人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响及其与紫杉醇耐药关系实验研究

目的:探究自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响,并分析其与紫杉醇耐药的关系.方法:以人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TXA作为研究对象,构建自噬基因Beclin1真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,并通过试剂盒将其转染至SKOV3细胞中.采用MTT实验测定各组细胞...     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

稳定表达趋化因子受体CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定

目的:构建人CXCR4真核表达重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,建立稳定转染细胞系并观察其表达效果.方法:从人卵巢癌组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CXCR4的基因编码序列,将序列定向克隆至真核表达载体pReceiver-M02,经酶切和测序鉴定后用脂质体介导的转染技术将质粒pReceiver-M02-CXCR4导入不表达CXCR4蛋白的SKOV3细胞,经G418抗性筛选得到阳性细胞克隆并扩大培养成系.分别采用RT-PCR,Western blot和免疫细胞化学方法检测稳定转染细胞株CXCR4 mRNA和蛋白的表达.结果:得到了抗G418阳性细胞克隆;RT-PCR的产物约为304 bp;Western blot可见一清晰的蛋白条带,与CXCR4的蛋白分子质量相符合.免疫细胞化学结果显示,转染质粒的SKOV3细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒.结论:成功建市稳定表达趋化因子受体CXCR4的卵巢癌细胞株,为CXCR4在卵巢癌中的研究工作提供依据及平台.     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.     

重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立

目的构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。     

自噬基因Beclin 1在SKOV3细胞中的表达及其调控相关信号传导途径的研究

目的探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达后自噬相关信号调控通路PI3K/PKB途径中ClassⅠPI3K（p110α）、p-PKB和ClassⅢPI3K（hvps34）的表达变化以及对肿瘤细胞的自噬活性的影响.方法将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞;分别用荧光定量RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平检测用流式细胞仪检测Beclin1、p110α、hvps34和p-PKB的表达;在电镜和荧光显微镜下观察自噬现象,用流式细胞仪检肿瘤细胞自噬情况.结果 pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞Beclin1表达在mRNA和蛋白质水平明显高于转染空质粒pcDNA3.1和未转染细胞;PcDNA3.1/Beclin1转染后hvps34表达上调,而p110α、p-PKB的表达下调.PcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在在电镜下可见大量自噬囊泡形成.在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC阳性细胞明显增加.流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%.结论自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可使ClassⅢPI3K（hvps34）表达上调,ClassⅠPI3K（p110α）及其下游的p-PKB表达下调,诱导肿瘤细胞自噬活性增加,抑制SKOV3在体外的增殖.     

miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响

目的构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响。方法克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3．1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3．1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响。结果重组质粒pcDNA3．1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍。MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72h抑制率最高,达38．63％。结论成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3．1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应。为进-步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础。     

核基质蛋白SAFB真核表达载体的构建及其鉴定

目的构建人SAFB基因真核表达载体,为SAFB基因功能研究提供研究基础。方法设计人SAFB特异性引物,提取人正常结直肠上皮组织总RNA,应用RT-PCR方法提取人SAFBcDNA,通过双酶切及测序鉴定,将SAFB克隆至pcDNA3.1（-）,构建人SAFB基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/SAFB,转染SW480细胞,用WesternBlot技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增人SAFB全长cDNA,双酶切鉴定和测序结果证实成功构建pcDNA3.1（-）/SAFB真核表达载体,转染细胞后,可检测出分子量约为140KD的目的蛋白。结论获得人SAFB基因全长cDNA并成功构建了SAFB真核表达载体,证实pcDNA3.1（-）/SAFB转染SW480细胞后可表达SAFB蛋白,为深入研究SAFB基因在肿瘤发生发展中的作用提供了基础。     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

CCNL1真核表达载体的构建及其在MDA-MB-231细胞中表达的鉴定

目的:构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAX Ⅰ -CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1三组重组载体,鉴定其在MDA-MB-231细胞中的表达情况.方法:用PCR方法扩增得到CCNL-1基因,然后用EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切CCNL1基因,将其分别与pcDNA3.1(+)、pVAX Ⅰ和pEGFP-C1...     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。