反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的 探讨CD86mRNA反义肽核酸（peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法 采用激光共聚焦显微镜研究生物素化PNA的细胞内化；利用流式细胞术，荧光细胞组织化学以及RT-PCR研究CD86反义PNA对CD86分子表达的抑制作用，结果 （1）激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明，培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化PNA。（2）流式细胞术和荧光细胞组织化学证实CD86反义PNA在蛋白质水平上对CD86分子表达有抑制作用。（3）RT-PCR证明反义PNA能够抑制DCCD86mRNA水平。结论 CD86反义PNA能够抑制人树突状细胞CD86mRNA的表达，从而为进一步利用反义PNA阻断第二信号传递，诱导免疫耐受奠定了基础。     

胃癌及区域淋巴结中树突状细胞CD83、CD80、CD86的表达与临床意义

树突状细胞(DENDRITIC CELL,DC)是机体内功能最强的抗原提呈细胞(ANTIGEN PRESENTING CELLS,APCS),具有独特的抗原提呈和激发功能,在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用。对肿瘤微环境中浸润树突状细胞功能状态的研究将有助于揭示肿瘤的免疫逃逸机制。本研究应用     

小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体外对树突状细胞的作用

 目的 构建小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒表达载体,并在体外观察其对小鼠骨髓源性树突状细胞（dendritic cell,DC）的作用。方法 针对已经筛选确定的CD80基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,再与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;同法构建出CD86基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的DC,通过荧光显微镜检测感染效率,Annexin V/PI双染色法检测感染细胞凋亡和坏死情况,流式细胞仪检测CD80和CD86的表达情况。结果 PCR和测序证实,pGCL-CD80shRNA和pGCL-CD86shRNA慢病毒载体构建正确,病毒滴度均达2×107TU/mL,适合感染DC的MOI值为20,此时慢病毒对DC具有低毒性,感染效率为85.42%。CD80和CD86表达的抑制率分别为82.05% 和77.78%。结论 成功构建出小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体,其有明显抑制DC表面CD80和CD86的表达,这为移植物排斥提供了新的治疗手段。     

反义肽核酸抑制树突细胞趋化因子受体CCR7表达的实验研究

目的探讨靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸(PNA)对树突细胞(DCs)CCR7的表达及趋化活性的影响。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs,设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA,以随机PNA、空白组为对照处理体外培养7d的DCs,分别于24h,48h,72h后收集细胞,利用Western-blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测反义PNA对CCR7分子表达的影响,通过趋化实验检测DCs的趋化活性。结果DCs经PNA处理后24h,各组DCs其CCR7表达无明显差别,在48h,Western-blot检测显示反义PNA组CCR7蛋白表达明显低于对照组,而RT-PCR检测在mRNA水平却无明显差别。在72h,反义PNA组CCR7的表达在不同水平均明显低于对照组。经趋化实验证实,在48h以后反义PNA组DCs趋化活性受到明显抑制(P<0.05)。结论CCR7反义PNA能够有效抑制体外培养的大鼠树突细胞趋化因子受体CCR7的表达及其趋化活性,为进一步研究体内应用反义PNA抑制DCs的定向迁移和抗原递呈,调节免疫反应和诱导免疫耐受提供了新的策略。     

外周血树突状细胞Tim-3蛋白、CD80、CD86表达与骨髓增生异常综合征预后的相关性

目的 分析外周血树突状细胞(DC)T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)、CD80、CD86表达与骨髓增生异常综合征(MDS)患者预后的相关性.方法 选取2015年11月—2017年11月于四川大学华西医院血液内科就诊的MDS患者104例作为研究对象(观察组),并根据MDS国际预后评分系统(IPSS)将患者分为低...     

肽核酸的细胞传递

肽核酸(PNA)是第三代反义和反基因药物的代表.它是具有类多肽骨架的DNA类似物,在生物环境中非常稳定,与互补RNA和DNA有高度亲和性.PNA的细胞传递较差,限制了其作为基因表达调控剂的发展.目前已发展多种PNA的细胞传递方法,包括微注射法、电致孔、与DNA共转染、与脂溶性基团结合、与肽结合等.PNA在DNA细胞传递中有协同作用.     

