miR－21调控TGF－β1诱导的大鼠BMSCs向肌成纤维细胞分化的机制研究

目的：在细胞水平探索miR－21在调控TGF－β1诱导的大鼠骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化中的作用。方法：全髓培养法培养原代大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第三代时用TGF－β1分组诱导培养,检测TGF－β1对大鼠BMSCs促纤维化的作用及该过程中不同浓度梯度TGF－β1诱导以及不同时间段miR－21的表达变化;通过转染miR－21 mimics（高表达）不同时间点检测其对α－SMA表达的影响。结果：TGF－β1能促进大鼠骨髓间充质干细胞向成纤维,肌成纤维细胞分化;大鼠骨髓间充质干细胞向成纤维,肌成纤维细胞分化后miR－21表达上调;上调miR－21能促进大鼠BMSCs的纤维化作用。结论：miR－21 mimics能够促进大鼠BMSCs的纤维化作用。     

机械压力对人牙周膜成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响

目的：探明机械压力与人牙周膜成纤维细胞转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）蛋白表达的关系。方法：本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加0kPa、250kPa、500kPa、1000kPa的压力,通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量。结果：加载250kPa组、500kPa组在细胞受力后各个时段TGF-β1含量没有变化;1000kPa组在细胞受力后的第12h,TGF-β1含量显著降低。结论：人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1受到机械压力的调控;在一定载荷作用下,TGF-β1的含量随着压力的增大而有所降低。     

外源性TGF-β1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的实验研究

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells)的分离、培养、扩增方法及外源性转化生长因子TGF-β1(Transforming growth factor-1)诱导BMSCs向肌成纤维细胞定向分化的可能性,为放射性诱导的颌骨纤维化提供体外理论依据。方法　取大鼠股骨的骨髓,全髓培养法分离培养骨髓间充干细胞;培养至第三代时分别用+/-TGF-β1的2组诱导培养基定向分化诱导;诱导2周后显微镜下观察细胞形态变化,Real-time PCR检测细胞的基因表达情况;细胞爬片行免疫组化鉴定α-SMA及胶原纤维的表达。结果　大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,呈梭型、纺锤型,定向诱导后TGF-β1组细胞可表现出肌成纤维细胞的特性（α-SMA+）,同时伴有COLⅠ、COLⅢ、α-SMA基因的高表达。结论　从大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,TGF-β1能定向诱导BMSCs向肌成纤维细胞方向分化,为放射诱导的颌骨纤维萎缩机制提供了体外理论依据。     

肌成纤维细胞与颌骨放射性骨坏死

颌骨放射性骨坏死（osteoradionecrosis of jaw,ORNJ）是口腔颌面-头颈部恶性肿瘤放疗术后严重的并发症。迄今为止,其病因机制尚未完全明确,最新学说认为ORNJ是由放射诱导纤维萎缩机制形成,即放疗区域的软硬组织经放疗后发生一系列变化,形成病理性纤维化组织,最后,这些纤维化组织坏死崩解,导致ORNJ发生。肌成纤维细胞在肝、肺、肾及硬皮病等纤维化发生过程中起着重要作用,是否也在ORNJ过程中起着同样重要的作用还有待证实。本文就ORNJ病因机制学说,肌成纤维细胞的特征、肌成纤维细胞与成纤维细胞的联系及区别,肌成纤维细胞与ORNJ做一综述。     

姜黄素对环孢素A诱导激活的大鼠牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3通路的抑制作用

目的：体外实验研究姜黄素（curcumin,Cur）对环孢素A（cyclosporine A,CsA）作用大鼠牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3通路的影响,为进一步探讨Cur抑制CsA所致药物性牙龈增生的发生机制提供理论依据。方法：使用CCK-8法观察0、5、10、20、30 μmol/L Cur对大鼠牙龈成纤维细胞增殖的影响, 20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用对大鼠牙龈成纤维细胞增殖的影响。实时荧光定量PCR检测20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用下,牙龈成纤维细胞中转化生长因子TGF-β1、Smad3、平滑肌肌动蛋白α-SMA和I型胶原蛋白COL-I的mRNA表达变化;蛋白免疫印迹实验检测TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA和COL-I的蛋白表达变化。细胞划痕实验观察20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA 对牙龈成纤维细胞迁移能力的影响。采用SPSS 23.0 软件包对数据进行统计学分析。结果：大鼠牙龈成纤维细胞在20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用下,细胞增殖和迁移能力明显降低;20 μmol/L Cur显著下调了牙龈成纤维细胞中TGF-β1、α-SMA 和COL-I的mRNA 表达,蛋白免疫印迹实验提示,TGF-β1、p-Smad3、α-SMA 和COL-I的表达同样显著下调。结论：Cur可能通过抑制CsA激活的牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3 信号通路,从而降低牙龈成纤维细胞增殖、迁移、平滑肌肌动蛋白和胶原分泌,改善牙龈增生。     

