抑制人RAD51基因表达对人骨肉瘤细胞体内外增殖能力的影响

目的:通过抑制人RAD51修复基因(hRAD51)表达,研究hRAD51对骨肉瘤细胞和裸鼠移植瘤生长的影响.方法:构建hRAD51基因沉默的骨肉瘤细胞株HOS-shA2,利用MTT和克隆形成实验从体外观察hRAD51基因沉默对HOS细胞增殖的影响,FCM法检测抑制hRAD51基因表达后细胞周期的变化情况,裸鼠成瘤实验观察降低hRAD51表达对骨肉瘤移植瘤生长情况的影响.结果:成功构建了hRAD51基因沉默细胞株HOS-shA2;体外实验显示,HOS-shA2细胞的增殖能力较亲本及阴性对照细胞明显降低(P<0.01);FCM法检测结果显示,hRAD51基因沉默后G2/M期细胞比例增多(P<0.01);HOS-shA2细胞的裸鼠移植瘤生长速度缓慢,剥离瘤体质量明显轻于亲本HOS组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01).结论:hRAD51在骨肉瘤细胞增殖中发挥重要作用,有望成为肿瘤治疗的新靶点.     

米非司酮对子宫内膜癌裸鼠移植瘤细胞凋亡调控的研究

目的探讨抗孕激素米非司酮对人子宫内膜癌HHUA细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的调控作用。方法体外培养人子宫内膜癌HHUA细胞,裸鼠皮下接种HHUA细胞建立裸鼠移植瘤动物模型,随机分为2组,分别应用米非司酮、精制花生油治疗4周,应用流式细胞术(FCM)检测各组裸鼠移植瘤细胞周期时相和凋亡率;免疫组化技术检测凋亡基因bcl2、Fas和FasL蛋白的表达情况。结果米非司酮治疗组裸鼠移植瘤细胞G0/G1期比例升高,S期细胞比例(SPF)降低(P<0.05),移植瘤细胞凋亡率为15.03%±2.19%,明显高于对照组(3.06%±1.13%)(P<0.01);移植瘤细胞bcl2蛋白表达水平明显下降,而Fas蛋白表达水平升高,与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05)。结论抗孕激素米非司酮通过调节移植瘤细胞周期分布和凋亡基因,抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

RNA干扰沉默mdm2治疗骨肉瘤的实验研究

目的 观察靶向mdm2的小干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤生长的影响.方法 构建PGCsilencerTM-mdm2 siRNA,转染至骨肉瘤细胞U2OS.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测siRNA对mdm2的沉默效果,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测诱导细胞凋亡的情况.通过裸鼠移植瘤模型观察siRNA对骨肉瘤体内治疗效果.结果 成功构建simdm2质粒.在转染simdm2的U20S细胞中,simdm2-1组和simdm2-2组的mdm2 mRNA表达量分别下降至空白对照组的35.6%和42.1%(P<0.05),mdm2蛋白表达分别降低至空白对照组的34.0%和47.2%(P<0.05),而且增殖能力显著降低,发生明显凋亡,simdm2-1组和simdm2-2组的细胞凋亡率分别为29.9%和20.9%.阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义.裸鼠移植瘤实验结果显示,simdm2转染组的肿瘤受到抑制,而且mdm2基因和蛋白表达明显下调.结论 simdm2能有效的抑制骨肉瘤生长,并抑制mdm2基因和蛋白的表达.     

