toll样受体4（TLR4）参与动脉粥样硬化的发生发展。TLR4激动后通过诱导核因子κB（NF—κB）激活,调控炎症因子的表达。研究观察TLR4／NF—κB激活对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化低密度脂蛋白受体（lectin—like oxidized lowdensity lipoprotein receptor-1,LOX-1）、细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、E-选择素（E—selectin）表达的调节,以及它们在介导单核内皮细胞黏附中的作用。方法应用脂多糖（LPS,1mg／L）刺激HUVECs 24h。采用RT—PCR方法检测TLR4、LOX-1、ICAM-1、E—selecfin mRNA表达水平;采用蛋白质印迹技术检测TLR4、LOX-1蛋白表达水平及核蛋白NF—κB p65表达的变化;采用直接计数法观察HUVECs与单核细胞的黏附率。结果LPS上调TLR4表达,激活NF—κB,上调HUVECs LOX-1、ICAM-1、E—selectin表达,增加单核细胞与内皮细胞的黏附率;抗LOX-1、ICAM-1、E—selectin抗体均部分抑制LPS介导的单核与内皮细胞黏附率的增加;NF—κB抑制剂一咖啡酸苯乙酯（CAPE）抑制了LPS介导的上述效应。结论TLR4／NF—κB激活上调LOX-1、ICAM-1、E—selectin表达,它们均在LPS介导的单核内皮细胞黏附过程中起部分作用,NF—κB在LPS介导的上述效应中起关键调节作用,干预NF—κB激活可能成为防治动脉粥样硬化的靶目标。     

PCKS9通过TLR4/NF-κB/COX-2途径调节单核-内皮细胞黏附性

目的探讨前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是否通过人脐静脉内皮细胞(HUVECs)Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/环氧合酶2(COX-2)途径调节单核-内皮细胞黏附性。方法氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理HUVECs,real-time PCR与Western blot法检测PCSK9、TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达;ox-LDL处理后,用人重组PCSK9蛋白孵育或PCSK9 siRNA转染HUVECs,检测TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达;ox-LDL处理后,用人重组PCSK9蛋白与TLR4抑制剂瑞沙托维(TAK-242)或NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)共同孵育HUVECs,检测NF-κB p65与COX-2的mRNA和蛋白表达;COX-2抑制剂(NS398)与人重组PCSK9蛋白先后处理HUVECs后,加入THP-1单核细胞检测单核-内皮细胞黏附性。结果 ox-LDL上调HUVECs的PCSK9、TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达(P均0.05);人重组PCSK9蛋白在ox-LDL基础上上调TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达(P均0.05);PCSK9 siRNA转染可抑制ox-LDL对TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达的上调作用(P均0.05);TAK-242抑制人重组PCSK9蛋白对TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达的上调作用(P均0.05);PDTC抑制人重组PCSK9蛋白对NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达的上调作用(P均0.05);NS398可抑制人重组PCSK9蛋白的促单核-内皮细胞黏附作用(P均0.05)。结论 PCSK9可通过TLR4/NF-κB/COX-2途径调节单核-内皮细胞黏附性。     

丹皮酚对高血压患者血管内皮细胞Toll样受体4、核因子-κB表达的影响

目的 观察丹皮酚对Toll样受体(TLR)、核因子(NF) -κB信号转导通路的影响,探讨其对高血压患者血管内皮细胞的保护机制.方法 10％高血压患者及健康人血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)24 h,实时荧光定量(PCR)法检测TLR4 mRNA表达.不同浓度的丹皮酚干预脂多糖(LPS)诱导的HUVEC-C TLR4表达(24 h)及NF-κB活化(2 h),PCR法测TLR4 mRNA及NF-κB mRNA的表达,免疫印迹技术测TLR4蛋白及NF-κB蛋白的表达.结果 血清作用24 h后,高血压病组TLR4 mRNA的表达较健康组增高(P＜0.01).丹皮酚可呈剂量依赖性减少LPS诱导的TLR4 mRNA高表达,抑制LPS诱导的TLR4蛋白高表达和IκBα蛋白的降解(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).结论 TLR-NF-κB信号途径介导的炎症反应和免疫紊乱是高血压病血管内皮损伤的机制之一,丹皮酚可通过抑制其表达保护血管内皮细胞损伤.     

异常血流动力对TLR4/NF-κB信号传导通路及其下游炎症因子的影响

目的研究异常血流应力或压力单独作用对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB信号传导通路及下游炎症因子:血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)等的影响,探讨异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制。方法将生长良好的HUVECs以1×105个/ml密度接种于细胞综合应力刺激实验系统(型号BIO-CCS13)中进行干预。将HUVECs按所受的应力不同分成应力组、压力组和正常组。在各组应力作用下培养一天后收集细胞备用,用q PCR方法测定TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF-6)、血凝素样氧化低密度酯蛋白受体-1(LOX-1)、核因子-κB(NF-κB)、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的基因表达,用蛋白质印迹方法测定TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的蛋白表达。结果与正常组比较,应力组和压力组TLR4、My D88、TRAF-6、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1m RNA表达水平显著升高(P0.01),TLR4、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P0.01)。结论异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制可能与激活TLR4/NF-κB信号传导通路和增强下游炎症因子:LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1等的表达有关。     

核转录因子介导不对称二甲基精氨酸上调人脐静脉LOX-1的表达

培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC,随机分为对照组和不对称二甲基精氨酸(ADMA)组,采用Western blot法测定核转录因子(NF-κB)的表达,逆转录聚合酶链反应分析血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)mRNA的表达.发现ADMA明显上调NF-κB、LOX-1 mRNA的表达,且随其浓度的升高呈剂量依赖性.吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)显著抑制ADMA诱导的NF-κB、LOX-1 mRNA的表达,而且高浓度组较低浓度组的抑制作用更明显.认为NF-κB的特异抑制剂PDTC可抑制NF-κB介导ADMA上调人脐静脉内皮细胞LOX-1的表达.     

