骨形态蛋白2 siRNA靶向抑制对体外培养人脐动脉平滑肌细胞成骨样分化及钙化的影响

目的 研究骨形态蛋白2（BMP2）小分子干扰RNA（siRNA）靶向抑制对人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）由白介素6（IL-6）诱导刺激的成骨样分化和细胞层钙化的影响。方法 以体外培养的原代HUASMC作为实验对象。建立RNA干扰（RNAi）实验平台,通过FAM标记阴性对照siRNA优化转染条件;将BMP2基因的4条候选siRNA分别转染原代HUASMC,Real-Time PCR检测BMP2 mRNA表达,筛选有效抑制siRNA。将复苏的原代HUASMC分为siRNA转染组（转染有效抑制siRNA）和模拟转染组（对照组,不转染siRNA）,两组均加入重组人IL-6（rhIL-6）(10 ng/mL)刺激孵育,Real-Time PCR检测刺激孵育12、48 h时点成骨样转化相关基因BMP2、骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨钙素（OC）和骨桥蛋白（OPN）mRNA表达。将复苏的原代HUASMC分为siRNA转染组、对照组和空白组(不予rhIL-6刺激孵育,其余处理与对照组相同),siRNA转染组和对照组均加入rhIL-6（50 ng/mL）刺激孵育,甲氧－酚酞络合酮法检测rhIL-6刺激孵育前及孵育后2、4 d时点各组HUASMC细胞层钙盐含量,以总蛋白含量校正。结果 成功建立合适的RNAi实验平台。10 ng/mL rhIL-6刺激孵育后12 h时点,siRNA转染组HUASMC BMP2和BAP mRNA表达明显低于对照组（P<0.05）;刺激孵育后48 h时点,siRNA转染组OC和OPN mRNA表达显著低于对照组（P<0.05）。加入50 ng/mL rhIL-6刺激孵育前,siRNA转染组、对照组和空白组HUASMC细胞层钙盐含量比较差异无统计学意义（P>0.05）;在siRNA转染组,50 ng/mL rhIL-6刺激孵育后2 、4 d时点的细胞层钙盐含量均明显低于对照组（P<0.05）,刺激孵育后2 d时点的细胞层钙盐含量明显高于空白组（P<0.05）。结论 体外培养的原代HUASMC能够实现BMP2基因的siRNA靶向抑制,能显著抑制由IL-6诱导刺激的成骨样分化和钙化。     

骨形态发生蛋白4对反应性星形胶质细胞增殖的影响

[摘要]　目的　利用成年SD大鼠脊髓损伤原代培养的反应性星形胶质细胞模型,探讨骨形态发生蛋白4（BMP4）与反应性星形胶质细胞增殖之间的关系。　方法　建立成年SD大鼠脊髓损伤原代培养的反应性星形胶质细胞模型,用BMP4（10 ng/mL）和BMP4的拮抗剂——Noggin（100 ng/mL）处置反应性星形胶质细胞48 h,通过免疫荧光的方法检测各实验组（正常对照组、BMP4组、Noggin组及BMP4+Noggin组）中星形胶质细胞的标记分子vimentin Brdu,观察BMP4对反应性星形胶质细胞增殖的影响。　结果　BMP4组中Brdu阳性细胞占星形胶质细胞的平均百分比为14.03 %,明显高于正常对照组(3.10%),P<0.01;而BMP4+Noggin组中Brdu阳性细胞数占星形胶质细胞的平均百分比为3.81%,明显低于BMP4组（P<0.01）。　结论　在成年SD大鼠脊髓损伤原代培养的反应性星形胶质细胞模型中,BMP4可刺激反应性星形胶质细胞的增殖。     

