心肌肌球蛋白及其重链的研制、特性鉴定和应用

目的 分离、提纯人心肌肌球蛋白(HCM)及其重链(HCMHC),为心肌显像及其显像剂抗HCMHC抗体的研究打基础。方法 参考猪心肌肌球蛋白制备方法,做了较大改进后,提取了HCM,用盐酸胍裂解HCM制备了HCMHC。用SDS-PAGE(梯度)电泳测定分子质量,用检测无机磷的方法测定HCM的ATP酶活力,用Ellman氏试剂测定游离巯基。将HCMHC免疫动物,用ELISA法测定了血清抗体效价。结果 HCMHC的相对分子量为200×10³,纯度大于80%;被免疫的BALB/C小鼠血清的抗体滴度最高达10⁷,细胞融合率达80%。结论 研制的HCMHC具有良好的免疫学活性,为下一步抗HCMHC单链可变区抗体(ScFv)及其放射性核素受体显像的研究打下了基础。     

Se和VE对大鼠心肌肌球蛋白重链基因表达影响的研究

从克山病病区粮和非病区粮及病区粮补加Ｓｅ和ＶＥ喂养的大鼠心肌中提取总ＲＮＡ，采用斑点印迹法分析其中的α和β－心肌肌球蛋白重链（ＣＭＨＣ）ｍＲ－ＮＡ含量的变化，并对大鼠血清及心肌组织中的Ｔ４、Ｔ３含量及Ｔ４５－脱单碘酶活性进行了观测。结果表明，与对照组相比，病区粮喂养大鼠心肌组织中的α－ＣＭＨＣｍＲＮＡ含量降低而β－ＣＭＨＣｍＲＮＡ含量升高，同时心肌和血清中Ｔ３含量显著下降，血清Ｔ４增高而心肌Ｔ４变化不大，心肌中Ｔ４５－脱单碘酶活性降低。补加Ｓｅ和ＶＥ后上述改变明显回转，提示克山病致病因素可导致大鼠ＣＭＨＣ基因表达的偏移。Ｓｅ和ＶＥ对心肌肌球蛋白的保护作用可能与心肌Ｔ４５－脱单碘酶活性、Ｔ３含量及其对ＣＭＨＣ基因表达的调控有关。     

抗氯霉素抗体可变区基因的克隆与序列分析

[目的]克隆并分析抗氯霉素单克隆抗体(抗CAPmAb)的轻、重链可变区基因VL和VH. [方法]从分泌抗CAP mAb的杂交瘤细胞株4D10中提取总RNA,利用RT-PCR技术和一系列简并引物扩增VL和VH基因,扩增产物克隆于pMD18-T后测序,利用VBASE2数据库进行比对分析. [结果]有多对引物扩增到VL或VH基因,但同一基因的不同引物扩增到的序列相同.VL和VH基因长度分别为342 bp和357 bp,分别编码114个和119个氨基酸残基.编码产物均具有4个FR区、3个CDR区和2个特征性半胱氨酸残基,符合典型的KABAT结构特点,分别属于IGKV1亚群和IGH-V3609VH8家族.所克隆序列已被GenBank收录,序列号分别为FJ477893和FJ477894. [结论]成功克隆到抗CAPmAb的VL和VH基因,为进一步构建氯霉素残留检测用基因工程抗体打下了基础.     

抗心肌肌凝蛋白重链自身抗体IgG亚类与腹主动脉缩窄、冠状动脉结扎术后大鼠慢性心力衰竭的关系

目的 研究抗心肌肌凝蛋白重链自身抗体(AMHCA)IgG亚类的产生与腹主动脉缩窄(AAC)、冠状动脉结扎(LCL)术后大鼠慢性心力衰竭(CHF)之间的关系.方法 应用AAC术与LCL术建立两种CHF大鼠模型,以合成的大鼠心肌肌凝蛋白重链部分肽段(1135-1150位氨基酸残基)为合成肽抗原,采用间接ELISA方法检测大鼠血清中AMHCA IgG亚类的水平及动态变化.结果 两组模型大鼠手术处理后1-2周AMHCA IgG1、IgG2a和IgG2b亚类阳性率较手术完成时均增高(P＜0.05).两组大鼠模型术后1～2周IgG1、IgG2a和IgG2b自身抗体阳性率和抗体滴度开始增高,3～4周达峰值,5～6周后缓慢下降.结论 AAC和LCL组大鼠模型在CHF的发生、发展过程中均有AMHCA IgG亚类的产生,并呈产生、维持、衰减的动态变化.     

抗氯霉素单链抗体基因的表达及免疫学活性初探

目的：构建和原核表达抗氯霉素（CAP）的单链抗体基因,并进行免疫学活性的初步测定。方法：通过柔性连接肽（G4S）3,将成功克隆出的氯霉素单抗4B12的重、轻链可变区基因（VH和VL）组装成CAP-SCFV,并在5＇和3＇引入相应的酶切位点,克隆到pET-22b（＋）后转化入E.coliBL21的工程菌;分别在25℃和37℃诱导表达,SDS-PAGE电泳和间接ELISA分析表达的目的蛋白和纯化后的免疫活性。结果：经酶切鉴定,DNA测序分析和NCBI比较,证明基因构建正确,轻链为鼠源κ链,所得单链抗体具有功能性鼠抗体可变区基因的特征;SDS-PAGE和间接ELISA分析检测表达产物,目的蛋白为24ku,纯化后的蛋白在64000倍稀释时免疫学活性良好。结论：在成功的原核表达了CAP-SCFV的同时保证了CAP单链抗体的抗原表位暴露正常,为药物残留的下步检测方法建立奠定了基础。     

一株抗腮腺炎病毒Fab抗体克隆的筛选

[目的]获得抗腮腺炎病毒Fab段基因工程抗体。[方法]将腮腺炎病毒抗原（MUV-Ag）包被在固相ELISA板中,采用＂吸附-洗脱-扩增＂的方法,对已构建的抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库进行富集。从富集后的抗体库中筛选抗腮腺炎病毒阳性克隆,并交叉筛选鉴定其特异性。[结果]在对176个克隆筛选后,再用麻疹病毒抗原（MEV-Ag）、混合副流感病毒抗原（mPIV-Ag）和呼吸道合胞病毒抗原（RSV-Ag）进行交叉筛选,最终获得特异性抗MUV-Ag阳性克隆2个（B206和D210）。对其中1株B206序列分析表明它的κ轻链V基因属于VκⅠ（O12）亚群,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于VH1-69亚群,D基因来自D3-10,J基因则来自JH6。[结论]用腮腺炎病毒抗原成功地从抗体库中筛选到特异性阳性克隆,构建的噬菌体抗体库是有效的。     

抗华支睾吸虫循环抗原噬菌体抗体基因分析

目的 对获得的抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆进行基因分析.方法 将2株阳性克隆抗体基因进行测序,并用NCBI和Ig Blast Analysis of Immunog lobulinse quences中的分析软件,对其推导的氨基酸序列进行分析,再进一步模拟它们的二级结构.结果 E38、B05阳性克隆抗体基因与人免疫球蛋白κ轻链和γ重链可变区基因高度同源.推导的氨基酸序列均具有典型的抗体轻、重链可变区特征.用分析软件对推测的2株克隆轻链和重链Fd氨基酸序列进行二级结构模拟,结果显示以β-折叠和转角为主的平行肽链形成片层样结构,均符合抗体二级结构构型.结论 E38、B05阳性克隆外源基因均属于人免疫球蛋白κ轻链和γ重链可变区基因.     

人抗内毒素类脂A抗体轻,重链可变区基因的克隆

目的为了寻找一种治疗内毒素血症及其并发症较为有效的途径，本研究进行了人抗内毒素类脂Ａ轻、重链可变区基因的克隆。方法从含有内毒素抗体的淋巴细胞中提取ｍＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ，再使用设计合成的人抗体轻、重链引物。结果应用ＰＣＲ技术，扩增获得人抗内毒素抗体轻、重链可变区基因，琼脂糖凝胶电泳，得到两条约３４０ｂｐ和３２５ｂｐ的强荧光带。抗体的ＶＨ和ＶＬ基因经ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ柱纯化后，将ＶＨ和ＶＬ基因用一个编码氨基酸序列为（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３的基因连接子连接，最后将此物定向克隆进载体ｐＣＡＮＴＡＢ５中。结论抗体ＤＮＡ在噬菌体中的重组获得了成功，为下一步的筛选、表达打下了基础。     

应用特殊设计的单链寡核苷酸链纠正抗肌萎缩蛋白基因的点突变的研究

目的 探讨使用特殊设计的单链寡核苷酸链(ODN)纠正抗肌萎缩蛋白基因的点突变.方法 给予DMDmdx小鼠肌内注射低剂量和高剂量的ODN,以及另外附加透明质酸酶预处理和活体电穿孔术,采用扩增阻滞突变体系(ARMS)法检测点突变纠正情况.结果 不管是低剂量和高剂量ODN肌内注射,还是在此基础上另外再附加电穿孔术,都看不到纠正了的基因条带.结论 使用的实验方法不能纠正抗肌萎缩蛋白基因的点突变或纠正率过低ARMS法检测不出.     

氯沙坦与依那普利对梗死心肌肌球蛋白重链基因表达的影响

目的观察氯沙坦与依那普利对心肌梗死后心室重构、功能改变的干预作用。方法SD大鼠32只随机分为正常对照组、急性心肌梗死(AM I)组、AM I口服依那普利组、AM I口服氯沙坦组。6周后测左室重量及心肌肌球蛋白重链基因分析。结果依那普利、氯沙坦治疗组心脏重量指数均较AM I组下降,而心肌的-αMHC mRNA表达较AM I组增加,-βMHC mRNA表达较AM I组降低(P<0.01)。结论血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂改善梗死心肌心室重构的机制与其调节心肌MHC的基因表达有关。     

RT-PCR扩增人源性抗腮腺炎病毒抗体轻链和重链Fd基因

目的 克隆人源性抗腮腺炎病毒抗体轻链和重链Fd基因。方法 从腮腺炎患和腮腺炎抗体IgG阳性中各抽取其外周血3ml，分离出淋巴细胞后，提取总RNA，逆转录成cDNA。设计人抗体轻链κ、λ和重链Fd基因的引物进行聚合酶链反应(PCR)，扩增轻链和重链Fd段基因。结果 从48名腮腺炎病毒IgG抗体阳性中，共提取高质量RNA约110μg，经RT-PCR分别扩增出约700bp大小的κ、λ和Fd基因。结论 从人淋巴细胞中成功克隆出抗体轻链κ、λ和重链Fd基因，为制备抗体陆重组表达载体，进一步构建抗腮腺炎病毒噬茵体抗体库打下基础。     

Proteomic profiling of precipitated Clostridioides difficile toxin A and B antibodies

Clostridioides difficile infection is the leading cause of nosocomial diarrhoea globally. Immune responses to toxins produced by C. difficile are important in disease progression and outcome. Here, we analysed the anti-toxin A and anti-toxin B serum antibody proteomes following natural infection or vaccination with a C. difficile toxoid A/toxoid B vaccine using a modified miniaturised proteomic approach based on de novo mass spectrometric sequencing. Analysis of immunoglobulin variable region (IgV) subfamily expression in immunoprecipitated toxin A and toxin B antibodies from four and seven participants of a vaccine trial, respectively, revealed a polyclonal proteome with restricted IGHV, IGKV and IGLV subfamily usage. No dominant IGHV subfamily was observed in the toxin A response, however the dominant anti-toxin B heavy (H)-chain was encoded by IGHV3-23. Light (L)-chain usage was convergent for both anti-toxin A and anti-toxin B proteomes with IGKV3-11, 3-15, 3-20 and 4-1 shared among all subjects in both cohorts. Peptide mapping of common IgV families showed extensive public and private amino acid substitutions. The cohort responses to toxin A and toxin B showed limited similarity in shared IGHV subfamilies. L-chain subfamily usage was more similar in the anti-toxin A and anti-toxin B responses, however the mutational signatures for each subfamily were toxin-dependent. Samples taken both post vaccination (n = 5) or at baseline, indicating previous exposure (n = 2), showed similar anti-toxin B IgV subfamily usage and mutational profiles. In summary, this study provides the first sequence-based proteomic analysis of the antibody response to the major disease-mediating toxins of C. difficile, toxin A and toxin B, and demonstrates that despite the potential for extreme diversity, the immunoglobulin repertoire can raise convergent responses to specific pathogens whether through natural infection or following vaccination.