Toll样受体4和核因子-κB信号通路在溶血磷脂酸致动脉粥样硬化中的作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路在溶血磷脂酸(LPA)致动脉粥样硬化中的作用。方法以不同浓度LPA(0¹0μmol/L)刺激人单核细胞株THP-1细胞4h,以及LPA 1μmol/L处理THP-1细胞不同时间(010μmol/L)刺激人单核细胞株THP-1细胞4h,以及LPA 1μmol/L处理THP-1细胞不同时间(0⁸h),荧光定量RT-PCR法测定TLR4mRNA表达,Western blot检测TLR4蛋白、细胞核NF-κB p65表达变化,ELISA法测定细胞因子TNF-α,随后在LPA 1μmol/L条件下,TLR4单抗干预THP-1细胞,观察其对LPA诱导的细胞核NF-κB p65表达及TNF-α分泌水平的影响。结果当LPA 1μmol/L时,TLR4mRNA和蛋白及细胞核NF-κB p65表达较0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L LPA明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。LPA 1μmol/L处理THP-1细胞4h时,THP-1细胞TLR4mRNA和蛋白及细胞核NF-κB p65表达水平明显高于0、1、2、8h(P<0.01)。与TLR4单抗干预前比较,TLR4干预后LPA诱导的THP-1细胞NF-κB p65表达及TNF-α分泌水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 LPA可显著上调THP-1细胞TLR4表达及促进NF-κB的活化,LPA致动脉粥样硬化作用可能部分是由TLR4/NF-κB信号途径介导的。     

Toll样受体4信号激动对心肌细胞血管紧张素原及血管紧张素Ⅱ 1型受体表达的影响

目的 应用Toll样受体4(TLR4)的特异性激动剂脂多糖(LPS)刺激培养的新生大鼠心肌细胞,激活TLR4介导的信号通路,观察对心肌局部的血管紧张素原和血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)表达的影响,探讨TLR4在心血管疾病中的参与机制.方法 用TLR4的激动剂LPS以10、100、1000 ng/mL的浓度作用于体外培养新生大鼠心肌细胞(NRVMs)24 h后应用RT-PCR法测定NRVMs的TLR4、血管紧张素原(AGT)及AT1R mRNA的表达情况.结果 LPS刺激下明显升高NRVMs TLR4 mRNA表达水平,并呈剂量依赖性(P<0 05).AGT和AT1R的表达也明显增高(P<0 05).结论 培养的NRVMs在LPS的作用下,在10 ng/mL的浓度下,TLR4增加自身受体TLR4表达的同时,也上调NRVMs的AGT与AT1R的表达,提示TLR4可能通过介导的心肌局部肾素血管紧张素系统(RAS)的活化加重细胞的损伤,参与心血管疾病的发生发展.     

NF-κB decoy寡核苷酸对结肠癌SW480细胞TLR4表达的影响

目的 探讨核转录子κB(NF-κB)decoy寡核苷酸(ODNs)对结肠癌SW480细胞Toll样受体4(TLR4)表达的影响. 方法 体外培养SW480细胞,LPS(10μL)刺激3 h后,用脂质体Lipofectin2000介导NF-κB decoy ODNs转染6 h,RT-PCR法检测细胞的TLR4 mRNA.设对照组、LPS组、SODN组、Lipofectin2000组. 结果 转染NF-κB decoy ODN的SW480细胞的TLR4 mRNA表达明显高于对照组(P<0.01),但明显低于其他组(P均<0.01). 结论 NF-κB decoy ODNs明显抑制SW480细胞TLR4的表达.     

LPS通过TLR4/MyD88/NF-κB途径促进人肝癌细胞增殖及转移能力

目的研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人肝癌细胞HepG2增殖、粘附、侵袭、迁移能力的影响,并阐明相关机制。方法 (1)细胞增殖及粘附能力采用MTT法检测;(2)细胞侵袭和迁移能力采用Transwell小室模型检测;(3) Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor,MyD88)及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的蛋白和mRNA表达水平分别采用Western blot和RT-PCR测定。结果 (1) LPS(浓度分别为10、100、1 000 ng/m L)刺激Hep G224、48、72 h,与对照组相比,细胞增殖能力均增高,差异有统计学意义(均P 0. 05),且呈浓度和时间依赖性。(2)经100 ng/m L的LPS干预HepG2 48 h后,干预组细胞粘附能力明显高于对照组(P 0. 01);侵袭和迁移实验中穿膜细胞数比较,干预组均显著多于对照组(P 0. 01)。(3) LPS可明显上调TLR4、MyD88及NF-κB蛋白及mRNA表达水平(P 0. 05)。结论 LPS可能通过TLR4/MyD88/NF-κB途径促进人肝癌细胞增殖及转移能力。