沉默CD86树突状细胞在异种胰岛混合淋巴细胞培养中的 作用研究

目的 探讨沉默CD86 的树突状细胞（DC）在异种胰岛混合淋巴细胞培养中的作用。方法 分离培养BALB/c小鼠骨髓来源DC,流式细胞仪鉴定后,以CD86 siRNA转染DC。分离纯化SD大鼠胰岛,吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）双荧光染色方法检测胰岛细胞活性;提取SD大鼠脾脏淋巴细胞,与经siRNA沉默CD86 的DC混合培养,使DC负载SD大鼠抗原。在400胰岛当量SD大鼠胰岛细胞+1×10⁶个BALB/c小鼠淋巴细胞（对照组1）基础上,混合普通DC（负载SD大鼠抗原）（对照组2）或siRNA沉默CD86 的DC（负载SD大鼠抗原）（实验组）进行体外培养,另以单纯SD大鼠胰岛细胞为空白组,培养3 d后倒置显微镜下检测细胞形态学变化,测定上清液中反映淋巴细胞增殖的细胞因子白介素（IL）-2、IL-4、IL-10及干扰素（IFN）-γ水平,AO/PI染色观察胰岛活性,并行葡萄糖刺激胰岛素释放实验,计算刺激指数。结果 培养所得的细胞具有典型的DC形态,流式细胞仪检测DC表面CD11c、CD80、CD86的表达阳性率分别为（86.26±9.73）%、（72.64±8.55）%、（77.18±10.23）%。CD86 siRNA转染DC后CD86沉默。SD大鼠胰岛杂质较少,形态正常,细胞活性>95%。混合细胞培养3 d后,与对照组1、2比较,实验组的IL-10水平升高（P<0.05）,IL-4水平相当（P>0.05）,IL-2、IFN-γ均降低（P<0.05）,淋巴细胞增殖最少,胰岛功能最好,刺激指数最高。实验组4种细胞因子均高于空白组（P<0.05）,刺激指数低于空白组（P<0.05）。结论 沉默CD86 的DC负载供体抗原后,与供体胰岛、受体淋巴细胞混合培养,可在一定程度上减轻免疫排斥反应,从而保护供体胰岛功能。     

LPS刺激对大鼠视网膜小胶质细胞CD80、CD86和CD40表达的影响

目的 研究脂多糖(LPS)刺激对CD80、CD86、CD40在大鼠视网膜小胶质细胞上表达的影响,探讨视网膜小胶质细胞在视网膜和视神经病变中与T细胞活化的关系.方法 分离培养大鼠视网膜小胶质细胞并进行OX42染色鉴定,当细胞培养达80%融合状态时分为正常培养组和LPS刺激组.采用RT-PCR法检测两组细胞CD80、CD86和CD40 mRNA的表达,硝酸还原法和ELISA法检测两组细胞一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量.结果 RT-PCR检测显示,LPS刺激组的视网膜小胶质细胞CD80、CD86和CD40 mRNA的表达较正常培养组显著增加,两组比较差异有统计学意义(均P<0.01).正常培养组的视网膜小胶质细胞有少量NO和TNF-α分泌,LPS刺激组的小胶质细胞培养上清液中NO和TNF-α的分泌量较正常组显著增加[(18.10±1.57)μmol/L vs (1.55±0.15)μmol/L,(51.07±4.30)pg/mL vs (2.37±0.31)pg/mL],两组比较差异有统计学意义(均P<0.01).结论 培养的大鼠视网膜小胶质细胞有共刺激分子表达,LPS刺激后表达上调,提示视网膜小胶质细胞可能与T细胞活化有关.     

昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞成熟的影响

目的：研究昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞（DC）成熟的影响。方法：采用密度梯度离心法分离出正常人外周血单核细胞,经由含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF,20ng/mL）和重组人白介素4（rh IL-4,20ng/mL）的DC无血清培养基中培养,培养至第5天均加入OX-LDL（100μg/mL）。第6天将实验组分成三组,分别加入昆布多糖5μg/mL,2.5μg/mL,0.5μg/mL;对照组加入PBS。待DC与昆布多糖共同孵育24 h后,镜下观察DC形态变化,同时收集DC细胞采用流式细胞术检测DC表型（CD86,TLR2）的表达。结果：与PBS对照组相比较,实验组TLR2的表达明显上调（P〈0.05）;CD86的表达下调,各组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,与刺激因素昆布多糖存在剂量依赖。结论：昆布多糖干预培养后,外周血单核细胞源性DC的TLR2表达上调,CD86的表达下调,进而推测昆布多糖可以抑制DC的成熟。     

~（125）I标记反义肽核酸对SKOV3细胞CerbB-2 mRNA和Her-2蛋白表达的抑制作用

目的探讨利用脂质体转染125I标记的CerbB-2反义肽核酸（asPNA）阻断人卵巢癌细胞株SKOV3中CerbB-2mRNA翻译并抑制Her-2蛋白表达的作用。方法 （1）125I用CH-T法标记CerbB-2-asPNA,测定其标记率和放化纯。（2）分对照组、非标记分子探针组和125I标记反义肽核酸组,运用RT-PCR法检测各组细胞CerbB-2mRNA的翻译。（3）运用流式细胞仪检测各组细胞的Her-2蛋白表达率。结果 （1）125I标记CerbB-2-asPNA的标记率为（56.90±4.38）%,放射化学纯度为（87.00±0.99）%,放射性浓度为3.7MBq/ml,化学浓度为5.00μmol/L。（2）125I标记CerbB-2-asPNA作用SKOV3细胞24h后,SKOV3细胞CerbB-2在mRNA水平上明显下降,与SKOV3细胞对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。（3）125I标记CerbB-2-asPNA作用SKOV3细胞24h后,细胞的Her-2蛋白表达率降低幅度较大,与SKOV3细胞组对比,两者间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 125I-L-CerbB-2-asP-NA对人卵巢癌细胞株SKOV3CerbB-2基因表达在mRNA翻译和蛋白表达水平上均有抑制作用。     

CD80和CD86在肝癌、肝硬化组织中的表达

0　引言　 T细胞介导的细胞免疫在实质器官肿瘤的抗肿瘤免疫应答中起着重要的作用 [1 ] .这种免疫应答的产生至少涉及 2种信号 .其一由 MHC与特异性抗原的复合物与 TCR相互作用提供 ,其二由共刺激分子提供 .在适当的条件下 ,共刺激分子 B7家族与 MHC , 类分子在肿瘤细胞上的共同表达 ,可以在抗原特异性免疫应答和肿瘤的免疫排斥中引起 T细胞亚群的成功活化 .不表达 CD80和 CD86的肿瘤细胞是没有免疫原性的 [2 ] .因此 ,我们采用免疫组织化学方法对肝细胞肝癌 (HCC)、癌周组织 (pericancerous tissuse,PCT)及肝硬化 (L C)组织细胞…     

人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人骨唾液酸蛋白（hBSP）正反义真核表达载体，并检测其在骨肉瘤细胞MG-63中的表达。方法 以人骨膜细胞总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出hBSP全长序列，通过DNA重组技术构建hBSP正反义核酸真核表达载体，并用脂质体介导转染人MG-63细胞，通过RT-PCR及Western blot检测细胞中hBSPmRNA和蛋白的表达。结果 成功构建了hBSP正反义核酸真核表达载体，转染后有效表达hBSP，正义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平升高，反义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平降低。结论 转染正反义hBSP表达载体导致瘤细胞BSP表达的改变，为进一步实验研究提供了基础。     

CD28、CD80、CD86在银屑病皮损中的表达

目的研究共同刺激分子CD28、CD80、CD86在银屑病患者皮损中的表达及其在银屑病发生、发展中的作用.方法采用免疫组织化学ABC法检测22例银屑病患者皮损和15例正常对照皮肤中CD28、CD80、CD86的表达水平.结果银屑病皮损中CD28在真皮乳头、表皮基底层及棘层有较强的表达,与正常皮肤相比有显著性差异(P＜0.01);CD80、CD86在表皮颗粒层、棘层的表达相对正常皮肤均有明显的增强(P＜0.01).结论CD28、CD80、CD86在银屑病发病中起重要作用.     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响