转录因子Sp1 siRNA表达质粒的构建及对Huh-7肝癌细胞增殖的作用

目的:通过转录因子Sp1的siRNA表达质粒作用于Huh-7肝癌细胞动物模型,探讨Sp1在肝癌细胞增殖方面的作用.方法:构建靶向抑制Sp1基因的siRNA表达质粒,转染表达有绿色荧光蛋白的肝癌Huh-7细胞,筛选稳定表达的siRNA转染克隆;Western印迹法检测Sp1的表达变化,CCK8法和裸鼠皮下成瘤实验分别检测转染后Huh-7细胞在体内及体外的增殖情况.结果:Sp1-siRNA表达质粒特异性抑制Huh-7细胞Sp1的表达,筛选后得到稳定的Sp1-siRNA细胞克隆,其细胞增殖能力明显降低(P<0.05).裸鼠皮下成瘤实验显示,质粒转染细胞接种21 d时Sp1-siRNA细胞种植瘤平均体积为(82.40±8.61)mm3,明显小于对照组的(160.00±20.27)mm3.结论:Sp1对Huh-7肝癌细胞具有重要的调控作用,siRNA抑制Sp1表达后可在体内外抑制Huh-7肝癌细胞增殖.     

siRNA介导的间皮素基因沉默对卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长的影响

目的:研究间皮素(mesothelin, MSLN)基因被沉默后的卵巢癌细胞SKOV3-MSLN-shRNA增殖能力的变化,以及MSLN基因沉默对裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤生长的影响.方法:利用针对MSLN基因的siRNA慢病毒液和对照组慢病毒液分别感染SKOV3细胞,建立SKOV3-MSLN-shRNA细胞和SKOV3-MSLN-neg细胞的稳定转染株;以SKOV3细胞作空白对照,用平板克隆形成法和细胞计数法检测3组细胞的增殖能力.应用3组细胞分别建立裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型,2周后处死裸鼠,观察每组动物的成瘤率及每只裸鼠的肿瘤质量、肿瘤数目和肿瘤种植部位等.结果:SKOV3-MSLN-shRNA细胞的体外增殖能力明显低于SKOV3-MSLN-neg细胞和SKOV3细胞,差异有统计学意义(P<0.05).SKOV3-MSLN-shRNA组裸鼠成瘤率为60%,而2个对照组SKOV3-MSLN-neg和SKOV3细胞的裸鼠成瘤率均为100%,差异无统计学意义(P＞0.05).SKOV3-MSLN-shRNA组动物的肿瘤数目、肿瘤质量及肿瘤种植部位明显低于2个对照组 (P<0.05).结论:MSLN基因沉默可以降低卵巢癌SKOV3细胞的体外增殖能力,同时可以抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生长和种植.     

内皮抑素基因对裸鼠移植骨肉瘤的抑制作用

目的：探讨内皮抑素（endostatin,ES）基因对裸鼠骨肉瘤细胞UMR106移植瘤的抑制作用。方法：携带ES基因重组质粒体外扩增后,应用脂质体法转染骨肉瘤细胞UMR106,Zeocin抗性筛选得到ES-UMR106细胞。MTT法观察ES基因对肿瘤细胞增殖的影响,ELISA法检测转染后肿瘤细胞的ES分泌情况。MTT法观察ES基因对血管内皮细胞增殖能力的影响。应用ES-UMR106和UMR106细胞制作裸鼠皮下移植瘤模型,观察两组动物移植瘤生长情况、瘤组织的病理变化及肺转移的情况。结果：ES基因转染不影响UMR106细胞的增殖能力;ES-UMR106细胞可表达有生物活性的ES,转染后48hES在培养液中超过350ng/ml。ES-UMR106细胞分泌的ES可明显抑制血管内皮细胞增殖。与UMR106细胞相比,ES-UMR106细胞在裸鼠接种的移植瘤生长速度缓慢、包膜完整,病理组织学显示瘤体内血管稀少,肿瘤细胞广泛坏死;UMR106细胞移植瘤裸鼠肺组织出现转移灶（2/8）,ES-UMR106细胞移植瘤裸鼠无肺转移灶。结论：携带ES基因重组质粒转染骨肉瘤UMR106细胞后可抑制该骨肉瘤细胞移植瘤的生长和转移。     

