轮状病毒培养纯化及重组子代分析

人轮状病毒Wa和Hu7株细胞培养条件中,胰蛋白酶处理和旋转培养,在病毒增殖和细胞病变生成过程中起关键作用。通过对一株人轮状病毒FH4232株与猴轮状病毒SA11株的混合感染株的体外培养和空斑纯化,发现子代克隆中有2株FH4232与SA11株生成的重组子代。重组子代病毒株的第5、11条泳带来自亲代FH42321株,其余多条则来自亲代SA11株。体外轮状病毒重组子代的发现对研究其基因重组变异有重要意义,而且为疫苗制备和应用提供有效途径。     

人轮状病毒持续感染细胞中病毒增殖条件的研究

本文研究了人轮状病毒持续感染细胞中病毒增殖的条件,发现较为适宜的培养温度为37℃左右,在培养基中添加适量胰岛素、氢化可的松和维生素B_6等可显著促进轮状病毒的增殖,而新生牛血清以及干扰素诱生抑制剂——放线菌素D则对病毒增殖无明显影响.     

Characterization and E protein expression of mutant strains during persistent infection of KN73 cells with Japanese encephalitis virus

目的：研究乙脑病毒变异的特性以及变异株性状与E蛋白表达的关系。方法：通过应用乙脑病毒的野生株以及人肝癌细胞KN73建立持续感染模型。采用胰蛋白酶消化技术每周进行细胞传代。经反复冻融收集持续感染细胞内病毒。采用BHK细胞空斑实验方法进行病理滴定。采用间接免疫荧光方法检测E和NS3蛋白抗原。采用Western印迹杂交检测E和NS3蛋白的表达。结果：感染早期（24小时-36小时）野生株感染的KN73细胞的培养液中病毒滴度为10^6PFU/ml。在感染后期（3年）滴度为10^3-4PFU/ml。病毒重叠感染实验发现在急性重叠感染野生株的持续感染KN73细胞中培养液的病毒滴度比在同一时相急性感染的正常KN73细胞培养液的滴度要低得多。间接免疫荧光检测表明,在持续感染的KN73细胞中病毒抗原的存在低于急性感染的KN73细胞。Western印迹杂交检测表明,E、NS3蛋白的分子量分别为53KD和73KD。在持续感染的KN73细胞中NS3蛋白的表达很稳定,但E蛋白的表达却明显受抑。结论：从持续感染的KN73细胞中获得的病毒具有缺陷干扰病毒的一些特性且参与持续感染,其毒力和增殖均低于亲本病毒。这些变异可能与E蛋白表达减少有关。     

引起成人腹泻的新轮状病毒在原代人胚肾细胞上的培养和传代

目的 探讨用细胞培养系统在体外培养新轮状病毒（RV）。方法 含新RV的病人粪便标本经高浓度胰蛋白酶（100μg/ml)37℃作用1h,接种于原代人胚肾（PHEK）细胞,37℃吸附1h后,补加无血清含胰蛋白酶（100μg/ml）的DMEM,37℃转鼓培养3d,收获细胞培养液,冻融1次,作为下一代培养的接种物,培养传代。用聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫荧光（IF）、电镜（EM）、免疫电镜（IEM）等方法对细胞培养液进行病毒核酸、抗原及形态检查。结果 从10份粪便标本中培养分离到1株病毒,定名为J19。该病毒在PHEK细胞上稳定培养传代（28代）,其病毒核酸（dsRNA）电泳图型与初始用于接种细胞的粪便标本中的dsRNA电泳图形完全一致,而与A、B、C组RV dsRNA电泳图型明显不同。J19株感染的细胞与病人恢复期血清呈IF阳性反应,与成人腹泻轮状病毒（ADRTV）腹泻病人恢复期血清、兔抗A组RV和兔抗ADRV血清均为IF阻性;EM和IEM在该病毒的细胞培养液中观察到,在形态上与初始接种物中病毒一样的轮状病毒颗粒,而且可被新RV腹泻病人恢复期血清凝集,结论 成功地从含新RV的成人腹泻粪便标本上分离培养出1株轮状病毒－－J19,并能在细胞稳定传代。J19株不属于A、B、C组RV,而是一种新RV。关于新RV在细胞上培养传代,本文是第一次报告。     