目的：观察脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响，探讨CD44分子在原发性开角型青光眼(POAG)发病过程中可能的作用。方法：采用硫代修饰的CD44反义寡核苷酸，通过脂质体导人体外培养的人眼小梁细胞，RT—PCR、Western印迹及MTT法观察CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞CD44基因表达及粘附功能的影响。结果：RT—PCR及Western印迹结果提示：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞CD44表达。MTT法检测显示：CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附起抑制作用且呈浓度依赖性。结论：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附，粘附分子CD44可能参与了POAG发病过程。     

Crohn病肠黏膜共刺激分子CD86与可诱导共刺激因子的表达及其病理意义

目的：研究共刺激分子CD86和可诱导共刺激因子（inducible co-stimulator, ICOS）在Crohn病（Crohn disease, CD）肠黏膜的表达及其病理意义。方法：采用免疫组织化学方法检测CD组（n=30）病变黏膜及相对正常黏膜共刺激分子CD86和ICOS的表达及CD4,CD8和CD20阳性表型的淋巴细胞分布,并与正常对照组（n=20）进行比较。结果：CD组病变黏膜固有层CD86⁺和ICOS⁺淋巴单核细胞数量显著高于CD组相对正常黏膜及正常对照组（q=9.23,P<0.01和q=5.46,P<0.01）。同时,CD86及ICOS在肠上皮中亦有强表达,CD组高于对照组（H=24.93,P<0.01和H=4.66,P<0.01）,而CD组内病变黏膜与相对正常黏膜的表达差异无统计学意义。另外,CD组病变黏膜的固有层、上皮内及小血管壁CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞数量均显著高于CD组相对正常黏膜及对照组（P<0.05 或P<0.01）。结论： CD病变组织中CD86⁺和ICOS⁺淋巴单核细胞数量显著增多及肠上皮阳性率显著提高,提示共刺激分子可能参与了CD细胞免疫的异常激活过程,CD肠上皮细胞可能作为非专职性抗原呈递细胞参与了该过程。     

人胎回肠树突状细胞的形态发生分析

目的：探索人胎回肠树突状细胞（dendritic cell,DC）的形态发生规律。方法：应用免疫组织化学术和体视学方法对人胎回肠DC的出现时间、形态参数进行分析。结果：第11w时人胎回肠固有层开始出现阳性DC,其数量随胎龄的增大而逐渐增多;回肠固有层及集合淋巴小结（Peyer’s Patches,PP）阳性DC的数密度均随胎龄的增加而增大,而集合淋巴小结DC的数密度比同期固有层的要高（P〈0．05）;平均表面积随胎龄的增加呈现逐渐减小的趋势,而集合淋巴小结DC的平均表面积比固有层的要小（P〈0．001）;集合淋巴小结DC的表面积体积比比固有层的要小（P〈0．05）。结论：人胎回肠DC的数量随胎龄的增加而增多,固有层DC的形状、大小和数量均与集合淋巴小结DC有差异。     

Basigin/CD147参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞损伤机制及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Basigin/CD147)在损伤过程中发挥的作用。方法:不同浓度AA(10、20、40μg/ml)作用于人近端肾小管上皮细胞(HK-2)不同时间(24、48 h)后,MTT比色法检测细胞增殖变化;Basigin/CD147干扰质粒转染HK-2,选取AA最适浓度(20μg/ml),ELISA法检测不同时间段(24、48 h)细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;实时定量(Real-time)PCR法检测Basigin/CD147 mRNA表达;Western印迹检测Basigin/CD147、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:AA 48 h组TGF-β1含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组TGF-β1低于48 h AA组(P0.05);AA48 h组Basigin/CD147 mRNA含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147 mRNA显著低于48 h AA组(P0.05);AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达明显高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均显著低于48 h AA组(P0.01)。结论:Basigin/CD147参与介导AA所致HK-2细胞损伤过程,干扰Basigin/CD147表达可能抑制AA引起的细胞纤维化;Basigin/CD147蛋白表达调控异常可能是引起马兜铃酸肾病的重要发病机制之一。