annexin Ⅰ对胰腺癌细胞生物学行为影响的体内研究

目的 探讨annexin Ⅰ在胰腺癌发生过程中的作用.方法 应用RNA干扰技术,敲低annexin Ⅰ基因在mRNA水平的表达,并经Western blot检测证实.分别接种人胰腺癌Suit-Ⅱ细胞及转染annexin Ⅰ-siRNA2、annexin Ⅰ-siRNA3、annexin Ⅰ-siRNAN的Suit-Ⅱ细胞,建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型,观察胰腺癌细胞的成瘤能力、肿瘤生长速度的变化,测定肿瘤体积和瘤重.结果 (1)Westernblot检测结果显示,转染pSilencer-annexin Ⅰ-siRNA1的Suit-Ⅱ细胞annexin Ⅰ表达显著降低,转染pSilencer-annexin Ⅰ-siRNA2和pSilencer-annexin Ⅰ-siRNA3的Suit-Ⅱ细胞annexin Ⅰ的表达几乎被完全抑制.(2)接种转染annexin Ⅰ-siRNA2、annexin Ⅰ-siRNA3细胞组的肿瘤生长速度较接种亲本Suit-Ⅱ细胞组明显减慢,肿瘤生长被抑制,抑制率分别达76.6%和68.4%.接种肿瘤细胞后44 d,接种转染annexin Ⅰ-siRNA2细胞组、接种转染annexin Ⅰ-siRNA3细胞组的瘤重分别为0.8987和0.8992 g,显著低于接种亲本Suit-Ⅱ细胞组和接种转染annexin Ⅰ-siRNAN细胞组(分别为2.5866和2.4070 g,P<0.001).结论 annexin Ⅰ基因在胰腺癌发生过程中起到了促进胰腺癌细胞生长增殖、增强胰腺癌细胞成瘤能力的重要作用,可作为基因治疗的潜在靶点.     

Survivin基因沉默抑制结肠癌生长的动物实验研究

目的 探究survivin基因沉默对人结肠癌Lovo细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 构建靶向survivin的shRNA载体SUR和阴性对照质粒Neg,并将其转染人结肠癌Lovo细胞,分别种植到裸鼠皮下建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型.随后观察各组裸鼠移植瘤生长情况,免疫组化方法检测移植瘤survivin蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果 移植转染细胞8周,与空白对照组比较,SUR组移植瘤的体积和质量均有显著缩小(P<0.05),体积和质量抑瘤率分别为48.9%和51.2%.与空白对照组比较,SUR组移植瘤survivin表达显著下调,表达指数为31.9%;SUR组肿瘤细胞凋亡显著增加,凋亡指数18.47%(P<0.05).阴性对照Neg组的上述指标与空白对照组比较,差异均无统计学意义.结论 Survivin基因沉默能够抑制人结肠癌Lovo细胞裸鼠移植瘤的生长.     

RNA干扰沉默 PIN1 对肺癌A549细胞增殖、细胞周期和成瘤的影响

目的： 应用RNA干扰技术沉默肺癌A549细胞中 PIN1 （protein interacting with N1MA1）基因的表达,探讨其对A549细胞增殖、细胞周期和裸鼠成瘤能力的影响。 方法: 构建靶向 PIN1 基因的shRNA真核表达质粒pGPU6-GFP-Neo-PIN1和无义对照质粒pGPU6-GFP-Neo,以脂质体法转染A549细胞,G418筛选稳定沉默 PIN1 基因的细胞株。Real-time PCR和Western blotting验证 PIN1 基因在mRNA和蛋白水平的表达,MTT法和流式细胞术检测A549细胞增殖和细胞周期分布。将稳定沉默 PIN1 的A549细胞与对照细胞皮下接种裸鼠,观察接种后肿瘤生长情况。 结果: 成功构建了pGPU6-GFP-Neo-PIN1载体,转染A549细胞并筛选获得稳定克隆。稳定转染pGPU6-GFP-Neo-PIN1的A549细胞中 PIN1 mRNA表达量较pGPU6-GFP-Neo转染组下降了893%;蛋白表达同时也显著抑制。 PIN1 基因沉默组的A549细胞增殖速率明显下降（P<0.01）,细胞出现G1期阻滞。小鼠体内实验显示, PIN1 沉默的A549细胞在裸鼠体内成瘤能力降低（P<0.01)。结论: pGPU6-GFP-Neo-PIN1质粒稳定转染肺癌A549细胞能有效沉默 PIN1 基因的表达,从而抑制A549细胞的增殖、影响细胞周期和抑制成瘤能力。     

