Ghrelin对脂肪间充质干细胞神经分化的影响

目的：探讨Ghrelin联合LY294002对脂肪间充质干细胞(ADSCs)神经分化的影响,并阐明其作用机制。方法：倒置相差显微镜下观察ADSCs形态表现,流式细胞术鉴定ADSCs表面抗体阳性表达率,将第4代ADSCs分为对照组(不进行干预)、LY294002组[给予40μmol·L^-1磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)通路特异抑制剂LY294002]、Ghrelin组(给予0.1μmol·L^-1Ghrelin)、Ghrelin+LY294002组(给予40μmol·L^-1LY294002+0.1μmol·L^-1Ghrelin)。倒置相差显微镜下观察各组ADSCs神经分化后的形态表现,免疫荧光染色法检测各组ADSCs中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞百分率,Western blotting法检测各组ADSCs中PI3K/Akt通路蛋白表达水平,并计算磷酸化PI3K (p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt (p-Akt)/...     

胰岛素样生长因子-1促进脂肪干细胞迁移能力的研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）对脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）迁移能力的影响,为勃起功能障碍的治疗建立实验基础。方法 采用酶消化法分离提取SD大鼠皮下脂肪干细胞,以含有10%的胎牛血清的DMEM培养基培养。通过流式细胞仪检测ADSCs表面标志物（CD34、CD44、CD45）的表达情况。采用终浓度为20ng/ml IGF-1预处理ADSCs,观察IGF-1对ADSCs迁移能力以及CXCR4蛋白的表达情况。结果 流式细胞术显示ADSCs的表型分子CD44呈阳性,CD34、CD45呈阴性。IGF-1可上调CXCR4的表达,并且促进 ADSCs向SDF-1迁移。结论 本实验成功分离培养ADSCs,IGF-1能够提高ADSCs表面CXCR4蛋白的表达,从而促进ADSCs迁移,并为下一步将IGF-1预处理的ADSCs应用于大鼠体内勃起功能障碍的治疗提供基础。     

MsrA在结直肠癌干细胞中的表达及意义

目的探讨MsrA 在结直肠癌干细胞中的表达及与结直肠癌发生、发展的关系。方法免疫磁珠分选结直肠癌细胞株
SW480细胞中CD133+/CD44+/ESA+亚群细胞,RT-PCR检测癌细胞、癌干细胞和正常大肠粘膜细胞中MsrA的表达以及MsrA过
表达对VEGF、MMP-13和CXCR4表达的影响,MTT检测过表达MsrA对结直肠癌干细胞增殖的影响。结果癌干细胞中MsrA
的表达水平明显高于癌细胞,癌细胞中MsrA的表达水平明显高于正常大肠粘膜细胞。MsrA过表达会抑制结直肠癌干细胞的
增殖以及下调VEGF、MMP-13和CXCR4的表达。结论MsrA可能通过下调VEGF、MMP-13和CXCR4的表达和抑制细胞增
殖来抑制结直肠癌的发生、发展。
     

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及其在肝内归巢

目的建立小鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）分离培养的方法,并将ADSCs移植于体内,观察其致瘤性及肝脏归巢情况。
方法取皮下脂肪用0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获取小鼠ADSCs,通过流式细胞技术检测其表面分子、细胞周期;并将
ADSCs注射到小鼠皮下观察其致瘤性,及尾静脉注射观察其肝脏的归巢。结果分离培养的细胞高表达CD29、CD44,不表达
CD34、CD45、CD11b、CD14;细胞周期显示G0/G1、S、G2/M 的细胞所占的比例分别为80.1%、7.9%、12%;ADSCs具有低免疫原
性,不表达CD40、CD80、CD86、MHCI 、MHCII以及PDL-1。在IFN-γ作用下,可轻度上调CD40、CD80以及PDL-1。ADSCs移
植后未见成瘤,且可在肝脏实质内多处定居。结论胶原酶消化、贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离出高纯度的间充质干细胞,且
ADSCs移植后能在肝内定居。
     

小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

骨髓间充质干细胞体外培养及肝向分化方案的优化

目的优化一套简便、可靠、稳定的大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及肝向分化的方案。方法采用全骨髓差速贴
壁法分离提取大鼠骨髓间充质干细胞,通过优化的1.5 h差速贴壁结合12 h首次全量换液方法,及体外改良培养方案实现细胞
高效纯化扩增。流式细胞术表面标志物检测结合成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定细胞群。采用添加bFGF、HGF、EGF等多种
生长因子的三步诱导法促使骨髓间充质干细胞向肝系分化,并进行形态学、免疫学、基因水平评估。结果分离纯化的细胞群阳
性表达CD29、CD44、CD90,阴性表达CD34、CD45,经成脂、成骨、成软骨诱导液作用后,油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色均呈阳
性。经三步法肝向诱导处理后,细胞群呈肝样细胞形态改变,表达肝脏特异性标志物ALB、AFP,肝系相关基因表达水平呈时间
依赖性逐渐上升。结论优化后的方案能够简便、可靠、稳定地获得高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,并能在特定微环境作用下
实现肝向分化。
     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的研究肝细胞生长因子（HGF）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离BMSCs,进行表面抗原表达及分化鉴定。使用Dunn chamber装置研究BMSCs的定向迁移。并且研究PI3K抑制剂LY294002对HGF诱导BMSCs迁移的影响。结果分离培养的BMSCs呈CD29、CD90、CD106阳性表达,CD34、CD45阴性表达,BMSCs可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞。Dunn chamber迁移实验显示,外槽加入不同浓度的HGF,BMSCs迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增加,50ng/ml与100ng/mlHGF均显著提高了细胞迁移效率;内外槽同时加入50ng/mlHGF,迁移速率与迁移效率均没有变化;经30μmol/LLY294002预处理1h后,HGF诱导的BMSCs的定向迁移受到抑制。结论 HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程。     

利拉鲁肽通过PI3K/Akt 和MAPK/ERK通路促进心肌微血管内皮细胞的增殖和迁移

目的研究胰高血糖素样肽-1类似物利拉鲁肽对原代大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）增殖和迁移的影响及其机制。方
法使用双酶消化法体外分离培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,差速贴壁法进行纯化,CD31和Ⅷ因子抗体进行免疫细胞化学
染色鉴定。采用不同浓度利拉鲁肽（0~1000 nmol/L）干预1 代细胞,MTT绘制细胞生长曲线,Western blot 检测利拉鲁肽对
PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的激活作用,BrdU荧光标记法和划痕实验观察药物作用下细胞增殖和迁移能力,并使用相应的通
路阻断剂LY294002 和PD98059 来进一步证实。结果体外分离原代CMECs,CD31 及Ⅷ因子免疫荧光染色示双阳性率大于
95%,MTT示细胞于种植48 h后进入对数生长期,利拉鲁肽以浓度依赖方式促进CMECs的体外增殖,100 nmol/L为其最适生长
浓度（P<0.05）。予以100 nmol/L利拉鲁肽预干预细胞24 h后,Western blot显示胞内Akt和ERK磷酸化水平与正常细胞组相比
有明显升高（P<0.05）,加入相应通路阻断剂LY294002和PD98059,其磷酸化水平相较于利拉鲁肽组明显降低（P<0.05）。BrdU
和划痕实验均说明利拉鲁肽能促进CMECs的增殖和迁移能力（P<0.05）,使用LY294002和PD98059预处理后,增殖迁移能力均
显著低于利拉鲁肽组（P<0.05）。结论利拉鲁肽是通过激活胞内PI3K/Akt和MAPK/ERK通路从而促进原代大鼠心肌微血管
内皮细胞的增殖和迁移。
     

内皮生长因子和胎盘生长因子对小鼠胎肝造血干细胞髓系分化的作用

【目的】观察VEGF(内皮生长因子)和PlGF(胎盘生长因子)对小鼠胎肝造血干细胞髓系分化的影响,并探讨其调控机制;【方法】体外培养E13胎肝造血细胞,培养造血集落CFU-GM,观察VEGF和PlGF对胎肝造血干细胞髓系分化的作用,应用Western-Blot检测不同处理条件对胎肝造血细胞Akt蛋白以及p-Akt蛋白表达水平的影响,用MTT法来评估不同浓度的LY294002(PI3K/Akt抑制剂)对胎肝造血细胞增殖的影响,通过CFU-GM观察LY294002对VEGF和PlGF调控胎肝造血作用的影响;【结果】VEGF和PlGF均可促进胎肝造血干细胞髓系分化,集落数分别为对照组的141%(P < 0.01)和123%(P < 0.05); PlGF可上调胎肝造血细胞p-Akt蛋白表达,其表达水平为对照组的143%(P < 0.05);VEGF及其与PlGF联合应用对胎肝造血细胞p-Akt蛋白表达水平无明显影响;LY294002可抑制胎肝造血细胞的增殖,并具有明显的剂量依赖关系(r = 0.9647,P < 0.01),在LY294002存在的条件下加入VEGF或PlGF,其CFU-GM产率与单独应用LY294002相比无明显差异(P > 0.05);【结论】VEGF和PlGF均能促进胎肝造血干细胞的髓系分化;PlGF可通过上调胎肝造血细胞Akt的磷酸化水平调节胎肝造血细胞的髓系分化;LY294002可通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制VEGF和PlGF对胎肝造血干祖细胞髓系分化的调控作用;     

辛伐他汀对骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能影响的研究

目的:细胞水平观察不同浓度的辛伐他汀对骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及旁分泌功能的影响并探讨其可能的机制?方法:采用全骨髓贴壁培养法培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞,取3代对数生长期细胞,无血清培养12 h,不同剂量的辛伐他汀(0?0.001?0.010?0.100?1.000 ?滋mol/L)与MSCs共培养24 h,采用CCK-8试剂盒检测各浓度组BMSCs增殖情况,通过半定量RT-PCR检测不同浓度的辛伐他汀诱导BMSCs中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的mRNA表达?采用Western blot检测PAkt?AKt的表达?结果:辛伐他汀在一定浓度范围内(0.001~0.100 ?滋mol/L)显著提高了BMSCs增殖和VEGF和HGF的mRNA表达水平(与对照组比较,P < 0.01)?辛伐他汀浓度在0.010 ?滋mol/L时对BMSCs的增殖和分泌功能的影响最为显著,随着药物浓度的加大,BMSCs的上述功能呈下降趋势?与对照组比较,1.000 ?滋mol/L辛伐他汀对BMSCs无显著的促增殖作用,但却明显上调了VEGF和HGF mRNA的表达?0.010 ?滋mol/L辛伐他汀组pAKt表达及pAKt/AKt比值显著高于对照组(P < 0.01)?结论:辛伐他汀在一定浓度范围内对骨髓间充质干细胞的增殖及分泌功能有促进作用,其机制可能与Akt信号通路有关?     

“看似正常者”外周血单个核细胞炎症因子的表达变化

目的观察“看似正常者”体内炎症因子表达是否已经发生变化。方法按照JUPITER研究的入选标准和排除标准,从西安
交通大学第一附属医院体检中心选取正常对照和“看似正常者”各14例,采集晨空腹静脉血5 ml后,密度梯度离心法提取外周
血单个核细胞,提取RNA并进行real-time PCR检测各炎症因子的表达。同时留取血浆行IL-6和TNF-α的ELISA检测。结果
“看似正常者”促炎因子TNF-α mRNA表达增高,血浆浓度升高;促炎因子IL-6 mRNA表达及血浆浓度,MCP-1 mRNA表达仅
表现出轻微升高趋势;MCPIP由MCP-1诱导产生,mRNA表达升高;抗炎因子IL-10 mRNA表达降低。结论“看似正常者”体
内炎症因子表达已发生变化,促炎因子表达相对升高,抗炎因子表达相对降低。
     

同型半胱氨酸调控脂肪组织PDK1的表达与糖代谢的关系

目的研究同型半胱氨酸对脂肪组织PDK1表达的影响,探讨PDK1是否抑制p-Akt（Thr-308）,影响PI3K/Akt信号通路,降
低脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用。方法40只6周龄小鼠（n=10只）随机分为：空腹正常对照组;进食正常对照组;空腹高同型
半胱氨酸血症组和进食高同型半胱氨酸血症组。利用小鼠饮用水中加入1.5%的甲硫氨酸饲养3个月制作高同型半胱氨酸血症
的动物模型。测定各组血糖和血胰岛素。利用RT-PCR 检测PDK1 和Akt 的mRNA 表达水平,Western blotting 检测PDK1、
p-Akt（Thr-308）和Akt的表达。结果与空腹和进食对照组相比,空腹和进食高同型半胱氨酸组小鼠血糖和血胰岛素的含量增加
（P<0.05）,PDK1的mRNA表达水平下调,PDK1、p-Akt（Thr-308）蛋白质表达降低（P<0.05）,而Akt在mRNA和蛋白质的表达水
平差异无统计学意义。结论在脂肪组织中,同型半胱氨酸可能通过调控PDK1表达的下调,影响PI3K/Akt信号通路,导致对葡
萄糖的摄取能力降低。这可能是同型半胱氨酸引起糖代谢紊乱的原因之一。
     

人脂肪干细胞分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用

目的：分离培养脂肪干细胞（ADSCs）以探讨其分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用.方法：从人腹部脂肪组织中分离并培养ADSCs3d后,ELISA法测定ADSCs分泌血管内皮生长因子（VEGF）,肝细胞生长因子（HGF）含量;收集ADSCs培养液（ADSC-CM）作用于HaCaT细胞株.采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定HaCaT细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果：培养获得ADSCs细胞3d后,培养液中VEGF、HGF含量分别为（287±47）,（577±85）ng/L.MTT实验30%ADSC-CM组、50%ADSC-CM组的A490nm值分别高于对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）.实验组HaCaT细胞凋亡率明显低于对照组（P〈0.05）.与对照组相比较,实验组HaCaT细胞迁移距离36,48h时间点显著增大（P〈0.05或P〈0.01）.结论：ADSCs能分泌细胞因子且对HaCaT细胞具有促增殖、迁移和抑制凋亡作用.     

沉默Sam68对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响及其机制

目的探讨Sam68基因对鼻咽癌5-8F细胞增殖能力的影响及可能的分子机制。方法通过靶向沉默鼻咽癌5-8F细胞内源
性Sam68基因,研究细胞增殖能力的变化情况,并采用qRT-PCR和Western blotting实验方法检测Sam68、细胞周期相关蛋白及
其上游分子的表达情况。结果转染Sam68靶向siRNA的5-8F细胞中,Sam68蛋白和mRNA表达水平均明显降低。MTT、细胞
周期实验证实干扰Sam68后5-8F细胞的增殖能力受到抑制;Western blotting检测结果显示细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达明
显下调,p27 表达上调,同时p-FOXO3a、p-Akt 和p-GSK-3β的表达明显下调,而总FOXO3a、Akt 和GSK-3β的表达则无明显变
化。结论Sam68可能通过激活Akt/FOXO3a信号通路对细胞增殖的相关分子进行调控,进而影响鼻咽癌细胞的增殖能力。
     

Exendin-4对肿瘤坏死因子-α诱导的单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的观察exendin-4对大鼠肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、纤维连接蛋白（FN）表达的影响。方法试验分
组：对照组、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）组（10 ng/ml）、TNF-α（10 ng/ml）+E1 组（1 nmol/L exendin-4）、TNF-α（10 ng/ml）+E5 组
（5 nmol/L exendin-4）、TNF-α（10 ng/ml）+E10组（10 nmol/L exendin-4）。收集24 h细胞,提取RNA,采用实时荧光定量检测细
胞内MCP-1 mRNA的表达;分别在24、48 h 收集各组细胞培养上清液,采用ELISA检测培养细胞上清中MCP-1、FN的浓度。
结果孵育24 h 时,TNF-α组MCP-1 mRNA和细胞培养上清MCP-1、FN表达较对照组明显增加（P<0.01）;与TNF-α组比较,
TNF-α+E5组、TNF-α+E10组细胞内MCP-1 mRNA和培养上清内MCP-1、FN含量均明显降低;孵育48 h时,TNF-α组细胞培养
上清MCP-1、FN表达较对照组明显增加（P<0.01）;与TNF-α组比较,TNF-α+E1组、TNF-α+E5组、TNF-α+E10组细胞培养上清
内MCP-1、FN含量均明显降低;并且随着时间的延长和exendin-4浓度的增加,培养上清内MCP-1、FN含量降低更加明显。结
论Exendin-4可明显抑制TNF-α诱导的系膜细胞MCP-1 mRNA的表达,并以剂量和时间依赖的方式抑制TNF-α诱导的系膜细
胞培养上清内MCP-1、FN的含量,提示exendin-4可能会对肾脏具有一定保护作用。
     

人参皂苷Rg3抑制急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α及VEGF的表达及其机制探讨

目的探讨人参皂苷Rg3对急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α及VEGF表达的作用及其可能的机制。方法培养正常人及急性白血病患者的骨髓基质细胞,MTT法检测人参皂苷Rg3对正常及急性白血病骨髓基质细胞增殖的抑制作用;RT-PCR检测人参皂苷Rg3处理前后急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α及VEGF mRNA表达的变化;Western blot、免疫荧光检测人参皂苷Rg3处理前后急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α、VEGF、p-Akt、p-ERK蛋白表达的变化。结果人参皂苷Rg3对骨髓基质细胞增殖抑制的最适作用时间为24h,最适作用浓度为40μg/ml;处理24h后,急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α、VEGF mRNA表达及蛋白表达均明显减少(P<0.05);p-Akt及p-ERK蛋白表达亦较处理前明显减少(P<0.05)。结论人参皂苷Rg3可明显抑制急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白水平的表达,同时可抑制与血管形成密切相关的MAPK、PI3K/Akt途径中Akt、ERK蛋白的磷酸化,提示人参皂苷Rg3可能通过阻断PI3K/Akt、MAPK信号途径抑制急性白血病骨髓的血管生成。     

硫利达嗪诱导SW480细胞凋亡的机制

目的研究硫利达嗪对结肠癌SW480细胞增殖及凋亡的影响。方法应用5~30 μmol/L硫利达嗪处理SW480细胞,MTT
法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342 细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期;
RT-qPCR分析PDCD4、c-MYC、BCL2、CCND1、CASPASE3、PARP1、CDK4、EIF4A基因表达水平;Western blotting 检测AKT、
p-AKT、PDCD4蛋白表达水平。结果MTT结果表明硫利达嗪抑制SW480细胞的增殖,硫利达嗪处理细胞后出现核固缩、染色
质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征;流式检测表明硫利达嗪诱导G0/G1期阻滞,细胞凋亡增加。RT-PCR结果表明硫利达
嗪处理细胞后PDCD4表达上调,CCND1、CDK4、c-MYC、BCL2、CASPASE3、PARP1和EIF4A表达下调。免疫印迹分析结果显
示PDCD4蛋白表达上调,p-AKT蛋白表达下调。结论硫利达嗪能够抑制人结肠癌SW480细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制
可能与抑制PI3K/AKT信号通路导致PDCD4表达水平升高有关。
     

微小RNA Let-7/Lin28调节环与鼻咽癌血管新生的关系研究

目的  探讨微小RNA Let-7/Lin28调节环与鼻咽癌促血管生成因子的关系,并研究这一关系的作用机制。方法  选取2012年4月-2014年在湖北省襄阳市中心医院耳鼻喉科就诊的鼻咽癌患者54例。另选取同期40例慢性鼻炎患者和32例健康者作为对照组。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测组织中Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA相对表达量,ELISA检测血清中血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）及内皮抑素（ES）水平,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表达情况,分析miRNA Let-7a/Lin28调节环与血管新生因子的关系。结果  RT-PCR检测发现鼻咽癌患者Lin28A miRNA和Lin28B miRNA相对表达量均高于慢性鼻炎组和健康对照组（P <0.05）,而Let-7a miRNA的相对表达量低于上述两组（P <0.05）;ELISA检测结果发现鼻咽癌患者组VEGF、bGFG、ES表达量均高于慢性鼻炎组和健康对照组（P <0.05）;Western blot检测发现鼻咽癌患者组病理组织中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表达量高于慢性鼻炎患者组和健康对照组（P <0.05）,而p-PTEN表达量低于上述两组（P <0.05）;相关性分析发现,Lin28A、Lin28B miRNA与VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相关（P <0.05）,Let-7a miRNA与VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈负相关（P <0.05）。结论  miRNA Lin28/Let-7调节环与血管新生有定的关联性,而这一关联性可能与激活Ras/PI3K/PTEN/Akt通路有关。