人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

人CMV／ARL-1真核表达载体的构建

目的 构建人CMV／ARL-1真核表达栽体，为进一步建立转ARL-1基因Hep-G2单克隆细胞系奠定基础。方法 采用限制性内切酶技术，酶切真核骨架质粒pBK／CMV及另一质粒pBK／ARL-1(内含ARL-1cDNA全长)，用TONA连结酶将目的基因连至骨架质粒上，酶切及序列分析的方法鉴定重组质粒。结果 经Eco RⅠ、NcoⅠ、UindⅢ酶切鉴定和序列分析，证明ARL-1基因已插入到pBK／CMV真核表达载体上。结论 成功地构建了CHV／ARL-1真核表达载体．     

Rab25基因siRNA表达载体的构建鉴定及在人卵巢癌细胞A2780中的表达

目的为研究Rab25基因的功能及卵巢癌的基因治疗,构建针对Rab25基因的siRNA表达载体,转染细胞A2780后观察其对Rab25基因表达的抑制作用,为探索卵巢癌基因治疗的新途径打好基础。方法根据基因库上的Rab25mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSUPER质粒中,并对重组质粒(命名为pSUPER/Rab25siRNA)进行酶切及序列鉴定,后转染卵巢癌细胞A2780,RT-PCR检测转染前后Rab25的表达情况。结果双酶切证实Rab25siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。RT-PCR检测显示转染卵巢癌细胞A2780后有效抑制了Rab25基因的表达。结论成功构建Rab25siRNA表达载体,为卵巢癌基因治疗开辟新途径。     

mBMP-4真核表达载体的构建及表达

0　引言　骨形态发生蛋白 - 4(BMP- 4)具有诱导成骨潜能细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化并形成新骨的能力 .随着基因转染技术的应用 ,将外源基因转入靶细胞内 ,通过靶细胞表达外源基因而发挥作用成为可能 .本研究的目的是通过基因克隆和 DNA重组技术构建可在真核细胞内表达的 BMP- 4表达载体 ,并观测外源基因在细胞内表达的情况 ,为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础 .1　材料和方法1.1　试剂　质粒 pc DNA3和 p SPT- 18- m BMP- 4均由吕振华博士馈赠 ,Eco R I和 H ind III,T4DNA连接酶、…     

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

目的构建含有标签蛋白的人环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)的真核表达载体,并观测其在293T细胞中的表达。方法使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树;应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达,并将其克隆到pEASY-Blunt载体中,酶切测序鉴定正确后,再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中,酶切鉴定正确后转染293T细胞,Western-blotting测其表达。结果重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确,将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达。结论携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功,为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础。     

大鼠EAAT3真核表达载体的构建及在Hella细胞中的表达

目的:克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3(EAAT3)的cDNA,构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法:从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ). 经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中,通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.     

ING4基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 分离小鼠ING4(inhibitor of growth family，member 4)基因并构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4。方法 从小鼠肝组织中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出ING4cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4，分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定。结果 RT-PCR产物为约750bp的条带，构建的真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现750bp大小的条带，基因测序正确。结论 分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4。     

大鼠pEGFP-C3／BMP-2真核表达载体的构建

目的通过克隆大鼠的BMP2基因,构建EGFP—C3／BMP2基因的真核细胞表达载体。方法把大鼠的基因组DNA通过PCR获得BMP2,克隆构建载体pEGFP／C3－BMP2,并将其转化到大肠杆菌里面,最后进行重组真核表达载体pEGFP—C3-BMP2的构建和鉴定,并可观察其在真核细胞中的表达。结果以大鼠总DNA为模板扩增出1200bp左右的特异性条带,测序结果与Gene—Bank测序结果相比,翻译成的氨基酸序列相同并完全一致．并可在真核细胞中表达。对重组质粒pEGFP—C3／BMP2进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论为进一步研究利用BMP2基因修饰骨组织工程骨,促进骨折愈合再生提供实验基础。     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

人透明带蛋白3真核表达载体的构建

目的 构建人ZP3蛋白(从第23位到348位氨基酸)真核表达载体,用于在毕赤酵母中表达重组人ZP3蛋白.方法 通过PCR方法扩增编码人ZP3蛋白的基因,并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ构建真核表达质粒pPICZα-hZP3.结果 经PCR扩增获得的hZP3基因大小为978 bp,其DNA测序结果分析表明:pPIC...     

细胞免疫荧光检测人胰腺癌干细胞Oct4､Nanog基因的表达

目的:研究胚胎干细胞相关基因Oct4和Nanog在人胰腺癌肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞中表达的差异?方法:用流式细胞仪在人胰腺癌Panc-1细胞系中分选肿瘤干细胞,细胞免疫荧光法检测2种肿瘤干细胞和Panc-1细胞中Oct4?Nanog基因的表达情况?结果:Oct4及Nanog基因在2种分选出的细胞中表达均高于未分选细胞?结论:干细胞相关基因Oct4?Nanog在胰腺癌Panc-1肿瘤干细胞中的表达高于普通胰腺癌细胞?     

