骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响(英文)

背景:在临床工作中,外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损。其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液,并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同。有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖,并诱导其向成骨细胞转化。目的:观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。设计:单一样本实验。单位:天津市天津医院骨科研究所。材料:实验于2004-10/2005-12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔。浓度为5×102g/L生肌液从生肌象皮膏(由天津市中药饮片厂提供,原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余)提取。方法:将25,8.3,5g/L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞,以不含生肌液的基础培养液为空白对照,以含地塞米松10-8mol/L,维生素C0.05g/L,β-甘油磷酸钠10mmol/L的基础培养液为标准对照。将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周,采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况,采用四环素标记及胶原Ι免疫组织化学染色观察细胞的表达情况,取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量,将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和,计算碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶值。主要观察指标:培养2,3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ι免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶值。结果:①细胞钙结节观察结果:除了标准对照细胞外,不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长,胞体先后出现拉长,聚集生长,随后中心细胞增殖、重叠,细胞之间界限模糊,逐渐形成多个散在的细胞结节,钙沉积逐渐出现,最终形成钙化结节。②四环素标记及胶原Ι免疫组织化学染色:除了基础培养液组外,各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色,空白对照细胞为阴性;除了标准对照细胞外,不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ι免疫组织化学染色呈阳性,棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中。③碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶检测结果:条件培养后2,3周,25g/L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶/乳酸脱氢酶、骨钙素/乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定,且高浓度时诱导成骨作用较强。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法.但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚.目的:尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓闻充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓.分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养.当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中.实验随机分为3组:空白对照组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组:每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%-70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培葬液,电针刺激.采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d.相差倒置显微镜观察细胞形态变化:茜索红染色结果:细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性:RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达:Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达.结果与结论:①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5-7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象:电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状.②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到育矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应.③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P<0.05):且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P<0.05),但28 d时差异无显著性意义(P>0.05).④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P<0.05).提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.     

瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景:瘦素及其受体在中枢和外周多个部位均有表达,具有多种生物学功能,对于骨代谢有着重要的影响作用,但目前瘦素影响骨重建的机制尚未完全明了.目的:探讨瘦素对入骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/2008-09在山西医科大学生化与分子生物学实验室完成.材料:健康志愿者髂骨骨髓由山西医科大学第二医院提供.瘦素为Sigma公司产品.方法:采用全骨髓法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代以1×108L-1密度接种至预置盖玻片的6孔培养板中,设立3组:成骨诱导组添加原代培养液后,再加入含10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油,50 mg/L维生素C的成骨诱导培养基:成骨+瘦素诱导组添加成骨诱导培养基后,再加入50 nmol/L瘦素;空白对照组仅加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面标志表达、钙化结节染色结果、碱性磷酸酶活性,Ⅰ型胶原及骨钙素含量、骨保护素和RANKL蛋白的表达.结果:第3代骨髓间充质干细胞CD44和CD71阳性率分别为95.21%,72.31%,CD34阳性率仅为0.39%.成骨诱导21 d后von Kossa染色可见呈棕黑色的细胞外基质钙盐沉积.诱导14 d与空白对照组比较,成骨诱导组、成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原、骨钙素含量均明显升高(P＜0.05);且成骨+瘦素诱导组各指标升高幅度明显高于成骨诱导组(P＜0.05).与成骨诱导组比较,成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞骨保护素蛋白的表达明显上调(P＜0.05),RANKL蛋白的表达明显下调(P＜0.05).结论:瘦素作用于人骨髓间充质干细胞后可促使其向成骨细胞分化,可能通过骨保护素/RANKL途径发挥对骨代谢的调节作用.     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变

背景:目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察.目的:采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点.设计、时间及地点:观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成.材料:成年新西兰大白兔由自求恩国际和平医院实验动物中心提供.Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜.方法:从新西兰大白兔骼后上嵴处抽取骨髓.经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C.培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测.主要观察指标:光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点.结果:培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果.经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应.光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列.透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.结论:骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。     

中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

背景：在临床工作中，外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损。其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液，并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同。有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖，并诱导其向成骨细胞转化。目的：观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。设计：单一样本实验。单位：天津市天津医院骨科研究所。材料：实验于2004—10／2005—12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔。浓度为5×10^2g／L生肌液从生肌象皮膏（由天津市中药饮片厂提供。原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余）提取。方法：将25，8．3，5g／L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞，以不含生肌液的基础培养液为空白对照，以含地塞米松10^-8mol／L，维生素C0．05g／L，β-甘油磷酸钠10mmol／L的基础培养液为标准对照。将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周，采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况，采用四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色观察细胞的表达情况，取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量，将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和，计算碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。主要观察指标：培养2，3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。结果：①细胞钙结节观察结果：除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长，胞体先后出现拉长，聚集生长，随后中心细胞增殖、重叠，细胞之间界限模糊，逐渐形成多个散在的细胞结节，钙沉积逐渐出现，最终形成钙化结节。②四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色：除了基础培养液组外，各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色，空白对照细胞为阴性；除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ⅰ免疫组织化学染色呈阳性，棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中。③碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶检测结果：条件培养后2，3周，25g／L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定，且高浓度时诱导成骨作用较强。     

