大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法 从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITCBSI结合试验）。结果 倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论 改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

一种改良的肺微血管内皮细胞培养方法

目的对目前常用的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法进行改良,以期建立较为容易获取纯化的小鼠PMVECs的方法。方法应用C57小鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养PMVECs,光镜观察细胞形态,Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原免疫细胞化学法鉴定培养的PMVECs,并比较改良培养方法与传统培养方法的优越性。结果体外培养的原代PMVECs在光镜下呈类圆形或短梭形,形成单层后呈铺路石样排列,Ⅷ因子相关抗原和CD31荧光染色阳性,利用改良的培养方法培养的细胞生长较传统方法更加快速,分布更加均匀。结论改良的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,克服细胞生长缓慢、杂细胞容易污染等难题,是一种较为理想的培养方法。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进

目的 改进SD大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法,以获得纯化的大鼠PMVECs。方法 对组织块法培养PMVECs过程中的组织取材、植块贴壁、培养基配制、传代培养进行改进包括:在麻醉前提前注射肝素钠;利用腹腔放血,待大鼠停止呼吸后剪开胸腔;改进操作以及试剂中加入双抗以降低污染率;原代培养48 h即取出组织块;进行再次消化去除成纤维细胞;异硫氰酸标记的植物凝集素（FITC-BSI）鉴定培养的PMVECs。培养后在倒置显微镜下观察细胞形态。结果 原代培养的细胞呈现为多角形或短梭形,呈单层铺路石样排列的典型结构。随着细胞传代或培养条件的改变,细胞形态发生变化,可呈长梭形,漩涡状排列。FITC-BSI结合实验呈绿色荧光,阳性率达到90%以上。结论 通过改进分离及培养方法可获得生长状态良好、纯度高且能够稳定传代培养的PMVECs。     

新生小鼠肺微血管内皮细胞的培养和抗原制备

目的:建立简单有效的新生小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)的培养和抗原制备的方法.方法:用1 wk龄内BALB/c小鼠的肺组织进行PMVEC的原代培养并传代,通过倒置显微镜、免疫组织化学鉴定,并用冻融、煮沸、超声等方法比较制备抗原.结果:体外培养的新生小鼠PMVEC呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的铺路石样排列,并可见管腔形成,获得的血管内皮细胞纯度较高,第Ⅷ因子相关抗原(ⅧF-AS)和CD31表达阳性,成功建立了PMVEC的原代培养方法.通过几种方法比较出超声破碎法制备抗原方法简单浓度高.结论:PMVEC的原代培养方法简便、可靠,保持了血管内皮细胞的结构和功能,且运用超声破碎法获得纯度较高的抗原,为进一步研究PMVEC在抗肿瘤血管治疗中奠定了基础.     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

兔血管内皮细胞的培养及生物学特性

目的 为构建组织工程血管提供种子细胞.方法 兔麻醉取主动脉,采用酶消化法培养血管内皮细胞并传代,倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察和免疫组织化学鉴定.结果 培养出血管内皮细胞并传代,倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态,扫描电镜显示“铺路石”样生长,透射电镜可见内皮细胞特征性W-P小体,免疫组织化学鉴定Ⅷ因子（＋）.结论 兔血管内皮细胞培养成功,本法可为组织工程血管的研究提供细胞来源.     

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长喵线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多Webel—Palade小体,而EA．HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色ImageProPlus6．0软件进行分析EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为（2234．02±78．78）、（4138．80±594．01）。原代HUVECs的染色程度明显较EA．HY926细胞株高,差异有统计学意义（Pd0．01）。EA．HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA．HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的 分离、培养、鉴定大脑皮质微血管内皮细胞(brain microvaseular endothelial cells,BMECs),旨在建立一种可以有效获取较高纯度和产量的BMECs的方法.方法 取出生3～5 dSD大鼠,采用匀浆、二次酶消化、梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于明胶包被的培养板中进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞的形态学特性,细胞免疫荧光化学染色检测血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原的表达,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线.结果 培养6～7 d细胞呈典型的短梭形、多角形和“鹅卵石”样.微血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,纯度达(96.70±1.53)％.细胞在6～8 d达到生长高峰.结论 成功地分离培养出了高纯度的BMECs,为进一步研究BMECs的生物学特性奠定了基础.     

大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养方法研究

目的探讨大鼠心脏微血管内皮细胞的原代培养技术,以获取纯化的大鼠心脏微血管内皮细胞。方法应用体质量80 g的雄性Wistar大鼠左心室的微血管内皮细胞进行原代培养并传代培养;通过倒置显微镜扫描观察其形态,同时对培养细胞采用免疫组织化学荧光染色法进行内皮表面因子(vWF)鉴定,并用Hoechst染色,于荧光倒置显微镜下观察。结果体外培养的大鼠微血管内皮细胞呈梭形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。采用Hoechst染色后,可见90%以上的细胞胞浆和核膜周围被染成红色,细胞核呈蓝色荧光;merge 3染色见细胞胞浆和核膜周围被染成黑色,细胞核呈蓝色;cy-3染色见细胞胞浆和核膜周围被激发出红色光。证明培养细胞为血管内皮细胞。结论通过改进的微血管内皮细胞分离方法培养获得的细胞,生长状态良好、纯度高,且能够稳定地传代培养。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