CXCR4-siRNA重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达的研究

目的:研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响.方法:Pac Ⅰ酶切CXCR4-siRNA重组腺病毒载体使其线性化,应用HEK293细胞大量包装扩增病毒,收集病毒液,转染人卵巢癌细胞株SKOV3.细胞分为3组:siRNA组,转染空病毒载体的阴性对照组,细胞不做任何处理的空白对照组.通过PCR、Western blot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果.结果:包装扩增后病毒滴度为6×108 PFU/ml,荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达,重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达.结论:CXCR4-siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达,为RNA干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础.     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因Oct4 的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4,并使其在大肠杆菌中表达.方法:取4～6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜,利用RT-PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA,并插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成 pGEX5T-Oct4重组质粒.β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导使该基因在k802菌中表达.结果:用PCR方法扩增获得大小约1.1 kb条带;全自动测序与GenBank中登录的序列97％同源.获得了pGEX5T-Oct4 重组子并在k802菌中获得了表达,SDS-PAGE分析有一特异性的62 000条带.结论:扩增和克隆了人胚生殖系细胞多能性调节蛋白Oct4 全长cDNA并在大肠杆菌中获得表达,为进一步研究人胚生殖系细胞多能性调节与分化奠定了基础.     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

人PDLIM4基因启动子报告基因载体的构建及其在人类肿瘤细胞中的表达

目的构建人PDLIM4基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-promoter,检测其在不同肿瘤细胞中的表达。方法据Genebank中人PDLIM4基因启动子序列分别设计上下游引物,扩增其启动子片段,并插入到pGL3-Basic报告基因载体,分别得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因启动子的两个报告基因质粒pGL3-PD-LIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。序列为1.2kb的启动子利用Erase-a-base试剂盒,经外切酶Ⅲ从5’端逐步酶切得到5个含不同长度启动子序列的报告基因载体:pGL3-PDLIM4-1.2D1、pGL3-PDLIM4-1.2D2、pGL3-PDLIM4-1.2D3、pGL3-PDLIM4-1.2D4、pGL3-PDLIM4-1.2D5。将构建的报告基因载体分别瞬时转染以下细胞株:Hela、MDA-MB231、KB、PC-3、LNCaP,检测其荧光素酶表达活性。结果所构建质粒经酶切、测序鉴定,其片段长度及序列均正确。转染结果显示,长片段的3kb和1.2kb启动子序列在所测试的细胞株中均有表达,但在人激素非依赖前列腺癌PC-3细胞株、人激素依赖前列腺癌LINCaP细胞株中表达较低。而不同长度的启动子报告基因质粒转染PC-3、LNCaP的结果显示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表达活性最强,pGL3-PDLIM4-970bp表达活性最弱。结论成功构建了7个分别含有不同长度的PDLIM4启动子报告基因载体,其在不同的肿瘤细胞株中均有不同程度的表达,而在前列腺癌细胞中表达较低。     

趋化因子受体CXCR4反义RNA重组表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的:构建趋化因子受体CXCR4反义 RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究.方法:用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中获得目的基因,并以正、反两个方向定向插入到逆转录病毒载体pLXSN.重组载体用脂质体转染剂 (lipofectAMINE)转染PA317包装细胞,抗G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR(fluorogenic-quantitative PCR,FQ-PCR)测定假病毒滴度,进一步感染NIH/3T3 细胞. 结果: CXCR4正、反义RNA 的真核表达载体,经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞,目的基因在该细胞中得到整合与表达.结论:从PBMCs中获得的目的基因通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达,为进一步研究CXCR4反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础.     

FGFR3真核表达载体的构建及其在人白血病细胞系K562中的表达

目的：构建成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN,并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系K562中的表达。方法:通过PCR法获得FGFR3全长基因（fgfr3-WT）和截短失活型的FGFR3（fgfr3-DN）,经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接,构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中,经puromycin抗性筛选后,Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。结果：PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒,2个质粒分别扩增出2　400 bp的fgfr3-WT全长基因片段和1　200 bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1　200 bp的fgfr3-DN基因;双酶切MS
CV/puro-fgfr3-WT重组质粒,获得2　400 bp的目的基因片段;测序显示,fgfr3-WT片段大小为2　400 bp,Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致,表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体;Western blotting 检测,与对照组（K562-MSCV）比较,MSCV/puro-fgfr3-WT转染组（K562-WT）FGFR3蛋白表达水平增加,表达水平是对照组的10倍以上;MSCV/puro-fgfr3-DN转染组（K562-DN）的截短型的FGFR3（K562-DN）高表达,而对照组和K562-WT转染组则无此片段;流式细胞术检测,K562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3,K562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。结论：成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系K562。     

人视网膜母细胞瘤蛋白真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

目的构建人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma 1,RB-1)基因真核表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法采用PCR方法扩增RB-1基因编码区的全长序列,并加上FLAG标签,利用分子克隆技术将其重组于CMV载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western Blot检测其表达,用免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果克隆的RB-1真核表达载体完全正确,Western Blot检测到RB-1有表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞核内。结论成功地构建了RB-1真核表达载体,其能够在PC-3中高效表达,并主要定位于细胞核内。