Med19基因在恶性肿瘤中的研究进展

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病,随着人们生活方式、生活环境的改变,恶性肿瘤的发病率越来越高,死亡率一直居于首位。肿瘤的发生、发展主要与癌基因的突变、扩增、过度表达以及抑癌基因的突变、失活等密切相关。在人体内Med19基因已经定义为肿瘤相关基因,目前已发现Med19与多种恶性肿瘤的增殖、转移及周期调控有关。现就Med19基因在恶性肿瘤中的研究进展作如下综述。     

沉默 Med19 的表达对结肠癌Caco-2细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨RNA干扰 Med19 的表达对结肠癌Caco-2细胞增殖和凋亡的影响。 方法: 构建靶向 Med19 的干扰质粒pSilencer-Med19-siRNA,转染Caco-2细胞后,RT-PCR检测Caco-2细胞中 Med19 mRNA的表达,Western blotting检测Caco-2细胞中Med19蛋白的表达,MTT检测pSilencer-Med19-siRNA转染后Caco-2细胞的增殖,流式细胞术分析Caco-2细胞的凋亡。 结果: RT-PCR及Western blotting检测结果显示,pSilencer-Med19-siRNA转染后Caco-2细胞中 Med19 mRNA及蛋白表达水平上均显著下降（P<0.01）;MTT及流式细胞术检测结果表明,与pSilencer对照组相比,pSilencer-Med19-siRNA组Caco-2细胞的增殖明显受到抑制\[7 d时：（0.86±0.09）% vs（1.38±1.10）%,P<0.01\],且细胞凋亡比例明显升高\[（22.72±2.85）% vs（7.23±1.29）%,P<0.01\]。 结论: RNA干扰沉默 Med19 的表达可抑制结肠癌Caco-2细胞的增殖,促进其凋亡,提示 Med19 可作为结肠癌治疗的潜在靶点。     

成纤维生长因子19稳定敲减对大肠癌细胞增殖、迁移的影响

目的:构建慢病毒稳定敲减FGF19大肠癌细胞系,探究FGF19敲减对人大肠癌细胞增殖、迁移的影响。方法:通过慢病毒转染大肠癌COLO201和HCT116细胞,分别在适宜病毒转染指数条件下转染并构建稳转株;以嘌呤霉素进行筛选,获得稳定敲减FGF19的细胞株;PCR和Western bloting鉴定COLO201和HCT116稳转细胞株中FGF19的表达情况;Transwell实验检测细胞的迁移活性,CCK-8和克隆形成实验检测细胞的增殖活性。结果:成功构建了稳定敲减FGF19的两株大肠癌细胞。稳定敲减FGF19的HCT116、COLO201细胞(KD组)的FGF19 mRNA水平与空载对照组(NC组)相比明显减少(P=0.001 1,P=0.000 1);与NC组相比,KD组细胞的FGF19蛋白表达明显下降,差异均具有统计学意义(P=0.001,P=0.000 1)。KD组细胞的迁移活性以及增殖能力均相比NC组明显下降(迁移P=0.001 7/P=0.000 1; CCK-8 P=0.042 5/P=0.033 4;克隆P=0.005 1/P=0.002 2)。结论:成功构建FGF19...     

肺癌组织Med19和Ki-67蛋白表达临床意义的研究

目的:探讨肺癌组织中Med19蛋白表达的临床意义及其与Ki-67表达的关系.方法:应用免疫组织化学技术检测56例肺癌患者肺组织Med19和Ki-67蛋白的表达.结果:癌旁组织Med19蛋白表达的阳性表达率为1.8％(1/56).癌组织Med19蛋白表达强度明显增加,以细胞核着色为主,阳性表达率为80.4％(45/56).癌组织Med19阳性率显著高于癌旁组织,提示Med19蛋白表达与肺癌发生有关,P＜0.05.Med19蛋白表达与肺癌患者临床分期和淋巴结转移有关,P＜0.05;但与年龄、性别、病理类型和组织分级无关,P＞0.05.统计分析结果显示,癌组织Med19蛋白与Ki-67表达正相关,P=0.008.结论:Med19与Ki-67表达呈正相关.Med19与肺癌发生、发展和增殖有关,可能作为潜在癌基因在肺癌进展中起一定作用,有望成为一个新的肿瘤治疗靶点.     