环孢素A与牙龈卟啉菌内毒素对人牙龈成纤维细胞增殖及TGF-β1分泌影响的研究

目的 探讨环孢素A(CsA)与牙龈卟啉菌内毒素(Pg LPS)对人牙龈成纤维细胞增殖及分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响。方法 用组织块法原代培养健康人牙龈成纤维细胞,分别用800 ng/ml CsA、100 ng/ml LPS、800 ng/ml CsA+100 ng/ml LPS作用于生长良好的第4~8代细胞,用MTT法测定作用后第2、3、5天的吸光值。ELISA法检测第3天时细胞上清中的TGF-β1分泌的变化。结果 细胞经CsA或LPS作用后形态无明显变化,CsA能促进细胞增殖和分泌TGF-β1,LPS作用与其相反,二者联合作用能明显促进细胞的生长及TGF-β1分泌,比单纯使用CsA更明显。结论 CsA与LPS在人牙龈成纤维细胞增殖和TGF-β1分泌方面可能有协同作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响,探讨bFGF在牙周组织再生中的意义.方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞,分别用质量浓度0.1、1.0、10.0ng·mL-1的bFGF刺激细胞,培养24、48、72 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA表达的变化.结果 bFGF可促进入牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA的合成,在培养24、48、72 h时,1.0 ng·mL-1组整合素β1亚单位表达均明显高于对照组;培养72 h时各实验组整合素β1亚单位表达均明显高于培养24、48 h时..结论 bFGF通过提高整合素β1亚单位mRNA的表达,促进牙周膜成纤维细胞的黏附,在牙周组织修复再生中起作用.     

压力作用时间对人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1的影响

目的:探讨压力作用不同时间对人牙周膜成纤维细胞表达TGF-β1的影响.方法:本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加1.0MPa的压力,分别持续1Omin、30min、50min、通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量.结果:加载1Omin组在细胞受力后的各个时段TGF-β1含量与对照组相比无显著性差异(P>0.05).加载30min组(0.51±0.06)和加载50min组(0.46±0.06)TGF-β1含量在细胞受力后的第12h同对照组(0.78±0.08)相比明显降低(P<0.05).结论:在一定加载时间内,人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1量随着压力作用时间的延长而有所降低.     

转化生长因子-β1和碱性成纤维细胞生长因子对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的观察转化生长因子．晶和碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。方法采用组织块培养技术进行人牙周膜成纤维细胞的体外培养，对照组采用含小牛血清的DMEM培养液，实验组分别在培养液中加入不同浓度的转化生长因子-β1或碱性成纤维细胞生长因子或两者联合加入，通过四唑盐比色法观察细胞增殖情况。结果转化生长因子-β1或碱性成纤维细胞生长因子单独作用后，人牙周膜成纤维细胞较对照组有显著的增殖，而两者联合作用后的增殖较各自单独作用时明显（P〈0．05）。结论转化生长因子-β1和碱性成纤维细胞生长因子两者联合具有促进人牙周膜成纤维细胞增殖的作用。     

afgf和TGFβ1联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化

目的建立猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化的体外诱导方案。方法联合应用aFGF和TGFβ1对体外培养的猪牙乳头细胞进行平面诱导,观察诱导后细胞的形态学变化,通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力,并采用免疫荧光染色和RT-PCR检测成牙本质细胞特异性标志物——DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达。结果诱导后部分细胞出现细长的单侧细胞突起,在矿化液培养2周后形成典型的矿化结节,并且表达DSP蛋白和DSPP mRNA。结论联合应用aFGF和TGFβ1可以诱导体外培养的猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化。     

转TGF-β1基因小鼠体内放疗敏感性初步评价

目的:针对颌骨放射性骨坏死的最新机制—放射诱导纤维萎缩机制,设计转TGF-β1基因小鼠与普通野生型小鼠的放疗实验,验证转基因小鼠的体内放疗敏感性。方法:以转TGF-β1基因小鼠和普通野生型C57BL/6J小鼠为实验动物,以16Gy为照射剂量,采用4MV直线加速器对小鼠左侧股骨进行单次照射,临床病理学检测放射辐照侧与非辐照侧股骨骨钙蛋白(OCN)、平滑肌肌动蛋白(SMA)及TGF-β1的表达,采用SAS6.0软件包对数据进行统计学处理,并对股骨及周围软组织行Masson染色,检测组织纤维化的程度。结果:放射辐照后6周,股骨病理切片HE染色显示,转基因小鼠辐照侧股骨骨细胞缺失程度(15.31%±7.96%)较野生型小鼠(3.69%±3.69%)严重;Masson染色未见明显的纤维化证据,但SMA免疫组化结果显示转基因小鼠SMA阳性细胞比例较野生型小鼠高;骨损伤指标OCN免疫组化阳性细胞比例转基因小鼠较野生型小鼠低,差异均具有显著性。结论:转基因小鼠放射辐照后,其骨损伤程度与骨纤维化的指标均比野生型小鼠高,提示TGF-β1能提高组织对放射线的敏感性。     

TGF-β1在下颌骨牵张成骨中的局部表达及作用的实验研究

目的 :探讨下颌骨牵张成骨过程中的TGF β1在局部表达及其作用。 方法 :采用免疫组化定性及ELISA定量方法检测狗下颌骨牵张成骨中不同时间点TGF β1变化水平 ,并对照观察狗下颌骨骨不连中TGF β1的变化。结果 :ELISA定量检测中可见牵张组中骨痂组织TGF β1的表达在牵张中 6d ,牵张固定 2周 ,牵张固定 8周 ,均比骨不连组及正常组高 ;免疫组化染色可见阳性着色主要定位于牵张中 6d牵张区边缘活跃的成骨细胞及新生的血管壁周围 ,牵张固定 2周牵张区中间新形成的类骨质周围的活跃成骨细胞及基质 ,牵张固定 8周牵张区中间新形成与牵张力平行的骨小梁边缘的成骨细胞及基质。结论 :对狗下颌骨进行牵张成骨的过程中 ,机械的牵张力刺激 ,可使局部牵张区TGF β1持续较高表达 ;持续较高表达的TGF β1可能参与促进了牵张区新骨的形成     

转化生长因子-β_1和碱性成纤维细胞生长因子对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的观察转化生长因子-β_1和碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。方法采用组织块培养技术进行人牙周膜成纤维细胞的体外培养,对照组采用含小牛血清的DMEM培养液,实验组分别在培养液中加入不同浓度的转化生长因子-β_1或碱性成纤维细胞生长因子或两者联合加入,通过四唑盐比色法观察细胞增殖情况。结果转化生长因子-β_1或碱性成纤维细胞生长因子单独作用后,人牙周膜成纤维细胞较对照组有显著的增殖,而两者联合作用后的增殖较各自单独作用时明显(P<0.05)。结论转化生长因子-β_1和碱性成纤维细胞生长因子两者联合具有促进人牙周膜成纤维细胞增殖的作用。     

地塞米松诱发先天性腭裂对TGF-β1、TGF-β2表达的影响

目的：探讨TGF-β1、TGF—β2在先天性腭裂发病过程中的作用。方法：在GDl2^12以磷酸地塞米松注射液(50mg／kg)经母鼠腹腔注射，对照组则以等量生理盐水代替。分别于GDl3^12、GDl4^12、GDl5^12取出胎鼠头部标本，作冠状位切片。采用免疫组化方法检测TGF-β1、TGF-β2的表达。结果：地塞米松在GDl2^12作用于孕鼠可以诱发小鼠先天性腭裂，并使胚胎腭中TGF-β1表达较同期正常组高，TGF-β2表达较正常组高，腭突上抬后的降低被抑制。结论：地塞米松诱发先天性腭裂与TGF-β1．TGF-β2的表达异常改变有关。     

白细胞介素-1β对人牙周膜成纤维细胞中MCP-1表达影响的研究

目的:探讨白细胞介素-1β(IL-1β)对人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达水平的影响。方法:体外分离培养的人牙周膜成纤维细胞随机分为实验组和对照组,实验组细胞以不同浓度IL-1β(1、5、10、25 ng/mL)作用24 h;对照组细胞则不加IL-1β作用。分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人牙周膜成纤维细胞中MCP-1 mRNA的表达;采用免疫荧光技术观察MCP-1的表达情况;采用Western blot方法检测其蛋白表达变化。结果:对照组hPDLFs中可见微弱的MCP-1表达;实验组hPDLFs经IL-1β刺激后,MCP-1在mRNA和蛋白水平表达都增强,这种调节作用在10 ng/mL IL-1β的作用浓度时最明显(P<0.05)。结论:在IL-1β介导环境下,hPDLFs中MCP-1的表达增高,而MCP-1表达增高可能是引起外周血单核细胞向局部炎症牙周组织募集的机制之一。     