小干扰RNA沉默CXCR4和CXCR7对人子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨针对趋化因子受体基因CXCR4和CXCR7的小干扰RNA(siRNA)对人子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法:将子宫内膜癌Ishikawa细胞株注射于裸鼠肩胛背部皮下建立动物模型,待肿瘤最长径达5～7mm后,将所有荷瘤裸鼠随机分组,分别给予CXCR4-siRNA和CXCR7-siRNA单独或联合瘤体内注射,并以阴性对照siRNA和生理盐水作为对照组,每3d治疗一次,共6个治疗周期.观察各组裸鼠移植瘤的生长,比较各组移植瘤的体积和质量的差异,并以实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和免疫组化技术验证CXCR4和CXCR7的基因沉默效果.结果:成功建立Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型,与阴性对照siRNA组和空白对照组相比,CXCR4siRNA治疗组、CXCR-siRNA治疗组和CXCR4-siRNA+ CXCR7-siRNA治疗组的肿瘤的生长均明显受到抑制(均P＜0.05);CXCR4-siRNA和/或CXCR7-siRNA瘤体内直接注射能显著下调CXCR4、CXCR7 mRNA(均P＜0.05)和蛋白(均P＜0.01)的表达.结论:siRNA干扰CXCR4和CXCR7表达能够有效抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠移植瘤的生长.     

KISS1 expression in osteosarcoma: high in chinese clinical cases, but lower in cell lines

Purpose: Osteosarcoma is the most common primary bone malignancy with a notorious feature of high metastasis. KISS1 has been identified as a putative human metastasis suppressor gene in numerous types of cancer. This study was aimed to evaluate the relationship between expression of KISS1 and invasion ability in osteosarcoma cell lines, and the relationships between KISS1 expression levels and prognosis of clincial cases. Methods: Expression levels of KISS1 in 3 types of osteosarcoma cell lines (MG-63, Saos-2 and U-2 OS) and a normal osteoblast cell line (hF-OB 1.19) were examined using semi-quantitative RT-PCR and immunochemistry staining. Transwell assays were used to detect the cell invasion ability. The osteosarcoma cell lines and specimen sections of osteosarcoma together with control were immuno-stained with KISS1 antibody. The relationship between the clinical data and the expression of KISS1 was evaluated. Results: KISS1 mRNA expression was moderate in U-2 OS, weak in Saos-2 and lost in MG-63. Transwell assays displayed a gradually increased aggressive phenomenon in osteosarcoma cell lines U-2 OS, Saos-2 and MG-63. However, a contrary conclusion was obtained with clinical specimen, a higher positive rate of KISS1 expression being displayed in osteosarcoma patients, especially in metastastic cases, compared to the benign osteochondroma patients. Furthermore, significant earlier distant metastasis was observed in KISS1 positive than negative cases. Conclusion: KISS1 expression levels were found to be decreased with the increasing aggressive ability in osteosarcoma cell lines. However, expression of KISS1 positively correlated with metastasis in osteosarcoma patients.     