H19在骨肉瘤中的表达及其与预后的关系

目的：本实验旨在研究骨肉瘤组织中 H19基因的特异性表达模式,探讨其在骨肉瘤发生发展、浸润转移中的作用及其与预后的关系。方法收集并筛选出2009年至2010年就诊的骨肉瘤患者手术切除标本30例,采集临床指标包括患者性别、年龄、发病部位、大小、Enneking分期、组织病理学分型、有无肺转移及术后随访患者生存情况。应用PCR、RT-PCR及限制性内切酶（ AluI ）酶切等方法,检测30例骨肉瘤组织中H19基因的印迹状态,分析H19基因印迹丢失及其与骨肉瘤各临床病理因素参数之间的关系。结果（1） H19基因印迹丢失率在骨肉瘤组织中为41.67%,瘤近旁组织中为16.67%,瘤远旁组织中为8.33%。Kappa相关分析结果表明,上述不同组织中 H19基因印迹丢失的发生频率间存在显著相关性（ P＜0.05）。（2）单因素方差分析结果表明,H19基因的印迹丢失与骨肉瘤患者 Ennecking 分期、肺转移灶的存在与否有关（ P＜0.05）,而与患者的性别、年龄、部位、大小和病理分型无关（ P＞0.05）。（3） Log-rank单因素生存分析表明, H19基因印迹丢失、肿瘤分期、病理学分类及转移灶的存在与否和骨肉瘤患者预后相关（ P＜0.05）,而性别、年龄、发病部位与患者预后无关（ P＞0.05）。H19基因印迹丢失骨肉瘤患者的生存率明显降低,其差异具有统计学意义（ P＜0.05）。结论骨肉瘤组织中H19基因印迹状态的改变,对骨肉瘤的发生发展、浸润转移起重要作用并与患者的不良预后相关,可能成为预测患者预后情况的新靶点。     

miR-19a和miR-19b在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的：探讨miR-19a和miR-19b在骨肉瘤组织及配对瘤旁组织中的表达及其与临床病理特征的相关性。方法：收集32对骨肉瘤和配对的瘤旁组织,运用实时荧光定量PCR（qPCR）检测骨肉瘤组织及其瘤旁组织中miR-19a和miR-19b的表达,分析其与骨肉瘤临床病理特征的相关性及其临床意义。结果：qPCR结果显示骨肉瘤组织中miR-19a和miR-19b的平均表达量较瘤旁组织中均明显上调（P均 < 0.05）。二者的表达水平呈正相关（r=0.685,P=0.000）。miR-19a和miR-19b的表达与骨肉瘤病理分级之间存在正相关（r=0.478,P=0.027）;miR-19a的表达与临床分期呈正相关（r=0.365,P=0.031）且与预后相关。Cox回归多因素分析发现miR-19a可作为骨肉瘤患者预后的影响因子（P=0.037）。结论：miR-19a和miR-19b在骨肉瘤中表达上调,在骨肉瘤的发生发展中可能发挥重要的作用,其中miR-19a可能作为骨肉瘤独立的预后标志物。     

GRIM-19表达对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:通过体内和体外实验探讨GRIM-19表达对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法:采用脂质体转染法将GRIM-19重组质粒转染HeLa细胞,建立稳定表达GRIM-19的细胞株;采用RT-PCR和Western印迹法检测HeLa细胞转染GRIM19重组质粒前后GRIM-19 mRNA和蛋白水平的表达情况;应用MTT法检测各组细胞增殖水平,并将HeLa/con、HeLa/GRIM-19细胞接种到裸鼠皮下以检测荷瘤情况;同时对移植瘤检测其GRIM-19 mRNA及其下游STAT3 mRNA的表达水平.结果:建立稳定表达GRIM-19基因的HeLa/GRIM-19细胞株.RT-PCR结果显示GRIM-19基因在HeLa/GRIM-19细胞中mRHA表达明显增加,Western 印迹法检测同样发现GRIM-19蛋白的表达显著升高,而STAT3的表达明显受到抑制.MTT检测结果显示HeLa/ GRIM-19细胞增殖较HeLa/con明显减慢(P<0.05),其接种后肿瘤生长速度亦明显减慢(P<0.01).移植瘤的RT-PCR结果表明GRIM-19表达升高、STAT3表达降低.结论:GRIM-19的表达可以抑制子宫颈癌细胞的增殖,可能作为子宫颈癌治疗的一个新靶点.     