二甲双胍抑制大鼠胆管成纤维细胞胶原生成的分子信号机制

目的 探讨二甲双胍是否通过活化腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激的大鼠胆管成纤维细胞胶原生成并揭示其分子信号机制。方法 取雌雄各半的SD大鼠共50只（体质量150~200 g）,CO2窒息法处死后,无菌条件下分离并培养大鼠胆管成纤维细胞,倒置显微镜观察所培养的细胞,发现不同体质量及性别的大鼠所获取的细胞形态及活性无差异。采用随机数字表法进行随机分组,分别设置对照组、TGF-β1组、Smad3 siRNA干预组、结缔组织生长因子（CTGF）siRNA干预组、二甲双胍干预组、Compound C干预组,每组3个样本。设置对照组：大鼠胆管成纤维细胞正常培养;TGF-β1组：10 ng/mL TGF-β1孵育细胞;Smad3 siRNA干预组：Smad3 siRNA转染24 h后＋10 ng/mL TGF-β1孵育细胞;CTGF siRNA干预组：CTGF siRNA 转染 24 h 后＋10 ng/mL TGF-β1 孵育细胞;二甲双胍干预组：10 mmol/L 二甲双胍＋10 ng/mL TGF-β1 孵育细胞;Compound C干预组：10 μmol/L Compound C＋10 mmol/L二甲双胍＋10 ng/mL TGF-β1孵育细胞。以TGF-β1刺激大鼠胆管成纤维细胞分泌胶原,以Smad3 siRNA或CTGF siRNA转染细胞以抑制Smad3或CTGF蛋白的表达,以二甲双胍孵育细胞以激活AMPK,以Compound C预处理细胞以抑制AMPK的活性。采用ELISA或Western-blot的方法检测CTGF、胶原（I Col I）蛋白水平;Western-blot的方法检测p-Smad3/t-Smad3、p-AMPK/t-AMPK、CTGF水平。结果 TGF-β1以时间和剂量依赖的方式刺激胆管成纤维细胞胶原I生成,二甲双胍激活的AMPK也剂量依赖性抑制TGF-β1诱导的胶原I生成;AMPK抑制剂Compound C预孵育细胞,可显著逆转二甲双胍激活的AMPK抑制胶原I生成的作用（P<0.01）。进一步发现,二甲双胍激活的AMPK对TGF-β1刺激的Smad3磷酸化无抑制作用,却可抑制其下游的CTGF蛋白表达（P<0.01）及胶原I生成（P<0.01）,而AMPK抑制剂可逆转二甲双胍对CTGF及胶原I的上述作用。结论 二甲双胍通过激活AMPK抑制TGF-β1/Smad3信号通路诱导的CTGF蛋白表达,进而抑制胆管成纤维细胞胶原I生成。     

Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的影响。方法：以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性变化、钙盐沉积、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨桥素（osteopontin,OPN）变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果：BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性（F=1 467.21,P=0.000）、钙盐沉积、OC（F=32.95,P=0.000）和OPN（F=127.23,P=0.000）蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论：Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。     

Smad信号通路在骨形成蛋白9促进牙囊干细胞成骨向分化中的研究

目的 探索骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)在诱导大鼠牙囊干细胞(rat dental follicle stem cells,rDFCs)成骨向分化过程中的Smad信号通路调控机制.方法 重组腺病毒骨形成蛋白9 (recombinant adenoviruses expressing BMP9,Ad-BMP9)转染纯化的第3代rDFCs后,Realtime qPCR、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测观察BMP9调节rDFCs早期及中晚期成骨能力,茜素红S染色检测钙盐沉积,Western blot检测Smad1/5/8磷酸化水平.结果 BMP9促进rDFCs成骨因子表达:成骨转录因子Runx2、成骨细胞特异性转录因子Osterix、ALP及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在BMP9刺激组较空白组均明显升高(P＜0.05),钙盐沉积及钙结节形成也明显多于空白组,且BMP9促进了Smad1/5/8蛋白磷酸化水平升高.结论 BMP9通过激活Smad信号通路,提高Smad1/5/8蛋白磷酸化水平从而促进早中晚期成骨因子及碱性磷酸酶表达,促进了rDFCs成骨向分化.     

Cdk1在HepG2细胞的表达及活性对肝癌细胞凋亡的影响

目的观察Cdk1蛋白表达及其活性对肝癌细胞凋亡的影响。方法克隆Cdk1基因质粒和Cdk1siRNA,并将其转染到肝癌HepG2细胞中,另外应用roscovintine（Cdks的抑制剂）刺激细胞,然后给予紫外线（UV）照射。用Western Blot检测转染的Cdk1蛋白的表达,用核素标记测定其活性;用HO 33342（Hoechst 33342）的免疫荧光染色细胞核判断细胞凋亡的情况。分析Cdk1蛋白表达及活性对肝癌细胞凋亡的影响。结果 Cdk1可以在HepG2良好地表达;Cdk1siRNA可以有效地沉默Cdk1的表达;roscovintine可抑制Cdk1的活性;细胞凋亡率在roscovintine刺激细胞时最高比较Cdk1转染细胞组和Cdk1siRNA转染细胞组（P〈0.01）,在Cdk1转染细胞高于Cdk1siRNA转染细胞组（P〈0.01）和空载体转染细胞组（P〈0.05）,在Cdk1siRNA转染细胞最低。结论过度表达Cdk1可以增加肝癌细胞死亡,抑制肝癌的增殖。抑制Cdk1活性可更有效增加肝癌细胞死亡,抑制肝癌的增殖,可望成为研究和探讨肝癌靶点之一。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的研究化学合成的小干扰RNA（483 siRNA）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483 siRNA转染培养72h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT—PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调（92&#177;5）％,α—SMA染色阳性细胞减少（58&#177;6）％,细胞增殖活性下调（18&#177;5）％,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（53&#177;6）％和（41&#177;7）％;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低（48&#177;5）％和（33&#177;8）％。结论483 siRNA能显著下调原代HSCs CTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

内毒素损伤的肺动脉内皮细胞对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及骨形态发生蛋白-2的干扰作用

目的探讨内毒素休克损伤的肺动脉内皮细胞对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的干扰作用。方法（1）内皮细胞条件培养液（EC—CM）制作：EC—CM1：用不含血清的DMEM培养基孵育融合成单层的肺动脉内皮细胞（PAEC）24h,收集上清培养液制成;EC—CM2：以终浓度为1μg／ml的内毒素孵育融合成单层的PAEC1h后用不含血清的DMEM培养基孵育24h收集上清培养液制成。（2）分组及指标观测：将贴块法培养的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）分成5组,分别用EC-CM1、EC—CM2、EC—CM2＋BMP-2 1ng／ml、EC—CM2＋BMP—2 10ng／ml和EC-CM2＋BMP-2 100ng／ml孵育PASMC。使用BrdU法测定PASMC增殖率;流式细胞仪分析PASMC细胞周期的变化;3^H—TdR掺入实验检测DNA合成情况;RT—PCR检测细胞周期素D1（cyclinD1）mRNA的表达量;免疫印迹检测pSmad蛋白量及细胞周期素（CyclinD1）蛋白表达。结果与Ⅰ组比较,Ⅱ组引起PASMC增殖率升高,S期细胞百分比增加,DNA合成增加（P〈0．01）,同时,cyclinD1mRNA及蛋白表达增加（P〈0．01）,pSmad蛋白量两组差异无统计学意义（P〉0．05）;与Ⅱ组比较,Ⅲ组中上述各指标无明显变化（P〉0．05）,而Ⅳ组、Ⅴ组中PASMC增殖率显著下降,S期细胞百分比下降,DNA合成减少（P〈0．01）,同时cyclinD1mRNA及蛋白表达显著下降（P〈0．01）,pSmad蛋白量显著增加（P〈0．01）。结论EC—CM2诱导PASMC cyclinD1的高表达,促进PASMC增殖;BMP-2可以通过激活Smad1信号转导途径抑制EC—CM2培养的PASMC表达cyclinD1,进而抑制EC—CM2刺激引起的PASMC增殖．BMP2作用在1～100ng／ml浓度范围内呈剂量依赖性。     

B7特异性RNA干扰对皮肤移植的影响

目的探讨RNA干扰技术阻断B7／CD28共刺激信号对小鼠异体皮肤移植排斥反应的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达。在小鼠异体皮肤移植前7d,经静脉将转染B7特异性siRNA的DC输入小鼠体内（DC转染组）,同时设立同种异体移植对照组、同系移植对照组、环孢素A（CsA）治疗组（术后每日皮下注射CsA5mg／kg）和未转染DC组（移植前输注未转染DC）,观察各组移植皮瓣的存活时间和排斥反应情况,并用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应,术后1个月观察迟发性超敏反应情况。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（77.2±6.26）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（73.3±5.42）％。与同种异体移植对照组和未转染DC组比较,DC转染组移植皮瓣成活时间明显延长（P〈0.01）,组织排斥反应程度较轻,混合淋巴细胞反应和DTH反应显著降低（P〈0.01）。结论聊特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,以阻断B7／CD28共刺激通路,抑制小鼠皮肤移植排斥反应,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受提供了新方法。     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的生物学特性

目的 建立表达骨形成蛋白2（BMP2）的人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）并观察其生物学特性。方法 利用脂质体将BMP2噬菌粒表达载体pBK－B2转染至HPDLFs,免疫组化ABC法检测BMP2基因的表达,并检测转染细胞的碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OC）含量和矿化能力。结果 转染BMP2基因后,HPDLFs内有BMP2蛋白的表达,ALP活力、OC含量和矿化结节数量均显著增加。结论 BMP2基因在HPDLFs中得到表达并促进其向成骨样细胞分化。     

白介素12在γδT细胞表达L-选择素中的调控作用

目的观察白介素12（IL-12）对γδT细胞表面L-选择素（CD62L）表达的调控作用。方法人外周血活化γδT细胞经诱导及扩增后,采用Mtb-Ag首次刺激和再次刺激,在细胞分孔培养时分别加入不同的细胞因子（IFN-γ、IL-12＋抗IFN-γ、IL-12＋抗IL-12、IL-12＋IFN-γ）和不同浓度（0、0.1 ng/mL、1 ng/mL）IL-12。收集各组培养第0、3、5、7天的细胞,流式细胞术检测γδT细胞表面CD62L的表达。结果 Mtb-Ag首次刺激和再次刺激后,IL-12组、IL-12＋抗IFN-γ组和IL-12＋IFN-γ组γδT细胞表面CD62L的表达量均较空白对照组显著升高,差异有统计学意义（P〈0.05）;而IFN-γ组、IL-12＋抗IL-12组的CD62L表达量与空白对照组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。随着IL-12浓度的增加,γδT细胞表面CD62L的表达量增加,其中Mtb-Ag首次刺激后第3和5天时,0.1 ng/mL和1.0 ng/mL IL-12组CD62L表达量均明显高于阴性对照组（P〈0.05）,且1.0 ng/mL IL-12组明显高于0.1 ng/mL IL-12组（P〈0.05）,具有浓度依赖性;Mtb-Ag再刺激后CD62L的表达量下调,但在加入IL-12后CD62L表达的下调速度减缓,且1.0 ng/mL IL-12比0.1 ng/mL IL-12更能使CD62L表达维持在相对较高水平（P〈0.05）。结论 IL-12在γδT细胞活化时调控CD62L的表达并且具有浓度依赖性。     

1型1-磷酸鞘氨醇受体的siRNA对人涎腺导管上皮细胞的作用

目的：构建靶向1型1-磷酸鞘氨醇受体（sphingosine 1-phosphate receptor-1, S1P1）基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）慢病毒表达载体,感染干燥综合征细胞模型--人涎腺导管上皮细胞（human salivary gland cells,HSG）,探讨S1P1的siRNA治疗干燥综合征的可能性,为临床靶标治疗提供广阔的思路。方法：实验分空白组、空载体组、scramble-siRNA组及S1P1-siRNA组,分别将pLL3.7空载体、构建成功的scramble-siRNA及S1P1-siRNA慢病毒表达载体与pMD2.G、pMDL g/p RRE、pRSV-REV共转染293T细胞制备病毒,感染HSG细胞株48 h,流式细胞术检测其感染效率,实时荧光定量RT-PCR法检测HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平,细胞免疫组织化学法检测细胞中S1P1蛋白的表达水平,ELISA法检测细胞上清中γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）和白细胞介素（interleukin,IL）-17的表达水平。结果：（1）成功构建scramble-siRNA、S1P1-siRNA慢病毒表达载体,慢病毒的滴度约为3.5×108 TU/mL。（2）感染48 h后S1P1-siRNA组HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平明显低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）S1P1-siRNA组HSG细胞中S1P1蛋白的表达水平低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）S1P1 siRNA组HSG细胞分泌的IL-17的浓度明显降低,与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（5）S1P1-siRNA组细胞上清液中IFN-γ的浓度降低,与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：成功构建了靶向S1P1基因的慢病毒载体,S1P1 siRNA可以使S1P1 mRNA和蛋白表达水平下降,细胞上清液中IL-17和IFN-γ的浓度下降,证明S1P1 siRNA可转染HSG细胞且特异、高效地抑制S1P1基因的表达,抑制细胞上清液中细胞因子的表达,为治疗干燥综合征奠定了实验基础。     

肾损伤因子-1在脂多糖诱导的HK-2细胞炎症反应中的作用

目的：分析肾损伤因子-1（KIM-1）在脂多糖（LPS）诱导HK-2细胞炎症模型中的表达并探讨其可能参与的生物学进程。方法：LPS刺激人肾小管上皮HK-2细胞诱导细胞炎症模型,CCK-8比色法分析LPS对HK-2细胞株体外生长的抑制作用;RT-PCR和Western blot实验分析KIM-1在正常组和LPS诱导组中的表达差异;设计siRNA靶向干扰KIM-1基因的表达,分析其对LPS诱导下HK-2细胞生长抑制作用的影响;Hoechst33342/PI双染法分析LPS诱导下对照组和siRNA干扰组细胞凋亡的影响。结果：50、100 μg/mL终浓度的LPS处理24 h和48 h后能抑制HK-2细胞增殖,与对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）;KIM-1和IL-6基因和蛋白表达水平在LPS处理组中较对照组明显上调,且具有浓度依赖性,差异有统计学意义（P＜0.05）;LPS处理组中Hoechst33342染色阳性细胞比例明显高于对照组;siRNA转染组中KIM-1和IL-6基因和蛋白表达水平均明显低于siRNA-NC组,在LPS作用下siRNA转染组HK-2细胞增殖率明显高于siRNA-NC组,差异有统计学意义（P＜0.05）;在siRNA转染组中,Hoechst33342染色强度均低于siRNA-NC组,提示靶向KIM-1基因siRNA转染可以抑制LPS诱导的细胞凋亡作用。结论：LPS可以诱导HK-2细胞增殖受抑和凋亡,并且上调KIM-1和IL-6基因表达;KIM-1可能通过调节细胞凋亡和生长抑制过程参与细胞炎症反应。     

siRNA干预CTGF和TIMP-1对大鼠肝星状细胞胶原分泌的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor,CTGF)和组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-1)对肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)CTGF和TIMP-1基因表达以及对Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响。方法根据已筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,将化学合成siRNA CTGF和siRNA TIMP-1以脂质体LipofectamineTM2000介导,瞬时转染HSC-T6细胞,分别设siRNA CTGF组、siRNA TIMP-1组、siRNA CTGF和siRNA TIMP-1联合组、脂质体组及非特异性(negative control,NC)siRNA组,抽提转染24、48h细胞mRNA和蛋白,并收集细胞上清液。应用RT-PCR鉴定CTGF和TIMP-1mRNA的表达;Western blot检测其蛋白表达;ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌。结果各干预组转染24、48h后分别与脂质体组和NC siRNA组比较,HSC-T6细胞CTGF及TIMP-1mRNA和蛋白表达均明显下调(均P<0.05),且干预组HSC-T6培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显减少(均P<0.05)。siRNA联合组分别与siRNA CTGF组和siRNA TIMP-1组比较,于转染48hsiRNA联合组较siRNA TIMP-1组抑制率高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量比siRNA TIMP-1组少,且差异具有统计学意义(均P<0.05);而与siRNA CTGF组比较,其CTGF mR-NA和蛋白抑制率增高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量较siRNA联合组减少,但差异无统计学意义(均P>0.05)。结论针对HSC-T6CTGF mRNA基因全长943位点和TIMP-1mRNA 304位点化学合成的siRNA,对靶基因mRNA和蛋白表达有较好的抑制效果,CTGF和TIMP-1沉默可显著减少细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;CTGF和TIMP-1两种基因同时沉默,有增强抗肝纤维化效果的可能。     

EB病毒对脐带血单核细胞来源树突状细胞凋亡的影响

目的观察EB病毒（EBV）感染对新生儿脐带血单核细胞来源的树突状细胞（DC）凋亡的影响。方法用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）（50 ng／mL）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）（10ng／mL）诱导脐带血单核细胞向DC分化,将DC分为3组：①4G组：细胞分离当天单独加入rhGM—CSF和rhIL-4;②4G＋0dEBV组：细胞分离当天同时加入rhGM—CSF、rhIL-4和B95．8细胞上清;③4G＋5dEBV组：细胞分离当天加入rhGM—CSF和rhIL-4,培养至第5天后加入B95．8细胞上清。Annexin V—FITC和PI染色流式细胞术检测DC的凋亡百分比;Western Blot检测X-连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达。结果培养至第6～14天,4G＋0d EBV组DC凋亡百分比明显高于4G组（P〈0．05）;第7～14天,4G＋5d EBV组DC凋亡百分比明显高于4G组（P〈0．05）。EBV在不同感染时间点感染DC,对DC凋亡百分比的影响不同。经EBV感染的DC,XIAP的表达明显降低。结论EBV感染促进了脐带血单核细胞来源DC的凋亡,这种促进作用与DC的分化成熟状态有关。     

半乳糖凝集素3表达抑制对人胃癌MGC-803细胞中Bcl-2和Bax表达的影响及其促凋亡作用

目的：探讨抑制半乳糖凝集素3（galectin-3）的表达对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响,为基因靶向治疗提供潜在靶点。方法：人胃癌MGC-803细胞分为siRNA干扰组、空白对照组和阴性对照组,siRNA干扰组MGC-803细胞转染靶向galectin-3的siRNA,空白对照组MGC-803细胞只加转染试剂,阴性对照组MGC-803细胞转染阴性对照的siRNA。采用流式细胞术和碘化丙啶（PI）染色法检测各组细胞凋亡率和细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组细胞中galectin-3、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果：与阴性对照组和空白对照组比较,siRNA干扰组细胞中galectin-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。PI染色,siRNA干扰组凋亡细胞数量明显增加,凋亡细胞出现细胞核固缩、染色质浓集、新月形和凋亡小体等细胞凋亡特征,阴性对照组仅有少量散在的凋亡细胞。流式细胞术和Western blotting法检测,与阴性对照组和空白对照组比较,siRNA干扰组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bax蛋白表达水平未发生明显变化（P>0.05）。结论：抑制galectin-3表达可促进MGC-803细胞的凋亡,提示galectin-3对胃癌细胞发挥癌基因作用,具有成为靶向治疗靶点的可能性。     

反义Smad3转染阻断TGF-β1信号转导对球囊损伤后大鼠血管内膜增生的影响

目的 通过建立大鼠颈动脉球囊损伤模型并体内转染反义Smad3腺病毒载体,研究阻断TGF-β1/Smad3信号途径对损伤后大鼠颈动脉内膜增生的影响.方法 90只SD大鼠随机分为单纯损伤组(单纯球囊损伤大鼠颈动脉内膜)、干预组(损伤后局部保留灌注反义Smad3腺病毒液)、空白对照组(损伤后局部灌注空载腺病毒液);另取6只同周龄大鼠作为正常对照组(不进行任何处理).各组分别在损伤后第1天、3天、1周、2周、1月、3月时处死大鼠并取材.ELISA法检测单纯损伤组和正常对照组不同时间点血清中TGF-β1的质量浓度;Real-time PCR和HE染色法分别检测三个损伤组在不同时间点Smad3 mRNA表达和血管壁内膜、中膜厚度.结果 单纯损伤组各时间点TGF-β1的质量浓度较正常对照组显著升高(P<0.05).干预组第1天、3天、1周、2周、1月时的Smad3 mRNA表达和第1天、2周、3月时的内膜/中膜比值均较单纯损伤组明显下降(P<0.05);单纯损伤组与空白对照组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 体内转染反义Smad3可以阻断TGF-β1/Smad3信号转导,从而抑制内膜增生.     

CPLX2在30例肝癌组织的表达及其对体外细胞增殖与侵袭的影响

目的 检测人复合素2(CPLX2)在肝癌组织中的表达,探讨其对肝癌细胞增殖与侵袭的影响。 方法 采用RT-qPCR和Western blotting方法检测30例配对肝癌组织和癌旁组织中CPLX2 mRNA和蛋白水平的表达。利用Lipofectamine 2000转染两条CPLX2小分子干扰RNA(siRNA)至肝癌Huh7细胞,RT-qPCR和Western blotting方法验证转染后的干扰效率。细胞实验分4组:空白组、对照siRNA组,CPLX2 siRNA1组和CPLX2 siRNA2组。噻唑蓝(MTT)法和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力。采用成组t检验分析siRNA干扰效果和细胞侵袭能力的差异,双因素方差分析法两两多重比较各组细胞增殖能力的差异。 结果 CPLX2在肝癌组织(22.69±14.78)中的表达高于癌旁组织(4.03±2.65),差异有统计学意义(t=5.941, P<0.001)。CPLX2 mRNA在两siRNA干扰组的表达量分别为0.34±0.02和0.48±0.01,均低于对照siRNA组(0.88±0.02)和空白组(1.00±0.05),差异有统计学意义(P<0.001),mRNA和蛋白水平均显示siRNA干扰效果较好。MTT实验证实CPLX2两siRNA干扰组的细胞增殖能力低于对照siRNA组(P<0.001)和空白组(P<0.001)。Transwell migration实验显示每个检测视野CPLX2 siRNA1组细胞的穿膜细胞数(37.0±2.0)和CPLX2 siRNA2组细胞的穿膜细胞数(46.3±2.5)低于空白组(88.0±2.0)和对照siRNA组(77.0±4.4)。Transwell invasion实验结果显示,每个检测视野CPLX2 siRNA1组细胞的穿膜细胞数(29.7±2.5)和CPLX2 siRNA2组细胞的穿膜细胞数(41.0±2.6)低于与空白组(74.7±3.1)和对照siRNA组(68.7±1.5),差异有统计学意义(P<0.001)。 结论 CPLX2在肝癌组织中表达升高,下调其表达可抑制肝癌细胞Huh7的增殖和侵袭,CPLX2可能在促进肝癌的发生发展过程发挥重要作用。     

Rho／Rock 信号通路在 TGF －β1刺激大鼠颈内动脉平滑肌细胞表型转化中的作用及可能机制

目的：探讨Rho／Rock信号通路在TGF－β1刺激大鼠颈内动脉平滑肌细胞（ ISMC）表型转化中的作用及可能机制。方法 ISMC随机分为两组：空白对照组和TGF－β1刺激组,以不同浓度（1、5、10、20、50 ng／mL） TGF－β1刺激细胞24 h,用荧光实时定量PCR法检测转凝蛋白（ SM22α）和骨桥蛋白（ OPN） mRNA的表达;再以上述得出的最佳TGF－β1浓度刺激细胞,在不同时间（6、12、24、48 h）收集细胞,采用同样方法检测SM22α、OPN mRNA的表达水平;经无血清DMEM高糖培养基静止培养24 h后,随机分为以下各组：空白对照组、TGF－β1（10 ng／mL）刺激组及TGF－β1（10 ng／mL）＋法舒地尔（Fasudil）（10、30、50μmol／L）组,分别采用FQ－RT－PCR法检测SM22α、OPN、RhoA、Rock－1 mRNA的表达;Western blot法检测SM22α、OPN蛋白表达水平;根据实验结果用透射电镜观察各组细胞超微结构的相应变化。结果10 ng／mL TGF－β1刺激大鼠ISMCs 24 h达顶峰。 TGF－β1＋Fasudil组SM22αmRNA和蛋白表达水平较TGF－β1刺激组高（P＜0．01）,且在Fasudil浓度为30μmol／L时达到高峰,随后下降;TGF－β1＋Fasudil组OPN mRNA表达水平较TGF－β1刺激组低,呈浓度依赖性,至30μmol／L达最低（ P＜0．05）,后又呈上升趋势。 Western blot结果显示TGF－β1＋Fasudil组的OPN蛋白表达水平较TGF－β1刺激组低,至Fasudil浓度为30μmol／L达最低（ P＜0．05）。同时FQ－RT－PCR结果显示TGF－β1刺激组的RhoA和Rock－1 mRNA表达水平较空白对照组高（P＜0．01）,在Fasudil浓度为30μmol／L时TGF－β1＋Fasudil组的RhoA和Rock－1mRNA表达水平较TGF－β1刺激组低（ P＜0．05）。电镜下观察各组细胞显示,空白对照组（×20000） ISMC高尔基体肥大,线粒体及粗面内质网正常,10 ng／mL TGF－β1刺激后细胞内线粒体增多,在上述基础上加入30μmol／L Fasudil后电镜下观察细胞又回到正常成熟结构状态。结论10 ng／mL TGF－β1刺激大鼠ISMC 24 h可成功刺激其表型转化,且该过程可能通过Rho／Rock信号通路实现;Rho／Rock信号通路抑制剂Fasudil可增加TGF－β1刺激的SM22α的表达,下调OPN的表达水平,抑制大鼠ISMCs表型转化。     

护场理论指导下的箍围法对皮肤脓肿大鼠血浆高迁移率族蛋白1、脂氧素A4表达的影响

目的观察护场理论指导下的箍围法(红肿消)对皮肤脓肿大鼠血浆内高迁移率族蛋白1(HMGB1)、脂氧素A4(LXA4)表达的影响。方法 40只大鼠,随机分为空白组、模型组、对照组、预治疗组、治疗组。除空白组外,其余4组皮下注射金黄色葡萄球菌1 mL(3~5×10~9CFU/mL)造成皮下脓肿模型。模型组生理盐水换药,对照组莫匹罗星软膏外涂换药,预治疗组在注射细菌后4h用红肿消2 mL换药,治疗组用红肿消2 mL换药,药物范围超过肿胀范围1 cm,换药每日1次。分别于治疗3、7、14、18 d心脏取血2 mL,ELISA法检测血浆内HMGB1、LXA4的表达。结果治疗3 d时,与空白组比较模型组HMGB1含量较低(P0.01);与模型组比较预治疗组、治疗组HMGB1含量较高(P0.01或P0.05)。治疗3 d,与空白组比较,模型组、对照组、治疗组LXA4含量升高(P0.01或P0.05);与模型组比较,预治疗组LXA4含量较低(P0.01)。治疗18 d,对照组与空白组和模型组比较LXA4含量升高(P0.05)。结论早期应用箍围法(红肿消)可提高大鼠血浆内LXA4的表达,主要参与早期炎症抑制作用,同时可能通过缩短炎症反应进程、在治疗早期提前促使HMGB1的释放并抑制中后期HMGB1的释放和(或)阻止HMGB1的促炎活性,从而有效促进护场形成。