HIF-1α抑制剂YC-1对人骨肉瘤细胞Saos2和U2-OS增殖和凋亡的影响

目的:应用缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）抑制剂YC-1处理人骨肉瘤细胞Saos2和U2-OS，观察不同药物浓度对人骨肉瘤细胞系Saos2和U2-OS细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响及其机制。方法:人骨肉瘤细胞系Saos2和U2-OS分对照组和实验组。对照组细胞1%氧气浓度低氧培养，实验组细胞施加HIF-1α抑制剂YC-1干预，设浓度梯度。CCK-8法检测不同药物浓度对Saos2和U2-OS细胞活力及增殖的影响；流式细胞术检测YC-1对Saos2和U2-OS细胞周期和凋亡的影响；Western blot对FXR1、G3BP1、APAF1、Cleaved Caspase-3蛋白的表达进行相对定量分析。结果:CCK-8检测结果显示，YC-1对人骨肉瘤Saos2和U2-OS细胞有显著的增殖抑制作用，且呈明显的剂量依赖效应。不同浓度的YC-1处理细胞后，均可使各处理组G1期细胞增多，S期细胞减少，且呈剂量依赖效应(P＜0.05)。不同浓度的YC-1处理细胞后，与对照组相比，各实验组FXR1、G3BP1、APAF1蛋白表达显著下降(P＜0.05)，而Cleaved Caspase-3蛋白表达显著增高(P＜0.05)。结论:YC-1可以将人骨肉瘤细胞株Saos2和U2-OS细胞阻滞于G1期，影响细胞周期进程，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。HIF-1α对人骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响可能是通过上调FXR1、G3BP1、APAF1的表达而实现，而YC-1抑制了HIF-1α的表达从而使Cleaved Caspase-3的表达增高诱导细胞凋亡。HIF-1α及FXR1、G3BP1、APAF1、Cleaved Caspase-3有望成为骨肉瘤治疗的新靶标。     

Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达及意义

stathmin作为细胞信号转导分子在细胞分化及恶性肿瘤发生、发展上发挥重要作用。本研究旨在探讨Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达,并探讨阻断其表达对该肿瘤细胞的生物学行为的影响。方法：RT-PCR及原位杂交法检测2个人成骨肉瘤细胞系及45例人成骨肉瘤组织中Stathmin基因表达情况;以高表达Stathmin基因的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607为靶细胞、反义Stathmin(ASODN)为阻断剂,通过MTT实验观察ASODN对该细胞系的生长抑制作用,并用流式细胞仪分析其对细胞增殖周期的影响。     

LncRNA DARS-AS1靶向miR-758-3p促进骨肉瘤细胞增殖并抑制凋亡

目的:探讨LncRNA DARS-AS1对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响及其可能作用机制。方法:qRT-PCR法检测骨肉瘤组织、瘤旁组织、人成骨细胞hFOB 1.19、人骨肉瘤细胞Saos2、U2OS、HOS中LncRNA DARS-AS1、miR-758-3p的表达量;对Saos2细胞进行转染,根据不同转染物分为si-NC组、si-LncRNA DARS-AS1组、miR-NC组、miR-758-3p组、si-LncRNA DARS-AS1+anti-miR-NC组、si-LncRNA DARS-AS1+anti-miR-758-3p组;MTT法、流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;双荧光素酶报告实验检测LncRNA DARS-AS1与miR-758-3p的靶向调控关系。结果:与瘤旁组织比较,骨肉瘤组织中LncRNA DARS-AS1的表达量升高(P<0.05),miR-758-3p的表达量降低(P<0.05);与hFOB 1.19细胞比较,Saos2、U2OS、HOS细胞中LncRNA DARS-AS1的表达量升高(P<0.05),miR-758-3p的表达量降低(P&...     