ELL2在人成骨肉瘤中的表达及对MG-63细胞增殖的影响

目的:研究ELL2在人成骨肉瘤中的表达情况以及其对人成骨肉瘤细胞增殖的影响.方法:运用RT-PCR检测ELL2在人成骨肉瘤组织及其正常毗邻组织中的表达,RT-PCR及Western-blot检测ELL2在人成骨肉瘤细胞系及人正常成骨细胞系中的表达.构建ELL2过表达载体,MTT和细胞计数试验检测过表达ELL2对人成骨肉瘤细胞系MG-63增殖的影响.结果:ELL2在人成骨肉瘤组织中的表达显著低于其正常毗邻组织(P=0.001).ELL2在人成骨肉瘤细胞系中的表达相比于人正常成骨细胞系明显下调(P<0.05).过表达ELL2能够显著抑制MG-63细胞的增殖(P<0.05).结论:ELL2在人成骨肉瘤中表达下调,其过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖.     

慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及机制

目的：研究慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及其机制。方法：构建4种靶向TPX2基因的慢病毒表达载体（LV-TPX2-shRNA-1/2/3/4）,同时构建阴性对照质粒,将5种质粒分别转染到293T细胞中制备慢病毒。慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。选择沉默效果最佳的重组慢病毒进行后续功能实验。分别采用CCK-8法、Transwell迁移实验及流式细胞术检测各组细胞的增殖、迁移及细胞周期分布情况。Western blot检测TPX2-shRNA转染前后Ki-67、cyclin B2、Aurora-A及P53的表达。结果：与对照组比较,构建的靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体均可持续稳定的抑制HeLa细胞TPX2基因的表达,尤其以LV-TPX2-shRNA-1最为明显（P < 0.01）,故选择LV-TPX2-shRNA-1进行后续实验。与对照组比较,沉默TPX2基因的表达能降低HeLa细胞增殖及迁移能力（P < 0.05）,使G2及S期细胞比例明显增加（P < 0.05）,且上调P53蛋白的表达水平,下调Ki-67、cyclin B2及Aurora-A蛋白的表达水平（P均 < 0.05）。结论：沉默TPX2基因蛋白表达能抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移能力,可能与其改变细胞周期分布及下调Ki-67、cyclin B2、Aurora-A蛋白表达水平,上调P53蛋白表达水平有关。     

二烯丙基二硫对裸鼠体内人结肠癌细胞增殖的影响

背景与目的:二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)在体外可抑制多种肿瘤细胞增殖,但在体内抗肿瘤作用的研究报道较少.本实验旨在研究DADS对裸鼠体内人结肠癌SW480细胞增殖的影响.方法:建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型,实验动物分为DADS组及对照组.观察DADS作用后移植瘤体积和重量的变化,通过光镜和电镜观察移植瘤细胞形态学变化,通过免疫组织化学和形态定量图像分析系统检测瘤组织内增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达变化,用流式细胞术检测移植瘤细胞周期分布.结果:DADS在体内能明显抑制移植瘤的生长,相对肿瘤增殖率为49.85%;组织学分析显示DADS组瘤细胞异型性降低,核质比下降,胞浆内细胞器丰富,部分胞核呈退行性变,可见凋亡小体;免疫组化示两组移植瘤组织PCNA蛋白均有阳性表达,DADS组(149.02±4.26)与对照组(178.86±7.69)比较,裸鼠移植瘤组织内PCNA蛋白表达明显减弱(P＜0.05);流式细胞术分析显示,对照组移植瘤细胞中G2/M期细胞为18.8%,与对照组比较,DADS组G2/M期细胞(38.6%)显著增多.结论:DADS可体内抑制人结肠癌SW480细胞增殖,使癌细胞阻滞于G2/M期.     