人腹膜间皮细胞的原代培养及传代

目的探讨建立一种有效的HPMC体外原代培养及传代的方法。方法用0.25%的胰蛋白酶0.02%EDTANa2消化腹部择期手术者大网膜组织,细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养。采用形态学、免疫组织化学（ABC法）、电镜等鉴定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路样鹅卵石状,免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,电镜下可见细胞表面的微绒毛,证明培养的细胞的为HPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简单实用的培养HPMC的方法 。     

大鼠软脑膜间皮细胞的原代培养与鉴定

目的建立一种有效的大鼠软脑膜间皮细胞体外培养方法。方法用机械吹打法和2.5 g.L-1胰蛋白酶轻消化法剥离SD乳鼠软脑膜组织后培养。采用倒置相差显微镜、苏木素-伊红染色、扫描电子显微镜、细胞免疫荧光及免疫细胞化学法鉴定细胞。结果倒置显微镜示细胞融合后呈多边形;苏木素-伊红染色显示细胞呈多角形,胞浆薄染为淡红色;扫描电子显微镜下见细胞有丰富的微绒毛;细胞免疫荧光显示大鼠软脑膜间皮细胞可表达细胞角蛋白;免疫细胞化学法鉴定显示细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性表达,第Ⅷ因子相关抗原及磷酸盐缓冲液空白对照呈阴性。结论机械吹打法和胰蛋白酶轻消化法培养软脑膜间皮细胞的方法切实可行,可为脑膜纤维化及脑积水的形成机制研究提供实验模型。     

牛视网膜毛细血管周细胞的原代培养

目的：建立牛视网膜毛细血管周细胞原代培养的方法。 方法：以酶消化法原代培养牛视网膜毛细血管周细胞,用透射电镜和免疫细胞化学法对细胞 进行鉴定。 结果：培养的周细胞贴壁生长,胞体肥大,呈不规则状、有较多突起。细胞生长缓慢,呈现非接触抑制的重叠状生长。电镜下周细胞核大、不规则、有切迹,可见多个核仁。细胞表面有微绒毛,胞质内有丰富的细胞器,无Ⅷ因子小体;免疫细胞化学显示细胞呈平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性,Ⅷ因子相关抗原阴性。 结论：酶消化法原代培养牛视网膜周细胞是一种稳定、可靠的方法。     

体外定向诱导人胎盘源间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：探讨人胎盘源间充质干细胞（HPMSCS）在特定环境诱导下向内皮细胞分化的潜能，为其促进创伤愈合提供理论依据。方法：在患者知情同意的情况下，从足月分娩产妇娩出的胎盘组织中分离培养HPMSCS，通过倒置显微镜观察其生物学形态，利用流式细胞术检测其表面标志，并通过成骨诱导鉴定及成脂肪诱导鉴定确定其多向分化潜能。对鉴定后的HPMSCS在体外通过内皮细胞诱导液使之向内皮细胞分化，并对诱导后细胞进行细胞化学荧光染色，检测内皮细胞特异性Ⅷ因子（vWF）的表达；采用流式细胞术检测诱导后细胞表面标志，观察是否具有内皮细胞表型。结果：HPMSCS在培养基中持续培养后,形态由成纤维细胞样转变为类似内皮细胞的铺路石样结构。成熟内皮细胞特异的表面标志vWF为阳性表达。流式细胞术检测结果显示：CD31及CD34均有表达。结论：本诱导方案能够诱导HPMSCS出现内皮细胞表型,提示HPMSCS在体外特定条件下具有定向分化为内皮细胞的潜能。     

人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定

目的：寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离及培养方法。方法：在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。结果：改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈＂铺路石＂状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。结论：本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

兔骨髓诱导的内皮细胞和纤维蛋白凝胶体外共培养

目的将兔骨髓诱导的内皮细胞接种于纤维蛋白凝胶内并观察其生长增值情况。方法梯度离心分离兔骨髓单个核细胞（MNCs），直接向内皮细胞诱导培养，传代培养至第2代细胞，倒置显微镜观察细胞形态及生长特点，免疫组化鉴定；以10^5密度接种于纤维蛋白凝胶中培养并定期观察细胞生长情况，单纯细胞及胶原内的细胞分别用MTT法检测其生长并绘制生长曲线，胶原切片并作苏木精．伊红染色观察细胞在胶原内的生长。结果诱导的内皮细胞为铺路石样。呈单层生长，第2代细胞CD31、八因子相关抗原免疫组化均为阳性，摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性；细胞在纤维蛋白凝胶内成立体生长，细胞在纤维蛋白凝胶内3d后成梭形铺开，6d后自发形成管腔样结构；细胞在纤维蛋白凝胶内生长曲线成“s”形。结论骨髓诱导的内皮细胞在纤维蛋白凝胶内生长增值良好，纤维蛋白凝胶可以作为接种骨髓诱导的内皮细胞的基质材料。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。