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化:Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大.目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力.方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10 mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077 g/mL Ficoll液3 mL,2 000 r/min离心20 min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×10~4/cm~2密度接种,于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内培养.细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导.免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色.结果与结论:1.077 g/mL Ficoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24 h.犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞.     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景:利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。目的:通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。方法:利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。结果与结论:原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.     

大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的：研究大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性．探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）的测定。结果：经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征，同时在诱导2周后表达ALP活性，在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论：体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

改良体外培养方法及诱导剂配比条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞取材方便,易于体外扩增,其体外培养方法及诱导分化仍需要改良.目的:对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法及诱导剂配比进行改良,观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能.设计:观察实验.单位:解放军广州军区广州总医院医学实验科.材料:实验于2004-07/2006-06在解放军广州军区总医院医学实验科干细胞组织工程实验室完成,选用20只成年SD大鼠,清洁级,雌雄不拘,体质量140～180 g,由解放军广州军区广州总医院动物实验中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.β-甘油磷酸纳,地塞米松,维生素C均为美国Sigma公司产品,羊抗大鼠骨钙素抗体购自美国DSL公司,S-P免疫组化试剂盒为福建迈新生物技术开发有限公司产品.方法:采用改良法进行细胞的培养及诱导细胞成骨.①骨髓间充质干细胞分离及培养:大鼠麻醉后处死分离双侧股骨、胫骨骨髓制备单细胞悬液接种于培养瓶中,培养后48及96 h半量更换培养液,以去除未贴壁的造血细胞,以后每3 d换液1次,进一步去除未贴壁的细胞,待细胞汇合约80%时,用0.25%胰蛋白酶消化,按1:2传代培养.将第2代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板和玻璃平皿中,48 h后吸去基础培养液.②骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化:应用含终浓度分别为10 mmol/L、10-7 mol/L、50 mg/L的地塞米松、β-甘油磷酸纳和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化.主要观察指标:①应用改良的培养方法及自行配比的培养液诱导分化后10 d采用钙钴法测定碱性磷酸酶活性.②培养后12 d采用免疫组织化学法检测骨钙素分泌情况.③诱导培养后2周采用Von kossa染色检测细胞矿化作用.结果:①碱性磷酸酶活性:经诱导后细胞碱性磷酸酶染色明显,胞质中刚性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀,碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色.②骨钙素分泌情况:细胞经诱导后骨钙素阳性较明显,胞核呈蓝色,胞浆呈棕色.③细胞矿化作用:细胞经诱导培养后呈复层生长,并出现不透明结节,Von kossa染色可见黑色的矿化结节颗粒,颗粒大小不均一,提示有矿化基质沉积.结论:改良法可成功培养及诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体，因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点，是近年研究的热点。实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法，并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能。 方法：实验于2006-08/2007—06在吉林大学药学院生物工程实验室完成，实验室属吉林大学重点实验室。①实验材料：四五月龄新西兰大白兔2只，由吉林大学基础医学院动物培养中心提供，体质量1．0～1．5kg，雌雄不限，实验动物级别为二级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养，以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并利甩成骨诱导剂包括0．1μmol／L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol／L β-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10％FBS的L．DMEM、0．25μmol／L地塞米松、50μmol／L吲哚美辛、0．5mmol／LIBMX、10mg／L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化。 结果：①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，类似于成纤维细胞，骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44，而CD34、CD45均阴性表达。②成骨诱导14d后细胞不明显，未形成钙结节，21d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色。③成脂诱导48h后，细胞内有小脂滴出现，2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞（有）由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积。 结论密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法，骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分?     

miR-3960对成骨细胞分化的影响

背景:成骨细胞的分化成熟过程涉及多种激素和细胞因子对成骨细胞分化相关基因表达的调控,近来发现多个微小RNAs也参与了这一调控过程。目的:观察miR-3960在小鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的作用。方法:将miR-3960表达载体pSilencer4.1-miR-3960转染骨髓基质细胞,构建miR-3960过表达细胞模型,随后予300μg/L骨形态发生蛋白2诱导分化,观察成骨细胞分化指标变化。结果与结论:转染pSilencer4.1-miR-3960能够在细胞中稳定地高表达miR-3960。miR-3960过表达促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的碱性磷酸酶活性增高和骨钙素分泌,增加细胞中的钙沉积量。抑制miR-3960降低骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的碱性磷酸酶活性,减少骨钙素分泌,降低钙沉积量。表明miR-3960可以促进成骨细胞分化。     