Med19基因敲减增加乳腺癌细胞化疗敏感性及其可能的机制

目的:研究中介体(mediator,Med) 19对乳腺癌化疗敏感性的影响并分析其分子机制.方法:选用多柔比星(adriamycin,ADM)耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADM和亲本细胞MCF-7(NC组),采用慢病毒载体介导RNA干扰方法构建Med9稳定低表达的MCF-7/ADM与MCF-7细胞株(KD组),并用Real-time PCR和Western blotting方法验证干扰效果.CCK-8法检测慢病毒介导的Med19敲减前后两种细胞对ADM、顺铂(cisplatin,DDP)和紫杉醇(taxinol,TAX)药物敏感性的变化.Real-time PCR和Western blotting检测Med19敲减对多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)和细胞凋亡基因Bcl2、Bax及Caspase-3、active Caspase-3的表达的影响.流式细胞术检测敲减Med19及ADM处理对细胞凋亡的影响.结果:与MCF-7相比,MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP和TAX均具有耐药性.成功构建Med19稳定低表达的MCF-7/ADM与MCF-7细胞株,并且其对ADM、DDP、TAX的敏感性增加,药物作用IC50显著降低(均P＜0.05).MCF-7/ADM细胞Med19 mRNA和蛋白表达显著高于MCF-7细胞,Med19的敲减可降低MCF-7/ADM细胞中MDR1 mRNA与蛋白表达水平(均P＜0.05)并可增加MCF-7/ADM及MCF-7细胞中凋亡相关active Caspase-3、Bax的蛋白表达,降低Bc12的蛋白表达(均P＜0.05).此外,与NC及NC+ ADM组相比,KD组及KD+ ADM组凋亡水平显著增加(均P＜0.05).结论:Med19高表达参与乳腺癌化疗耐药,其机制可能与Med19调节MDR1的表达并影响细胞凋亡有关.     

Loss of ErbB2 expression in pulmonary metastatic lesions in osteosarcoma.

OBJECTIVES: The c-erbB2 protooncogene is located on human chromosome 17 and encodes a 185-kilodalton transmembrane glycoprotein (ErbB2). Elevated ErbB2 expression or gene amplification has been shown to be associated with a poor prognosis in many cancers. Recently, it has been demonstrated that overexpression of the ErbB2 protein in osteosarcoma is associated with the presence of pulmonary metastasis and decreased survival. To further investigate the role of ErbB2 overexpression in pulmonary metastasis of osteosarcoma, its expression in the primary and metastatic lesions of the same osteosarcoma patients was compared. METHODS: We compared the expression levels of ErbB2 receptor protein between the biopsy samples and pulmonary metastatic lesions in each of 19 patients with osteosarcoma who had not presented with metastasis at diagnosis. All archival materials from patients were retrieved and stained with monoclonal antibody CB11 to detect ErbB2 protein. RESULTS: The rate of overexpression was significantly lower in the pulmonary metastatic tumors than in the biopsy samples (11 versus 42%; p = 0.03). Among 8 patients who had shown increased levels of ErbB2 in the biopsy samples, 7 exhibited complete absence of ErbB2 in the pulmonary metastatic lesions. Overall loss of ErbB2 expression was noted in 14 of 19 patients as the initial tumor became metastatic. CONCLUSIONS: It is suggested that overexpression of ErbB2 decreases within individual osteosarcomas as they become metastatic. Overexpression of ErbB2 may not play an important role in the development of pulmonary metastases of osteosarcoma. Further data are needed before ErbB2 can be used in making clinical decisions for osteosarcoma patients.     

ELL2在人成骨肉瘤中的表达及对MG-63细胞增殖的影响

目的:研究ELL2在人成骨肉瘤中的表达情况以及其对人成骨肉瘤细胞增殖的影响.方法:运用RT-PCR检测ELL2在人成骨肉瘤组织及其正常毗邻组织中的表达,RT-PCR及Western-blot检测ELL2在人成骨肉瘤细胞系及人正常成骨细胞系中的表达.构建ELL2过表达载体,MTT和细胞计数试验检测过表达ELL2对人成骨肉瘤细胞系MG-63增殖的影响.结果:ELL2在人成骨肉瘤组织中的表达显著低于其正常毗邻组织(P=0.001).ELL2在人成骨肉瘤细胞系中的表达相比于人正常成骨细胞系明显下调(P<0.05).过表达ELL2能够显著抑制MG-63细胞的增殖(P<0.05).结论:ELL2在人成骨肉瘤中表达下调,其过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖.