运用噬菌体展示随机肽库筛选与内毒素结合的高亲和性多肽

目的 从噬菌体展示随机肽库中筛选与内毒素结合的多肽序列,并进行鉴定.方法 以内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为靶分子对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆,应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证.挑选结合力强的克隆进行DNA测序,推导出呈现的多肽序列,应用生物信息学软件进行多肽序列分析和同源性分析.结果 经4轮亲和筛选从噬菌体展示随机十二肽库中筛选获得了86个克隆,挑选12个结合力强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析,结合本项目组的噬菌体展示随机七肽库筛选结果推导出呈现的多肽序列为HWQWPHWSPPP(命名为P11肽).检索相关数据库发现此肽序列未被申请专利,体内约908种蛋白与其结构相匹配,其中包含有与LPS相互作用的位点.结论 通过对噬菌体展示随机肽库的淘选,获得与LPS结合的高亲和性多肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

整合素αvβ3特异性结合肽的筛选及初步鉴定

目的 应用噬菌体随机肽库展示技术筛选能与整合素αvβ3分子具特异性结合功能的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法 根据整合素αvβ3分子细胞外配体结合区域的品体结构及蛋白质序列设计①～⑤号5条短肽,并作为筛选配基,分别经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,粘附试验进一步分析化学合成多肽的功能.结果 经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,以⑤号肽为代表,ELISA鉴定显示7个阳性克隆能与⑤号合成短肽有较强结合活性.进行DNA测序,多重序列分析获得2个多肽基序:****HRH,HWR****.粘附试验表明化学合成多肽FITC-HLPWHRH,FITC-HWRLHPH与表达整合素αvβ3的细胞株具有一定的亲和性,且结合能被αvβ3分子配体纤维连接蛋白所抑制.结论 通过噬菌体随机展示肽库技术在体外对合成的短肽进行筛选,可以获得与整合素αvβ3分子具特异性结合能力的小肽分子.     

肿瘤坏死因子-α高亲和噬菌体融合肽的筛选及分析

目的 应用噬菌体展示随机肽库技术,进行肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高亲和肽的筛选研究.方法 以重组人TNF-α为靶标分子,对噬菌体展示环七肽库进行3轮亲合筛选,ELISA结合实验鉴定阳性克隆,对获得的阳性克隆进行DNA序列测定,推导短肽的氨基酸残基序列.结果 3轮筛选后,随机挑取的15个噬菌体克隆中7个可与TNF-α结合.测序发现这7个阳性克隆融合多肽中的序列完全一致,均为STPTRYS.结论 筛选到一个可与TNF-α高亲力结合的噬菌体多肽,该肽序列能否阻断TNF-α的活性有待进一步阐明.     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

噬菌体展示短肽模拟脂多糖结合蛋白抗炎功能位点的研究

目的应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaceharide binding protein,LBP)具有抗炎作用的肽序列.方法以LPS为目标分子,对噬菌体十二肽库进行亲合筛选,4轮筛选后,检测随机挑取的噬菌体克隆的结合活性和抑制活性,对可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆行细胞因子生成抑制实验和LPS内化抑制实验,对获得的阳性克隆进行DNA序列测定,推导外源肽氨基酸序列,并与LBP序列比较,确定LBP的抗炎功能位点.结果随机挑取的100个噬菌体克隆中16个可与LBP竞争性结合LPS,其中7个噬菌体克隆对LBP的增敏LPS刺激PBMC分泌TNF-α功能无作用,对这7个克隆进行LPS内化抑制实验,其中3个克隆可以抑制LBP增强LPS内化作用.测序发现这3个阳性克隆融合多肽的序列均为FHTRWNYWPYLH,与IBP一级结构氨基酸序列同源性低.结论该12肽序列可以模拟LBP的抗炎功能位点.     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

噬菌体肽库筛选转化生长因子βⅡ型受体亲和肽

目的:从噬菌体随机肽库中筛选转化生长因子β(TGF-β)Ⅱ型受体的亲和短肽。方法:以重组可溶性人TGF-βⅡ型受体作为靶标,应用噬菌体随机十二肽库进行筛选,经过3轮淘选,提取阳性噬菌体克隆ssDNA,测序并进行序列分析。结果:通过筛选噬菌体获得富集,挑选10个能与人TGF-βⅡ型受体特异性结合的噬菌体克隆,测序得到4个核酸序列,未发现共有保守序列。结论:通过噬菌体肽库技术能筛选出与TGF-βⅡ型受体结合的噬菌体展示肽,为进一步研究TGF-βⅡ型受体亲和短肽及在抗肝纤维化中的作用提供依据。     

通过噬菌体筛选表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽

目的筛选并鉴定与表达人CD59的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞特异结合的内化短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽药物奠定基础。方法以高表达人CD59的CHO细胞为靶,对噬菌体随机十二肽库进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,用ELISA法筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。结果随机挑选的10个克隆中有6个与人CD59结合力高,测序后得到2个高度同源的氨基酸序列。结论获得了与高表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽序列,为进一步设计与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据。     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

华支睾吸虫模拟抗原表位的筛选和鉴定

目的从噬菌体12肽库中筛选华支睾吸虫模拟抗原表位。方法应用噬菌体随机12肽库亲和筛选华支睾吸虫病患者混合血清IgG,经过3轮的淘筛,随机挑取蓝色噬菌斑进行扩增,以ELISA检测其免疫活性,挑选免疫活性较高的克隆进行序列分析及免疫学鉴定。结果8个阳性克隆测得6个DNA序列,Western-bloting显示6个单克隆噬菌体均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。结论应用噬菌体肽库筛选技术可以获得华支睾吸虫模拟抗原表位。     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的:探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法:以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆(即实验组A450nm值高于对照组3倍以上),并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果:经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高(P<0.05);利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆(C4、C6、C7、C10、C11和C17);通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性(P<0.05);测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论:利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的：探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法：以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆（即实验组A450nm值高于对照组3倍以上）,并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果：经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高（P<0.05）;利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆（C4、C6、C7、C10、C11和C17）;通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性（P<0.05）;测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论：利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

Neuropilin-1高亲和肽的筛选及初步鉴定

目的:利用合成的重组Neuropilin-1的蛋白分子对噬菌体随机七肽库进行筛选,以期获得能与Neuropilin-1分子具高亲和活性的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定。方法:对包被好的rhNeuropi-lin-1蛋白,经过三轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,竞争抑制试验进一步分析其相关化学合成多肽的功能。结果:经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,ELISA鉴定结果显示2个阳性克隆具有较强结合活性。DNA测序显示其具有*FPS***的一致基序。阳性克隆与Neuropilin-1分子的结合能被其相关化学合成多肽FITC-DFPSPLW所抑制。结论:利用噬菌体随机展示肽库技术获得了与Neuropilin-1分子具特异性结合能力的小肽分子,为进一步基于Neuropilin-1的肿瘤血管生成抑制的研究奠定基础。