黄芪对体外B组柯萨奇病毒持续感染抑制作用的研究

目的：探讨黄芪水提液对持续感染细胞模型中CVB3、CVB5的作用。方法：不同浓度黄芪水提液作用于持续感染CVB3、CVB5的ECV304细胞模型，原位ELISA，细胞保护试验，病毒滴度测定了解持续感染细胞模型中CVB3、CVB5增殖情况的改变。结果：经黄芪作用后，CVB3-ECV304和CVB5-ECV304持续感染细胞模型病毒抗原表达减少，细胞模型培养上清液中病毒含量减少，致Vero细胞病变程度减轻。结论：黄芪可体外抑制持续感染细胞模型中CVB3、CVB5的增殖。     

动物肠道溶瘤病毒体外感染肺腺癌细胞超微结构观察

本文用电镜观察鹿、牛肠道病毒Ecco-18及MZ-468株体外感染人肺腺癌细胞LGC-7910,可见二株病毒能在人肺腺腺癌细胞中增殖,并引起细胞变性坏死。此结果为该二株病毒用于治疗人癌提供了可能性。     

金雀黄素对子宫内膜癌细胞体外生长影响的研究

目的 研究金雀黄素抑制人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞体外增殖作用机理.方法 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞进行体外培养,用MTT法检测细胞增殖作用,用流式细胞仪检测细胞周期情况.结果 金雀黄素能明显抑制Ishikawa细胞体外增殖,并且随着药物浓度增加其抑制作用更加明显,呈剂量依赖性,金雀黄素对Ishikawa细胞体外增殖抑制最显著的时间是加药48 h,加药后72 h的抑制率虽然有所上升,但不甚明显,加药96h其抑制率稍低,加药后120 h其抑制率明显降低;金雀黄素处理的Ishikawa细胞明显阻滞于G2-M期.结论 金雀黄素通过阻滞细胞于G2-M期,从而抑制Ishikawa细胞体外增殖.     

轮状病毒细胞培养的若干研究

轮状病毒(RV)细胞培养问题迄今尚未完全解决。为此,我们从筛选RV 敏感细胞和改变 RV 培养条件入手研究,发现恒河猴胚肾传代细胞 Frhk-4对不同血清型的人和动物 RV 标准株敏感,感染后有明显 CPE。将刀豆素 A(Con A)加入营养液中,在细胞生长过程中预处理细胞时,能显著增加 Wa 株的空斑数目和增殖滴度,加速 CPE 的发展,而用 Con A 预处理病毒、加入病毒接种液或加入凝胶覆盖物时,则明显抑制 Wa 株的空斑形成。此外,我们发现,Wa 株经细胞培养多次传代后,有变异株产生,所分离到的3个克隆株的基因图谱与原始 Wa 株有明显差异。对此,国内外均未见报道。     

染料木素对人胃癌MGC-803细胞增殖及PKA活性的影响

目的 本文通过研究染料木素（Gen）对体外培养MGC-803细胞增殖以及PKA活性的影响,探讨Gen抑制MGC-803细胞系增殖的分子机制.方法 光镜下观察经Gen处理后人胃癌MGC-803细胞形态学改变;应用MTT法检测Gen对体外培养的人胃癌MGC-803细胞增殖影响;PepTag法检测Gen对MGC-803细胞PKA活性的调节.结果 与空白对照组比较,经Gen处理后MGC-803细胞外形呈不规则状、细胞间隙增大、折光性差;MTT实验发现Gen能够抑制体外培养的MGC-803细胞增殖,并且抑制作用呈现时间及浓度依赖性;浓度为40 μg/mL的Gen可以显著上调MGC-803细胞的PKA活性（P＜0.01）.结论 Gen对人胃癌细胞系MGC-803细胞的增殖有抑制作用,上调PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的机制之一.     

金雀黄素和大豆黄酮对人乳腺癌细胞系体外增殖作用的影响

应用体外细胞培养和MTT比色法.研究大豆异黄酮类化合物金雀黄素和大豆黄酮对人乳腺癌细胞系体外增殖作用的影响.结果大豆异黄酮类化合物能明显抑制人乳腺癌细胞系MCF-7 和MDA-MB-231的体外增殖,且呈明显的剂量依赖性和时间依赖性.金雀黄素和大豆黄酮对MDA-MB-231细胞的抑制作用不如MCF-7明显,而金雀黄素的抑制作用优于大豆黄酮.说明金雀黄素和大豆黄酮对乳腺癌细胞系体外增殖具有明显的抑制作用,为进一步阐明其防癌抑癌作用机理奠定了实验基础.     