转化生长因子β1对体外成牙本质细胞分化的影响

目的：观察转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF－β1）对体外培养鼠牙乳头成本本质细胞分化的影响。方法：取17d胎龄小鼠下颌第一磨牙牙胚，胰腺蛋白消化分离牙乳头，置半固态培养基培养6d，半固态培养基中加入重组转化生长因子β1和肝素，组织学观察。结果：TGF－β1加肝素可诱导牙乳头周边细胞发生极化，并分泌胸外基质，单独加入TGF－β1未见细胞极化，但基质分泌增加，结论：TGF－β1能诱导前成牙本质细胞的细胞学和功能上分化。     

氟对体外培养人牙胚TGF-β1表达影响的实验研究

目的研究氟对牙胚发育早期TGF-β1表达的影响。方法应用牙胚体外培养模型,观察低剂量(20mg/L)和中剂量(50mg/L)的氟作用于分泌前期牙胚后,TGF-β1表达情况的变化。采用图像分析仪对免疫组化染色结果进行灰度分析,并对灰度值进行统计学检验。结果在分泌前期TGF-β1的表达主要在造釉器,在20mg/L、50mg/L的氟条件下从培养第4天开始TGF-β1的表达显著降低。结论在牙胚发育早期,TGF-β1主要在上皮表达,TGF-β1可能通过旁分泌和自分泌来调节内釉上皮细胞、牙乳头细胞的分化及基质的合成与分泌,低剂量和中剂量的氟显著抑制TGF-β1的表达,提示氟可能通过抑制TGF-β1的表达而抑制了内釉上皮细胞和牙乳头细胞的分化及随后的基质合成与分泌。     

牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效

目的：探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。方法???体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）,72?h内以5μg?L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-β1诱导hPDLF向MFB转化,免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达情况。分别进行12、24、48、72、96和120?h的MFB观察,采用流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性,采用免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的α-SMA表达情况。结果??经TGF-β1诱导后α-SMA呈阳性;诱导至120?h,α-SMA仍呈阳性,72?h内其表达稳定。结论5μg?L-1终质量浓度的TGF-β1成功诱导人牙周膜细胞向MFB转化。MFB体外培养具有时效性,培养0~72?h,其状态稳定。     

热休克蛋白在白细胞介素-1β诱导人牙龈成纤维细胞损伤中的表达

目的：观察热休克蛋白（HSP）27、70和90在白细胞介素（IL）-1β诱导的人牙龈成纤维细胞（HGF）损伤过程中的表达。方法???原代培养人HGF，以蛋白质印迹技术检测不同质量浓度的IL-1β诱导后HSP27、HSP70、HSP90在HGF中的表达，运用细胞划痕实验观察HGF的体外迁移能力变化。结果???经IL-1β诱导后，HGF中HSP70和HSP90的表达量无明显变化，HSP27的表达量明显上调并随IL-1β诱导质量浓度的增加而增加。同时细胞划痕实验显示，随着HSP27表达量的增加，HGF的迁移能力明显降低。结论HSP在经IL-1β诱导的人HGF损伤过程中的表达情况各不相同，其中HSP27在IL-1β诱导的HGF炎症损伤中的表达升高，其表达量与HGF体外愈合能力呈负相关关系。HSP27在上皮炎症损伤中起着关键性的作用，但具体作用机制还有待进一步的研究。     

牙周膜肌成纤维细胞功能特点的体外研究

目的 体外实验研究牙周膜肌成纤维细胞（MFB）的作用特点。方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）,采用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导成纤维细胞向MFB转化。MFB为实验组,以hPDLFs为对照,连续培养两组细胞,按0、12、24、48、72 h共5个时间点终止培养收样。免疫细胞化学检测MFB标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况,检测实验组纤维粘连蛋白（FN）以明确细胞间接触作用情况。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测α-SMA mRNA、胶原（Col）ⅠmRNA、ColⅢ mRNA的表达情况,免疫印迹法检测α-SMA、ColⅠ蛋白的表达情况,用以比较两组细胞分泌细胞外基质情况。结果 实验组α-SMA持续稳定表达,从0 h开始表达均显著高于对照组（P<0.001）;细胞间FN阳性表达,提示MFB之间有细胞突触相互连接。从24 h开始,实验组ColⅠ、ColⅢ的表达均显著高于对照组（P<0.001）。结论 牙周膜MFB持续高表达α-SMA并且可能通过FN相互作用。MFB具有大量分泌细胞外基质的能力。