兔骨髓基质细胞的体外分离培养及诱导成骨的实验研究

目的 探讨兔骨髓基质细胞（BMSCs）的体外分离培养及定向诱导成骨的方法。方法 选择10周龄新西兰兔，抽取其股骨大转子部骨髓，体外分离纯化得到BMSCs，再利用条件培养液将其向成骨方向定向诱导培养。采用碱性磷酸酶（ALP）和冯库萨（Von Kossa）染色方法，鉴定其成骨性能。结果 BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖，经ALP和Yon Kossa染色证实其有成骨潜能。结论 兔BMSCs的体外培养增殖能力强，能诱导分化为成骨细胞，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的：研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法：从骨髓血中提取hMSCs,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,以流式细胞仪检测hMSCs的表面抗原表达.传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,相差显微镜观察并绘制生长曲线.免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.NAP法碱性磷酸酶染色、vonKossa法钙结节染色.结果：hMSCs增殖活跃,CD105、CD44表达阳性, CD14、CD34和CD45阴性.诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原和骨钙素染色阳性.结论：hMSCs取材方便,易诱导分化为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.[     

1，25-（OH）2VitD32促进组织工程骨的血管化和骨化

目的：观察以1，25．（OH）2VitD3为活性因子，与人骨髓间质成骨细胞、脐静脉血管内皮细胞、珊瑚羟基磷灰石人工骨联合构建组织工程骨时，1，25-（OHhVitD3在三维支架上对成骨细胞的作用及构建组织工程骨的体内快速血管化能力和异位成骨能力。方法：（1）实验材料及对象：实验于2005—09／2006—03在苏州大学细胞与基因教研室完成。取SPF级6—8周龄BALB／cnu雄性裸鼠18只，体质量27～32g，骨髓来源于健康成人（志愿者）、新生儿脐带取材时经产妇同意。（2）实验方法及评估：①体外实验：体外分离、培养人骨髓间质成骨细胞和脐静脉内皮细胞。人骨髓间质成骨细胞以5×10^8 L^-1，脐静脉内皮细胞以2．5×10^8 L^-1按2：1比例接种至经1，25-（0H）2VitD3处理过的珊瑚羟基磷灰石人工骨上，作为实验组；相同比例接种于单纯珊瑚羟基磷灰石人工骨上为对照组。体外培养3d后，检测骨钙素含量及碱性磷酸酶活性并始终行光学显微镜观察。②动物实验：18只裸鼠随机摸球法分为两组，9只植入实验组组织工程骨每侧1块，另9只植入对照组组织工程骨每侧1块。术后4，8，12周后取材，行常规组织学、扫描电镜观察，并行植入物新生血管定量分析和成骨的定量判断。 结果：纳入裸鼠18只，均进入结果分析。①倒置显微镜下珊瑚羟基磷灰石人工骨周边人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞均良好生长。组织工程骨构建3d后，骨钙素含量和碱性磷酸酶活性实验组明显高于对照组（P〈0．05）。②组织学观察可见，4周时，各组原始类骨组织均长入支架材料内部。8周时，骨组织成熟与微血管相伴出现。12周时，各组均有成熟骨组织出现。对照组在各时间点微血管量均少于实验组。扫描电镜观察，4周时，实验组大量细胞外基质将细胞包埋，材料表面可见大量微血管     

α- 玉米赤霉醇影响小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化简

背景：骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力,植物雌激素α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化可能有促进作用。 目的：探讨α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为6组：非诱导组加含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的 IMDM 普通培养基;空白诱导组仅加入等量成骨条件培养基（含0.1μmol/L 地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L 维生素C）;阳性对照诱导组加入等量成骨条件培养基及10-8 mol/L雌二醇;高、中、低α-玉米赤霉醇组分别加入成骨条件培养基及10-5,10-6,10-7 mol/L梯度浓度的α-玉米赤霉醇。倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT 实验测定细胞增殖状态绘制细胞生长曲线,酶联免疫吸附法测定碱性磷酸酶、骨钙素的表达。 结果与结论：非诱导组细胞呈长梭形,生长密集时有接触抑制,各诱导组的细胞增殖受促进,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞可重叠生长;非诱导组低表达碱性磷酸酶、骨钙素,低浓度（10-7 mol/L）α-玉米赤霉醇组和阳性对照诱导组高表达碱性磷酸酶、骨钙素,与空白诱导组相比,差异有非常显著性意义（P＜0.01）。结果说明α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,低浓度α-玉米赤霉醇可显著促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。而上调碱性磷酸酶、骨钙素的表达量可能是α-玉米赤霉醇诱导促进骨髓间充质干细胞骨向分化的作用机制之一。