慢病毒介导RNF2基因表达对食管癌细胞X线照射后增殖与迁移等影响

目的 利用RNA干扰技术抑制人食管癌细胞中RNF₂基因表达,观察其X线照射对细胞增殖活性、迁移能力、凋亡和细胞周期的影响。 方法 培养人食管癌细胞ECA-109,RT-PCR检测RNF₂ mRNA水平表达;MTT法检测ECA-109食管癌细胞细胞增殖;蛋白印迹法检测ECA-109-R细胞中RNF₂蛋白表达变化;流式细胞技术检测照射后不同时间细胞周期和凋亡变化。Transwell侵袭小室模型检测转染对食管癌细胞迁移能力的影响。重复测量设计资料方差分析。 结果 照射组食管癌细胞中RNF₂ 在mRNA水平和蛋白表达水平均较未照射组明显增加(P<0.01),且存在剂量-效应关系;MTT结果显示食管癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低(P<0.01);ECA-109-R组细胞中BMI₁、RNF₂蛋白表达水平较ECA-109组和ECA-109-N组细胞明显降低(P<0.01),ECA-109组与ECA-109-N组比较差异无统计学意义(P>0.05);Transwell侵袭小室模型检测结果显示照射后3.5 h ECA-109-R组穿膜细胞数明显低于ECA-109组和ECA-109-N组(P<0.01)。6 Gy照射后各实验组处于G₂+M期比例明显高于相应未照射组(P<0.01),且ECA-109-R组处于G₂+M期的比例均明显低于照射后的ECA-109组和ECA-109-N组(P<0.05)。照射后ECA-109-R组细胞凋亡率明显高于ECA-109组和ECA-109-N组(P<0.01)。 结论 采用RNA干扰技术降低食管癌细胞中RNF₂的表达,降低细胞增殖和迁移能力,解除照射后G₂+M期阻滞,促进细胞凋亡,增加放射敏感性。     

WT1基因异构体比例转变对白血病细胞株NB4增殖的影响

背景与目的:WT1基因编码一个锌指转录因子,在白血病细胞中高表达并与预后呈负相关。WT1基因mRNA通过2个可变性的剪切位点产生4种不同的拼接异构体,4种异构体在表达WT1的不同组织中各以其相对稳定的比例表达,白血病细胞中WT1不同异构体表达的意义尚不清楚。本研究拟用WT1基因异构体WTA转导急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4,以探讨WT1基因异构体对NB4细胞增殖的影响及其分子机制。方法:用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验及细胞周期动力学检测,了解WT1基因异构体表达比例改变对NB4细胞生长的影响。用半定量RT-PCR检测NB4细胞中p53、p21、CyclinE、CyclinD1、CyclinA1基因表达的改变。结果:WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染NB4细胞,外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达,并通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线,提示转染WT1基因异构体的细胞NB4/WTA生长明显慢于对照组NB4/CMV细胞及未转染的NB4细胞,NB4/WTA细胞生长曲线平缓,在第3天达平台期(78.7±18.0)×104/ml,对照组NB4/CMV细胞及NB4细胞在第4天出现生长平台期达(146.0±21.0)×104/ml。MTT法检测细胞增殖活性,结果显示,NB4/WTA细胞在各个时间段的抑制率均高于对照组,P<0.005。甲基纤维素集落形成试验中NB4/WTA克隆形成率明显下降,集落形成抑制率为46.9%。在As2O3(终浓度0.2μmol·L-1)作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示,NB4/WTA组S期细胞比例升高。RT-PCR检查提示,NB4/WTA细胞p21、CyclinA1基因的表达较对照组升高。结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达将WT1基因异构体表达的比例由 17AA/ KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能抑制NB4细胞的增殖,使其克隆形成能力明显下降。这可能与p21、CyclinA1基因表达上调,细胞周期阻滞于S期有关。     

Gax基因转染对A549细胞增殖及原癌基因表达的影响

背景与目的在中国肺癌居各种恶性肿瘤之首位,寻求肺癌的基因疗法已成为人们努力的方向。本研究拟探讨生长终止特异性同源盒基因(growtharrest-specifichomeobox,Gax)对A549细胞系增殖及其原癌基因c-fos、c-junmRNA表达的影响。方法以腺病毒介导Gax基因(adenoviraltransductionoftheGaxgene,Ad-Gax)转染A549细胞,RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中GaxmRNA和蛋白表达;RT-PCR测定转染前后细胞中c-fos、c-junmRNA表达变化;MTT法检测Gax基因转染对A549细胞生长的抑制作用,计算24、48、72h细胞抑制率。结果RT-PCR和免疫细胞化学证实Gax基因转染A549细胞后Gax能稳定表达,未转染组未发现Gax表达;RT-PCR证实转染组A549细胞中c-fos、c-junmRNA比未转染组显著降低(t=7.755,P<0.01;t=5.938,P<0.01);MTT法检测显示转染组A549细胞在24、48、72h的抑制率分别是(47.35±5.36)%、(54.96±1.78)%、(65.39±5.11)%,随时间逐渐升高与未转染组同时间比较有显著性差异(χ2=7.152、9.431、12.847,P<0.01)。结论Gax基因转染能抑制A549细胞的增殖,其分子机制可能与Gax下调c-fos、c-jun的表达有关。     

BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的影响

 目的　探索抑癌基因BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞SOSP 96 0 7的影响。方法　通过细胞培养 ,测量细胞生长曲线、计算细胞集落形成率、检测细胞周期等 ,观察BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞系SOSP 96 0 7的影响。结果　BRCA1基因反义寡核苷酸浓度为 1 0 μmol/L时 ,骨肉瘤细胞的生长速度变快 ,集落形成率明显增高 ;流式细胞仪检测发现其引起细胞周期变化 ,细胞增殖活性提高。结论　BRCA1基因反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞SOSP 96 0 7有明显的影响 ,使得骨肉瘤细胞恶性生物学特性更加显著 ,提示BRCA1基因在人骨肉瘤发展过程中起作用     

沉默dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞周期、增殖及凋亡的影响

背景与目的:DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferase1,dnmt1)基因在多种肿瘤细胞中表达量相当高,而在正常成人细胞中则低表达,因此dnmt1基因的高表达与肿瘤的发生有密切的关系。本研究观察以dnmt1基因为靶基因的重组质粒对胃癌细胞株AGS细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法:设计短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的寡核苷酸片段,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体pshRNA-dnmt1,转染胃癌细胞株AGS。实验分为空白对照组(仅予脂质体)、pTZU6 1组(予空质粒pTZU6 1)和pshRNA-dnmt1组(予以重组质粒pshRNA-dnmt1)3组。Westernblot检测dnmt1蛋白水平变化;RT-PCR法评估mRNA水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;吖啶橙/溴乙锭双染色(AO/EB)法、电镜和TUNEL观察细胞凋亡情况。结果:成功构建重组质粒pshRNA-dnmt1,并经序列分析得到确认。pshRNA-dnmt1转染AGS细胞后24h出现dnmt1蛋白表达量减少,24、48、72h抑制率分别为28.24%、68.54%、81.47%。转染pshRNA-dnmt1后24、48、72h对AGS细胞中dnmt1mRNA的抑制率分别为21.63%、52.97%、72.06%。转染后72hS期细胞由空白对照组的(36.58±1.76)%降至pshRNA-dnmt1组的(18.54±6.59)%;G2/M期细胞由空白对照组的(6.18±0.32)%升至pshRNA-dnmt1组的(18.53±1.42)%,均有显著性差异(P<0.05)。转染后24、48、72h细胞存活率分别为79.49%、51.63%和39.16%。AO/EB法、电镜和TUNEL均可见大量典型的凋亡和坏死细胞。结论:重组质粒pshRNA-dnmt1能特异有效地抑制AGS细胞内dnmt1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供依据。