The role of trypsin in plaque formation by simian rotavirus SA-11

The role of trypsin in plaque production by simian rotavirus SA-11 monolayers of MA-104 cells are investigated. Initial trypsin treatment of the virus alone or its presence only during the early phases of virus-cell interaction was found to be insufficient for plaque production by the virus. Presence of trypsin (5 microgram/mL) in the agar overlay throughout the five day incubation period was essential for the optimal development of the virus plaques. Production of plaques by the incorporation of trypsin in the overlay was not due to the enzymatic degradation of any plaque-inhibitors in the agar used. Experiments using high (4 PFU/cell) and low (35 PFU/10(6) cells) multiplicities of infection suggest that trypsin added to fluid maintenance medium facilitates the cell-to-cell spread of progeny virus particles. Therefore, the enzyme incorporated in the agar overlay appears to play a similar role thereby assisting in the formation of SA-11 plaques.     

Proteolytic enzymes and rotavirus SA-11 plaque formation

In addition to trypsin, eight other proteolytic enzyme preparations were tested for their ability to assist simian rotavirus SA-11 plaque formation in MA-104 cells. When incorporated in the overlay (minimal essential medium and 0.7% Ionagar No. 2) in the concentrations per mL indicated, alpha-chymotrypsin (10 micrograms), elastase (0.5 micrograms), subtilisin (0.5 micrograms), pronase (2.5 micrograms) and pancreatin (25 micrograms) were as efficient as trypsin (5 micrograms) in helping SA-11 produce 3-4 mm diameter plaques after five days of incubation at 37 degrees C. No plaques were produced when pepsin (25 micrograms), papain (10 micrograms) or thermolysin (10 micrograms) was added to the overlay. Addition of soybean trypsin inhibitor to alpha-chymotrypsin-, pronase- or pancreatin-containing overlays completely inhibited virus plaque production. A similar effect was not seen with elastase or subtilisin.     

Lack of in vitro interference between SA-11 rotavirus and attenuated poliovirus type 1.

To determine if rotavirus interferes with the multiplication of poliovirus, and hence the efficiency of the polio vaccine, the effect of timing and concentration of Simian rotavirus (SSA-11) on polio-1 infection in MA-104 cells was studied in vitro by evaluating the cytopathic effect, the reduction of the infectivity titers and the visualization of viral particles by electron microscopy. We found that poliovirus 1 was able to replicate when the challenge dose was administered within the first 8 h following SA-11 infection and with titers ten times lower than those of rotavirus. Hence, non-interference effect was observed in this in vitro model.     

轮状病毒感染致乳鼠肠外损害的实验研究

目的 探讨轮状病毒(rotavirus,RV)感染引起肠外脏器损害情况及其发病机制.方法 用MA104细胞培养猴RV sA-11经口感染生后7 d昆明小鼠乳鼠,实验组每只经口接种0.1 ml培养物冻融液(3.75×107pfu/ml),对照组经口接种0.1 ml正常对照细胞冻融液.接种后3 d处死乳鼠,光镜下观察脑、肺、心、肝、胰和肾组织病理改变,电镜下观察心肌细胞超微结构改变;以免疫荧光方法检测各器官RV抗原分布情况;以Phalloidin-TRITC对丝状肌动蛋白染色并经软件(Imageproplus5.1,IPP5.1)测量分析以观察心肌组织丝状肌动蛋白含量有无改变;以原位凋亡细胞检测方法检测肝细胞和心肌细胞凋亡情况;以巢式RT-PCR方法检测各器官内RV RNA分布情况.结果 在光镜下脑、肺、胰和肾组织未见明显病变,但可见心肌间质水肿,心肌细胞浊肿,肝细胞空泡变性;电镜下心肌细胞肌丝溶解,线粒体内室扩张,滑面内质网扩张,核周间隙增宽;Phalloidin-TRITC染色未见心肌组织丝状肌动蛋白含量改变;除脑组织外其他器官内见到RV抗原分布,而各器官内均有RV-RNA分布;肝细胞凋亡增加,而心肌细胞未见凋亡.结论 RV可播散到肠外脏器并引起病理损害,但总体上程度较轻.病毒感染导致丝状肌动蛋白解聚及细胞骨架损害、诱导细胞凋亡不仅是肠黏膜损伤的机制,同时也是肠外损害的机制.     

番石榴叶水煎液及其总黄酮抗轮状病毒作用研究

目的：观察番石榴叶水煎液及其总黄酮抗轮状病毒作用,为寻求新的抗轮状病毒药物提供实验依据。方法：提取番石榴叶水煎液及其有效成分黄酮,用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测番石榴叶提取物作用于MA104细胞后的细胞存活率,求出其半数细胞毒性浓度（median toxic concentration,TC50）后,给予低于TC50不同浓度的药物对轮状病毒感染细胞进行干预,检测其对病毒感染细胞存活的影响,以确定番石榴叶水煎液及其总黄酮体外抗轮状病毒的作用。结果：番石榴叶水煎液及黄酮均有预防轮状病毒感染的作用,其用于预防时治疗指数（therapeutic index,TI）分别4．65和1．83。同时亦对病毒感染的MA104细胞具有治疗作用,两者用于治疗轮状病毒感染时T1分别为2．98和3．07。随着药物浓度的增加,治疗和预防时病毒抑制率显著升高,呈量效关系。结论：番石榴叶水煎液及其总黄酮具有良好的体外抗轮状病毒的作用。     

普通轮状病毒Wa的空斑实验

用胰酶预先处理轮状病毒,琼脂层中加入二异氨乙基葡聚糖时,Wa能在MA_(104)细胞上形成空斑。与猴的轮状病毒SA_(11)相比,两者空斑的形态和大小相似,但Wa形成空斑要求条件较高,且空斑出现较迟。     

轮状病毒分离与培养方法的建立

①目的探讨建立轮状病毒的分离与培养方法。②方法粪便标本经ELISA检测，离心后接种于MA104细胞株，观察病毒致细胞病变效应。提取病毒RNA．琼脂糖电泳检测。③结果经离心、双抗处理后，轮状病毒可在MA104细胞中克隆增殖．并引起细胞病变（CPE）。④结论MA104作为容纳细胞，可用于轮状病毒的大量扩增。     

内蒙古地区蒙古族妇女子宫颈鳞癌组织中人乳头瘤病毒的基因分型

目的回顾性分析内蒙古地区蒙古族妇女子宫颈鳞癌标本中人乳头瘤病毒(HPV)感染率与型别分布,为蒙古族妇女子宫颈癌的预防提供相关信息。方法运用线形探针反向杂交技术检测标本中的HPV基因型别。结果63例蒙古族子宫颈癌患者的子宫颈鳞癌蜡块组织标本中HPV总感染率为93·7%,HPV阳性率在不同临床分期与不同病理组织学分级的子宫颈鳞癌组织间差异无显著性(P>0·05),HPV16亚型在不同年龄分组中的感染率差异无显著性(P>0·05)。感染率居前5位的是:HPV16(69·8%)、HPV18(4·8%)、HPV31(4·8%)、HPV39(4·8%)和HPV52(3·2%)。结论HPV感染与蒙古族妇女患子宫颈鳞癌密切相关,HPV16型是蒙古族妇女子宫颈鳞癌的主要感染型别,HPV18、31、39型位居其后。HPV感染对蒙古族妇女子宫颈鳞癌的进展以及组织分化无影响。     

孕中期弓形虫感染对孕鼠血红系列及血清铁蛋白的影响

目的 探讨弓形虫感染对孕中期孕鼠血红系列及血清铁蛋白含量的影响.方法 孕中期BALB/c鼠随机分为染虫组和对照组,染虫组经腹腔接种纯化弓形虫速殖子100个/0.2 ml,对照组腹腔注射0.2 ml PBS.在孕10,12,14,16,18 d,摘眼球取血,进行孕鼠血红系列分析和血清铁蛋白(Ferr)含量测定.结果 ①染虫孕鼠全血红细胞(RBC)计数、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)与对照组均无差异(P＞0.05).②染虫孕鼠红细胞体积分布宽度(RDW)比对照组轻微增加,但无统计学意义(P＞0.05).③染虫孕鼠红细胞平均体积(MCV)在孕10,14 d与对照组比较无统计学差异(P＞0.05),在孕12,16,18 d显著减小(P＜0.05).④染虫孕鼠红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)在孕14,16,18 d显著降低(P＜0.01).⑤染虫孕鼠血清铁蛋白含量在孕16,18 d显著低于对照组(P＜0.01).结论 弓形虫感染可引起孕鼠MCV、MCHC及血清Ferr含量下降,孕鼠有轻度低铁血症.